採用標籤蛋白人源化嵌合抗體作為陽性對照物的間接免疫檢測方法及試劑盒的製作方法
2023-04-27 01:37:06 1
專利名稱：採用標籤蛋白人源化嵌合抗體作為陽性對照物的間接免疫檢測方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及診斷試劑的製備，特別是以標籤蛋白人源化嵌合抗體作為通用診斷試劑的陽性對照的應用。
背景技術：
應用間接法免疫技術，如間接酶聯免疫法、化學發光法等測定樣品中抗體的濃度是常用的檢測方法，該方法的原理是在固相載體上包被抗原蛋白，加入待測樣品，待測樣品中的抗體與包被抗原反應，再加入酶標記的二抗，即可檢測樣品中是否有與抗原結合的抗體。在此類試驗中，必須設立陽性對照孔，陽性對照多用臨床病人的血清或其他形式的人血清。但人源性血製品，很可能含有致病性傳染物質，對操作者存在潛在的威脅，同時在配製陽性對照過程中需要大量血清或血漿，而有些病的血清或血漿又比較難得到。因此應用人源血液作為陽性對照，對於製備大量檢測試劑盒產品而言，原料受到客觀的限制。所以尋求一種陽性對照替代品，應用於間接法檢測抗體類的試劑盒成為大家共同的意願。蛋白標籤的用途，截至目前，主要是用於對表達蛋白進行鑑定與純化。即通過基因工程的方式，在目標蛋白上加上標籤序列，在表達純化出的蛋白上就會帶上標籤蛋白序列，常用的標籤蛋白有Flag、His、GST、GFP、myc、HA等，其中HIS和GST是最常用的純化標籤分子。His標籤是由6個組氨酸(His-His-His-His-His-His)組成的短肽，專門設計用於重組蛋白質的吸附純化。其分子量較小，並且較容易分離和純化，His融合標籤與其它標籤相比有很多明顯優勢，是目前用於純化的融合標籤中使用最為廣泛的一種。利用His標籤可以建立基於融合蛋白的高效檢測和純化系統。而His抗體一般用於檢測和His標籤融合表達蛋白的表達、細胞內定位，以及純化、定性或定量檢測His融合表達蛋白等。GST標籤體系具有蛋白表達產率高、表達產物純化方便，以及利於GST抗體製備等特點。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可從細菌裂解液中提取，在不變性的條件下通過親和層析得到。GST融合蛋白可被位點特異性蛋白酶裂解從而除去GST蛋白。融合蛋白也是一個非常好的強免疫原，因此，很容易製備抗新蛋白的抗體。正是由於以上的優點，商品化的GST融合蛋白表達體系以及GST標籤抗體系統至今仍被廣泛應用。如上所述，由於標籤蛋白在蛋白表達及純化中的巨大作用，標籤蛋白被廣泛的應用在診斷試劑中，如用於肝炎類、愛滋、梅毒等常見重要傳染病及部分癌症疾病的診斷抗原都帶有His標籤或GST標籤。人源化抗體是指抗體的恆定區部分(即CH和CL區)或全部由人類抗體基因所編碼。由於人源化抗體可以大大減少異源抗體對人類機體造成的免疫副反應，因此目前主要用作治療性抗體。是利用DNA重組技術，將異源(動物源)單抗的輕、重鏈可變區基因插入含有人抗體恆定區的表達載體中，轉化哺乳動物細胞表達出嵌合抗體，這樣表達的抗體分子中輕重鏈的可變區V區是異源的，而恆定區C區是人源的，整個抗體分子中近2/3部分都是人源的。將標籤蛋白人源化嵌合抗體用作間接免疫檢測反應的陽性對照物，到目前未見到報導。而以下本發明將其用作間接免疫檢測反應的陽性對照物，並提供相應的反應檢測試劑盒，並通過對比試驗證明這一新的用途所帶來的積極意義和優越效果。
發明內容
本發明提供了標籤蛋白人源化嵌合抗體的一種新用途，以及由此產生的免疫檢測試劑盒。本發明的技術方案如下一種採用標籤蛋白人源化嵌合抗體作為陽性對照物的間接免疫檢測方法，其步驟如下(I)針對要檢測的靶標抗體，製備用於反應的包被有重組目標抗原的固相載體， (2)製備陽性對照，(3)在所述固相載體上進行間接免疫檢測反應；其特徵在於所述重組目標抗原指人工重組的帶標籤蛋白的目標抗原物，所述重組目標抗原中的目標抗原指能與所述靶標抗體特異性結合的抗原物；所述陽性對照物採用抗重組目標抗原中的標籤蛋白的人源化嵌合抗體，所述人源化嵌合抗體是指抗體Fe端由人的抗體基因編碼，抗體Fab端則由小鼠抗體的基因編碼，即將標籤蛋白的單克隆抗體的輕、重鏈可變區基因插入到含有人源抗體恆定區基因的表達載體中，轉入動物細胞中表達得到的標籤蛋白的人源化嵌合抗體。所述標籤蛋白的單克隆抗體指Flag、His、GST、GFP、myc或HA的單克隆抗體。所述標籤蛋白人源化嵌合抗體指His人源化嵌合抗體或GST人源化嵌合抗體。所述陽性對照物溶於陽性對照稀釋液中。還包括用於承載檢測反應的固相載體和陽性對照物，其特徵在於所述固相載體上包被有重組目標抗原， 所述重組目標抗原指人工重組的帶標籤蛋白的目標抗原物；所述陽性對照物指抗重組目標抗原物中所帶標籤蛋白的人源化嵌合抗體，所述人源化嵌合抗體是指將標籤蛋白的單克隆抗體的輕、重鏈可變區基因插入到含有人源抗體恆定區基因的表達載體中，轉入動物細胞中表達得到的標籤蛋白人源化嵌合抗體。所述標籤蛋白的單克隆抗體指Flag、His、GST、GFP、myc或HA的單克隆抗體。所述標籤蛋白人源化嵌合抗體指His人源化嵌合抗體或GST人源化嵌合抗體。所述陽性對照物溶於陽性對照稀釋液中，所述陽性對照稀釋液的配方為每IOOOml 溶液中含 NaH2PO4 2H20 0. 28g, Na2HPO4 12H20 3. 08g, NaCl 8. 78g，牛血清白蛋白
5 20g Proclin3000. 5mL, Tween20 0. 5mL,溶劑為純化水。所述陽性對照物溶於陽性對照稀釋液中，所述陽性對照稀釋液的配方為每IOOOml 溶液中含 NaH2PO4 2H20 0. 28g, Na2HPO4 12H20 3. 08g, NaCl 8. 78g，牛血清白蛋白IOg Proclin3000. 5mL, Tween20 0. 5mL，溶劑為純化水。固相載體上包被重組目標抗原所用的封閉液為每IOOOml溶液中含有NaH2PO4 2H200. 60g, Na2HPO4 12H20 5. 80g，牛血清白蛋白 BSA 5 20g, Proclin300 ImL,溶劑為純化水。
本發明提供一種新的間接免疫檢測方法，該方法的創新點在於針對所要檢測的靶標抗體一例如患者血清中的針對某一目標抗原(例如C肝病毒HCV)的抗體，以該目標抗原作為藍本製備帶有標籤蛋白的重組目標抗原，以其作為固相載體上的包被物，同時以重組目標抗原所帶的標籤蛋白的人源化嵌合抗體作為陽性對照物。檢測中，人源化嵌合抗體的可變區部分能夠與包被抗原(重組目標抗原)的標籤蛋白識別結合，其恆定區同時能與酶標記的抗人二抗結合，因此可以代替陽性血清樣本。本發明提供的間接免疫檢測方法，一方面，能夠有效解決檢測操作者所面臨的健康風險。另一方面，由於無需收集陽性血清樣本，使間接免疫檢測方法及相應的試劑盒的使用或製造成本降低，更易於推廣和使用。本發明還提供了相應的試劑盒。本發明的方法和試劑盒中涉及的標籤蛋白，如帶標籤蛋白的重組目標抗原、標籤蛋白人源化嵌合抗體中所指的標籤蛋白可以是目前常用的Iag、Hi s、GST、GFP、myc或HA，這些標籤蛋白在現有技術中的用途如背景技術部分所述，主要是用於蛋白表達及純化。而且人體不會產生對這些標籤蛋白的抗體，因此，帶有這些標籤蛋白的重組目標抗原用作包被物，不會產生交叉反應。本發明中提到的術語「重組目標抗原」的解釋如下導致人體或動物體產生靶標抗體(間接免疫檢測反應中所檢測的)的天然物質叫做天然目標抗原，例如各種病原微生物細胞外的種或屬或菌株特異擁有的蛋白、或其它物質、或該微生物本身，它們的共同點在於，它們作用(接種或傳染)於人體、動物體之後能夠導致宿主產生專門識別它們的抗體。本發明中，固相載體上的包被物是以這些天然目標抗原為藍本人工製備的帶標籤蛋白的重組目標抗原，重組目標抗原和天然目標抗原具有相同的識別位點，從而能夠被靶標抗體所識別。上述提到的人工製備該重組目標抗原，採用現有技術即可。現有技術中用於間接免疫法的包被抗原蛋白基本都是人工重組表達而得，在製備過程中，為了便於純化，在表達載體中都插入有標籤蛋白基因，因此表達出來的抗原蛋白本身即帶有標籤蛋白段，抗原蛋白作為包被物時，有些是採用蛋白酶將標籤蛋白水解掉的，有些未經水解直接採用，例如本發明採用的北京萬域美瀾科技有限公司的C肝病毒HCV重組抗原，本身就含有HIS標籤或GST標籤)。而本發明中所用包被抗原，採用未經蛋白酶水解的重組抗原蛋白即可。針對包被的重組抗原蛋白上所帶的標籤蛋白，製備相應的標籤蛋白人源化嵌合抗體作物陽性對照物，即可實現本發明的技術效果。本發明還提供了具體優選的用於上述方法的陽性對照物稀釋液及包被固相載體所用的封閉液配方。如上所述，本發明提供的方法及試劑盒，並不限於用於檢測哪種疾病的血清，根據本發明的提供的思路和實施例提供的試驗方法，本領域技術人員可以直觀地得出只要是採用標籤蛋白人源化嵌合抗體作為陽性對照，檢測用的固相載體上包被的抗原蛋白為帶標籤蛋白的重組抗原蛋白，即屬於本發明的要求保護的範圍。
具體實施例方式以下通過具體試驗說明本發明的操作及效果。試劑陽性對照稀釋液的配方為NaH2PO4 2ItO0. 28g
XaJfPO4 * 12Ha03. 08g
XaCl8.78g
I1IflLSHrIUiTi BSA5 20g
I* roc I In 3000. 5mL
Tweun200.5mL
純化水定容至IOOOmL包被緩衝液的配方為Na2CO31. 59gNaHCO3 2. 93g純化水定容至IOOOmL封閉液的配方為
NaH2PO4 2HS00.60g
XaJIPO1 121M)5. 80g
牛血清I1丨蛋閂BSA5 20gFroc Ii n300ImL
純化水定_ IOOOmL酶稀釋液的配方為
Xaiy5O4 21LO0. 60g
NaJlf5O4 12IW)5. 80g
MaCl9g
Tween—20I 4nL
I -血沽 Cl 蛋 Cl BSA5~20g
ProclinSOOImL
純化水定容個:1OOOmL人源化抗標籤抗體人源化抗HIS標籤抗體和抗GST標籤抗體(University of California實驗室提供，也可商購自諾華維柯生物技術股份有限公司)，即抗體的Fe端的基因來源於人，但是Fab端(識別抗原的)則來自小鼠。HRP-羊抗人 IgG:外購HRP-羊抗人IgG (杭州安華生物技術有限公司)。用酶稀釋液將HRP-羊抗人IgG按照1:10000稀釋、混勻。實施例I應用人源化抗GST標籤抗體製備陽性對照
A、陽性對照的製備陽性對照稀釋液的製備含0. 5% 2%(W/V)牛血清白蛋白(BSA)的20mM pH7. 2(7. 0 7. 6均可使用 )的磷酸緩衝液。置於2 8°C保存,備用。陽性對照的製備將人源化的抗GST標籤抗體用陽性對照稀釋液在1:500 1:4000之間進行倍比稀釋。B、包被板的製備包被緩衝液的配製50mM pH9. 6的碳酸緩衝液為包被緩衝液。置於2 8°C保存，備用。封閉液的配製含0. 5% 2%(W/V)BSA的20mM pH7. 2 (7. 0 7. 6均可使用)的
磷酸緩衝液。置於2 8°C保存，備用。包被板的製備採用北京萬域美瀾科技有限公司的C肝病毒HCV重組抗原(含有GST標籤)用包被緩衝液1:10000稀釋，混合製成包被液，按100 u I/孔的量加入微孔板中，4°C過夜。甩掉包被液，在吸水紙上拍幹。再按120 yl/孔的量加入封閉液於微孔板中，4°C過夜。甩掉封閉液，在吸水紙上拍幹。室溫除溼乾燥24小時後立即進行封袋。置於2-8°C保存，備用。試劑最佳配製濃度的選擇將人源化抗GST標籤抗體用含1% (ff/V)BSA的陽性對照緩衝液)按1:500稀釋，重複三孔，選擇封閉液及酶稀釋液的最佳配比。表I封閉液最佳配製濃度的選擇
權利要求
1.一種採用標籤蛋白人源化嵌合抗體作為陽性對照物的間接免疫檢測方法，其步驟如下 (1)針對要檢測的靶標抗體，製備用於反應的包被有重組目標抗原的固相載體， (2)製備陽性對照， (3)在所述固相載體上進行間接免疫檢測反應； 其特徵在於所述重組目標抗原指人工重組的帶標籤蛋白的目標抗原物，所述重組目標抗原中的目標抗原指能與所述靶標抗體特異性結合的抗原物； 所述陽性對照物採用抗重組目標抗原中的標籤蛋白的人源化嵌合抗體， 所述人源化嵌合抗體是指抗體Fe端由人的抗體基因編碼，抗體Fab端則由小鼠抗體的基因編碼，即將標籤蛋白的單克隆抗體的輕、重鏈可變區基因插入到含有人源抗體恆定區基因的表達載體中，轉入動物細胞中表達得到的標籤蛋白的人源化嵌合抗體。
2.根據權利要求I所述的間接免疫檢測方法，所述標籤蛋白的單克隆抗體指Flag、His、GST、GFP, myc或HA的單克隆抗體。
3.根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述標籤蛋白人源化嵌合抗體指His人源化嵌合抗體或GST人源化嵌合抗體。
4.根據權利要求廣3任一所述的間接免疫檢測方法，其特徵在於所述陽性對照物溶於陽性對照稀釋液中。
5.用於權利要求r4任一所述間接免疫檢測方法的試劑盒，包括用於承載檢測反應的固相載體和陽性對照物，其特徵在於 所述固相載體上包被有重組目標抗原， 所述重組目標抗原指人工重組的帶標籤蛋白的目標抗原物； 所述陽性對照物指抗重組目標抗原物中所帶標籤蛋白的人源化嵌合抗體， 所述人源化嵌合抗體是指將標籤蛋白的單克隆抗體的輕、重鏈可變區基因插入到含有人源抗體恆定區基因的表達載體中，轉入動物細胞中表達得到的標籤蛋白人源化嵌合抗體。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，所述標籤蛋白的單克隆抗體指Flag、His、GST、GFP、myc或HA的單克隆抗體。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，所述標籤蛋白人源化嵌合抗體指His人源化嵌合抗體或GST人源化嵌合抗體。
8.根據權利要求5 7任一所述的試劑盒，其特徵在於，所述陽性對照物溶於陽性對照稀釋液中，所述陽性對照稀釋液的配方為每IOOOml溶液中含NaH2PO4 2H20 0. 28g， Na2HPO4 12H20 3. 08g, NaCl 8. 78g,牛血清白蛋白 5 20g Proclin300 0. 5mL,Tween20 0.5mL，溶劑為純化水。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特徵在於，所述陽性對照物溶於陽性對照稀釋液中，所述陽性對照稀釋液的配方為每IOOOml溶液中含NaH2PO4 2H20 0. 28g，Na2HPO4 12H203. 08g, NaCl 8. 78g，牛血清白蛋白 IOg Proclin300 0. 5mL, Tween20 0. 5mL,溶劑為純化水。
10.根據權利要求8任一所述的試劑盒，其特徵在於，固相載體上包被重組目標抗原所用的封閉液為每IOOOml溶液中含有NaH2PO4 2H20 0. 60g, Na2HPO4 12H20 5. 80g，牛血清白蛋白B SA 5 20g，Proclin300 lmL，溶劑為純化水。
全文摘要
本發明「採用標籤蛋白人源化嵌合抗體作為陽性對照物的間接免疫檢測方法及試劑盒」，屬於醫學檢測領域。其步驟如下(1)製備用於反應的固相載體，固相載體上包被有重組目標抗原，(2)製備陽性對照，(3)在所述固相載體上進行間接免疫檢測反應；所述重組目標抗原指人工重組的帶標籤蛋白的目標抗原物；所述陽性對照物指抗重組目標抗原物中所帶標籤蛋白的人源化嵌合抗體。本發明的技術，一方面，能夠有效解決檢測操作者所面臨的健康風險。另一方面，由於無需收集陽性血清樣本，使間接免疫檢測方法及相應的試劑盒的使用或製造成本降低，更易於推廣和使用。
文檔編號G01N33/543GK102981002SQ201210500268
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者任超, 李全, 焦守恕 申請人:同昕生物技術(北京)有限公司