阿斯巴甜生物合成的方法
2023-04-27 01:17:31 1
專利名稱：阿斯巴甜生物合成的方法
技術領域：
本發明涉及一種甜味劑的合成方法，特別是阿斯巴甜生物合成的一種新方法。
背景技術：
阿斯巴甜是一種新型高效的甜味劑，其甜度約為蔗糖的200倍，熱量僅為蔗糖的1/200。常食不產生齲齒，不影響血糖，不引起肥胖、高血壓、冠心病。聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)對其的評價為安全可靠，並被聯合國食品添加劑聯席委員會(JECFA)確定為國際A(I)級甜味劑。目前該甜味劑已在130多個國家和地區獲準使用，廣泛用於9000多種飲料、食品及醫藥等產品中。至今自然界中尚未發現天然的阿斯巴甜，其生產均採用人工合成法，合成方法大體可分為兩種化學合成法和生物合成法。目前阿斯巴甜的工業化生產國內外大部分是通過化學法合成的。它是以L-天門冬氨酸與L-苯丙氨酸為主要原料，通過氨基保護、內酐、縮合、水解、酯化、中和等反應步驟來合成。而各種化學合成法區別在於L-天門冬氨酸中氨基的保護基團不同；甲酯化次序不同等。化學合成法反應步驟多、產率低、反應選擇性差、產物需要多步分離等不足；因此，生物酶法合成相對化學合成法專一性強、反應轉化率高、條件溫和而成為一些科研工作者研究的重點，特別是通過一步酶法以天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯為反應底物通過菌種篩選直接合成阿斯巴甜的研究已被許多科研工作者所注意。
經過檢索，我們查到公開文獻有關合成阿斯巴甜的報導如下題名阿斯巴甜的生物合成作者林應銳刊名微生物學通報。1992，19(4).-226-229文摘通常化學合成包括五步。1.將天冬氨酸的氨基保護起來，並製成酸酐。2，苯丙氨酸酯化成苯丙氨酸甲酯。3.將帶保護基的天冬氨酸酐和苯丙氨酸甲酯縮合成帶保護基的阿斯巴甜(無甜昧)。4.脫除保護基製得阿斯巴甜的鹽。5，中和析出阿斯巴甜除去-APM雜質。目前文獻介紹有少量非合成肽鍵的酶反應研究工作。如利用枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)，有選擇的只催化酯化天冬氨醯苯丙氨酸中苯丙氨酸上的羧基成為甲酯，生成阿斯巴甜。在有機溶劑中能起作用的脂肪酶(lipase)，能專一地水解除去阿斯巴甜甲酯(即MAPM)上天冬氨酸羧端上的甲酯基，使其成為阿斯巴甜(APM)。青黴素醯化酶(Penicillin acylase)可水解除去苯乙醯基阿斯巴甜上的苯乙醯基。
題名阿斯巴甜合成的研究作者馮海峰 鍾潔明機構鄭州糧食學院食品工程系刊名鄭州糧食學院學報。1998，19(2).-15-2文摘研究了以L-天門冬氨酸和L-苯丙氨酸為主要原料，合成低熱卡高甜度營養型甜味劑阿斯甜的生產工藝，通過正交試驗的方法探討了反應物量、溫度、PH值、反應時間等諸因素對合成中各步驟結果的影響。從而了合成各步驟結果的影響，從而確立了合成阿斯巴甜的最佳工藝流程和最佳生產工藝條件。
題名L-苯丙氨酸高速高效製造法作者陳曾三機構中國食協發酵工程研究會，刊名發酵科技通訊。2001，30(2).-44-48文摘L-苯丙氨酸是一種必須胺基酸，在營養和醫療上都有重要利用價值，而且是人工甜味劑α-L-天門冬醯胺-L-苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜，比蔗糖甜100-200倍)，近年來其市場優勢越來越受到國內外重視，對其研究開發也不斷進展而獲得不少有意義的成果。
題名苯丙氨酸的應用與生產作者方巖雄 張維剛等機構廣東工業大學輕工化工學院，刊名廣州化工。2000，28(4).-134-135，11文摘綜述了苯丙氨酸的性質及應用。苯丙氨酸既可以直接用作醫藥產品、食品添加劑和飲料添加劑，又可以作製備抗癌藥物的中間體和阿斯巴甜的原料，其市場需求量逐年增加。還綜述了15種生產方法的特點，指出苯胺路線是一種植得發展的合成路線。
5、中國專利名稱阿斯巴甜的製備方法申請(專利)號200410065783.8申請(專利權)人常州市牛塘化工廠地址213163江蘇省常州市武進區牛塘鎮延政路51號摘要本發明涉及化學合成法製備阿斯巴甜。採用硫醯化劑作為保護劑，對L-天門冬氨酸的氨基和α-羧基進行保護和活化，製得L-天門冬氨酸的醯化物，然後加入成環試劑發生成環反應生成環合物，環合物再經過縮合而得到阿斯巴甜產品。其中，硫醯化劑與L-天門冬氨酸反應生成醯化物過程中選擇性高，副反應少，得到的醯化物反應較為徹底、雜質含量少；醯化、成環、縮合三步主要反應都屬於均相反應過程，且在低溫下進行，易於操作控制，反應後的產物易於分離、提純；可以用甲醇、醋酸乙酯等常規有機物作為反應溶劑，加工成本低，對環境的汙染相對較小，後處理及回用較為方便；製得的阿斯巴甜產品純度高、收率高。
上述公開文獻報導的阿斯巴甜的合成方法是通過以天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯為反應底物有的比較複雜，生產成本較高，有的阿斯巴甜實驗室結果還可以，但擴大生產後工藝參數不穩定，得率不高。
發明內容
本發明人經過研究和探索，找到了一種新的合成阿斯巴甜的方法。這就是採用一步酶法，由天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇三種物質次序發生反應直接合成阿斯巴甜。以往的合成法是以天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯為反應底物。本方法無需天冬氨酸的氨基保護，也無需事先用化學法或其他方法將苯丙氨酸轉化為苯丙氨酸甲酯，而且減少了反應步驟，簡化了生產工藝，降低了生產成本。
本發明是指在微生物酶的作用下，由天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇直接合成阿斯巴甜。
本發明是這樣實現的先將所篩選的菌株在培養基中進行發酵產酶，再將所產酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇的混合液進行酶促反應。天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下直接合成阿斯巴甜，酶促反應的時間為2～24小時，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇每種物質的重量按分子量計算出具體含量。
上面所述的菌株有犁頭黴菌(Absidia spp)、裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、短小桿菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和畢赤酵母(P.pastoris)，可以從微生物中心購買，也可以自己培養。
上面所述的菌種培養基為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖、豆餅粉、葡萄糖、麥芽糖、土豆汁的其中之一或者它們的混合物。具體是菌種培養基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖或豆餅粉，5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。菌株在培養基中發酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉速250～550r.p.m，培養時間2～4天。合成阿斯巴甜合成的反應條件為溫度20～65℃，pH值為2.5～9.5，反應時間為2～24小時。
本發明與現有技術區別之處是反應時將天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇三種物質一起混合在酶液中，在微生物酶的作用下合成阿斯巴甜的，本發明無需天冬氨酸的氨基保護，使得苯丙氨酸甲酯化、二肽的合成次序進行，減少了反應步驟，簡化了生產工藝，降低了生產成本。
本發明與現有技術相比，其實質性特點和進步之處在於①反應過程無需用化學法進行苯丙氨酸的甲酯化，只需要苯丙氨酸和甲醇與天冬氨酸進行反應，直接由微生物酶體系催化合成阿斯巴甜，簡化了生產工藝，降低了生產成本。
②反應的選擇性較高，幾乎不產生阿斯巴甜的β-異構體，簡化了下遊的分離純化步驟，減少了其分離純化費用。
③採用的是一步酶法合成阿斯巴甜，與以往的化學合成法相比，它無需天冬氨酸的氨基保護，天冬氨酸無需以內酐或內酯的形式進行反應，減少了反應步驟，簡化了生產工藝。
具體實施例方式
實施實例一菌種發酵培養基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。犁頭黴菌(Absidia spp)菌株在培養基中發酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉速250～550r.p.m，培養時間2～4天。將上述發酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應的時間為2～24小時，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質重量按分子量計算出具體含量，實施實例二菌種發酵培養基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。裂褶菌(Schizophyllumcommune Fr.)菌株在培養基中發酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉速250～550r.p.m，培養時間2～4天。將上述發酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應的時間為2～24小時，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質重量按分子量計算出具體含量，實施實例三菌種發酵培養基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)菌株在培養基中發酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉速250～550r.p.m，培養時間2～4天。將上述發酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應的時間為2～24小時，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質重量按分子量計算出具體含量，實施實例四菌種發酵培養基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。短小桿菌(Bacilluspumilus)菌株在培養基中發酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉速250～550r.p.m，培養時間2～4天。將上述發酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應的時間為2～24小時，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質重量按分子量計算出具體含量，實施實例五菌種發酵培養基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌株在培養基中發酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉速250～550r.p.m，培養時間2～4天。將上述發酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應的時間為2～24小時，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質重量按分子量計算出具體含量，實施實例六菌種發酵培養基(重量百分含量)為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏(粉)0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。畢赤酵母(P.pastoris)菌株在培養基中發酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風量1∶0.1～1∶1，PH5.5～9.5，轉速250～550r.p.m，培養時間2～4天。將上述發酵得到的酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的混合液體積比設定為1∶1，在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下合成阿斯巴甜，酶促反應的時間為2～24小時，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇的每種物質重量按分子量計算出具體含量。
權利要求
1.一種阿斯巴甜生物合成的方法，其特徵在於微生物發酵所得到的發酵液以天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇為底物直接合成阿斯巴甜，具體工藝是先將所篩選微生物菌株在培養基中進行發酵產酶，再將所產酶液與天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇的混合液進行酶促反應，天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇在20～65℃、pH值為2.5～9.5的條件下直接合成阿斯巴甜，酶促反應的時間為2～24小時，其中天冬氨酸、苯丙氨酸、甲醇每種物質的重量按分子量計算出具體含量；所述的產生發酵酶液的微生物是犁頭黴菌(Absidia spp)、裂褶菌(Schizophyllumcommune Fr.)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、短小桿菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、畢赤酵母(P.pastoris)。
2.根據權利要求1所述的阿斯巴甜生物合成的方法，其特徵在於所述的菌種培養基為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖、豆餅粉、葡萄糖、麥芽糖、土豆汁的其中之一或者它們的混合物，具體的成分和重量百分含量是菌種培養基為麩皮、玉米粉、澱粉、蛋白腖或豆餅粉5～40％，蔗糖、葡萄糖、麥芽糖或土豆汁2～30％，KH2PO40.05％～1.00％，MgSO40.01％～0.7％，FeCl30.0005％～0.005％，酵母膏或酵母粉0.01％～1.5％，(NH4)2SO40.01％～1.2％。
3.根據權利要求1所述的阿斯巴甜生物合成的方法，其特徵在於菌株在培養基中發酵的條件是溫度25～45℃，壓力0.03～0.12Mpa，風量1∶0.1～1∶1，PH5.5～7.5，轉速250～550r.p.m，培養時間2～4天；合成阿斯巴甜合成的反應條件為溫度20～65℃，pH值為2.5～9.5，反應時間為2～24小時。
全文摘要
本發明是在生物法合成阿斯巴甜的基礎上，採用一步酶法合成阿斯巴甜的工藝，具體方法是用菌株發酵得到酶，再以天冬氨酸、苯丙氨酸和甲醇為底物直接合成阿斯巴甜。本發明反應過程無需用化學法進行苯丙氨酸的甲酯化，無需天冬氨酸的氨基保護，使得苯丙氨酸甲酯化、二肽的合成在微生物酶的作用下一步合成，減少了反應步驟，簡化了生產工藝，降低了生產成本。
文檔編號C12R1/65GK1900302SQ200610019678
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月17日 優先權日2006年7月17日
發明者梁智群, 吳滿剛, 陳桂光, 張雲開, 黃時海, 李楠, 陳山嶺 申請人:廣西大學