不可逆覆膜顆粒以及含有這些顆粒的組合物的製作方法

2023-04-26 17:01:41 1

專利名稱：不可逆覆膜顆粒以及含有這些顆粒的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有覆膜材料的和作為核心的固體顆粒的生產，固體顆粒包括例如病毒，微生物，蛋白質，蛋白聚合物，核苷酸，化學物質等等，這些物質本身表面帶電或者能夠對帶相反電荷的材料產生潛在的靜電引力，目的是增強所述核心材料的穩定性和/或生物活性。本發明的一個特例的覆膜材料是用作殺蟲劑的覆膜杆狀病毒。
背景技術：
象化學物質，病毒，蛋白質，蛋白質聚合物，核苷酸等等一類的顆粒的穩定性和/或生物活性通常受到環境因素例如pH，光照等等的影響。我們建議用覆膜的方法解決這一問題。
膠囊化過程是一種將聚合物，生物聚合物，石蠟，樹脂，或金屬物質的薄層薄膜沉積到一個核心上以生產微膠囊的覆膜方法。這種覆膜方法是通過用壁膜保護核心材料(活性成分)避免受到周圍環境的影響，從而控制核心材料(活性成分)釋放的時間，地點以及速率或者甚至標記所述核心材料以獲得一種可用作診斷試劑，藥物，除草劑，農藥，殺蟲劑等等的複合物產品。
因此，覆膜顆粒通常顯示出同那些模板核心有顯著不同的特性，從科學和技術的觀點來看，這一點是非常有吸引力的。
最常規的膠囊化方法之一是「複合物凝聚」。在這一方法中，兩種膠體物質，例如一種明膠和一種陰離子聚合物，它們互相帶有相反的電荷，被加入到含有核心的懸浮液中以形成液相溶膠，然後調整pH值或者用其他方法處理從而在油性核心材料的微滴上形成凝聚壁。在下一步中，微滴凝膠化，凝聚體在固化劑的作用下固化，形成微膠囊。以該技術為基礎，US5023024描述了一種使明膠的聚合物分子發生膠聯從而形成固化微膠囊的方法。本文中將提及用熱水稀釋明膠和一種合適的陰離子聚合物的混和物，接著加入酸性液水液，例如乙酸，以使系統中的pH值下降到明膠的等電點或以下，即pH值在4.0到5.0之間，從而使明膠和聚和物之間的化學反應能夠發生。本方法通過調整pH值使凝聚體的壁發生固化。
FR2675389是關於抗陽光膠囊，也利用了這種被稱作凝聚的物理化學現象。該方法包括(i)聚合物膠體溶液的製備和要被膠囊化的物質的分散，(ii)通過改變pH值以形成三相系統的分離步驟(凝聚)和，和(iii)分散物質的膠囊化。在這一方法中，pH值的範圍從3到7，優選的從4到5。在本方法中，pH值的調整是用於分離各相以回收覆膜顆粒(凝聚物)。
EP972563描述了一種利用帶有相反電荷的納米顆粒和聚電解質的交替層給顆粒覆膜以製備覆膜膠囊和中空膜的方法。該文提到推動多層薄膜形成的力量主要是靜電吸引力和在沉積的帶電物質中複合物的形成。該方法包括用納米顆粒和帶有可解離基團的聚電解質分子，即(i)多酸，例如聚乙烯磷酸或聚苯乙烯磷酸，聚乙烯硫酸或聚苯乙烯硫酸，聚乙烯磺酸或聚苯乙烯磺酸，聚乙烯膦酸或聚苯乙烯膦酸，聚丙烯酸以及它們各自的鹽，或(ii)多鹼，例如多胺，或多(銨鹽)的交替層給模板顆粒覆膜。模板顆粒的例子有有機顆粒，無機顆粒，生物標本或它們的結合。液體分散劑的pH值的調整是要使得每一個交替層的分子，即聚電解質和納米顆粒分子都帶有相反的全部電荷。EP972536中強調中空膜的形成代表一種利用膜作為可滲透壁的一個特別重要的實施方案。而且，還提及了可以通過選擇分解核心的條件，即在煅燒步驟中的溫度和加熱條件來改變膜的滲透特性。實施例是有關製備交替多聚二氧化矽(氯化二烯丙基二甲銨)(PDADMAC)多層膜並引證了當吸收溶液含有NaCl並且二氧化矽顆粒的等電點是3時大量的二氧化矽被吸收的事實，因此二氧化矽在吸收條件下(pH5-6)時帶負電。
US5792903是有關通過用放射性核素標記一種生物適應和生物可降解天然聚合物脫乙醯殼多糖以形成放射性脫乙醯殼多糖複合物，將脫乙醯殼多糖複合物製備成顆粒以形成放射性脫乙醯殼多糖大顆粒聚合物，該發明還涉及一種用於製備具有放射性活性的脫乙醯殼多糖複合物的試劑盒，及他們的製備方法及其在內照射治療製劑中的用途。製備權利要求1的內照射治療組合物的步驟包括(a)在核反應器中用中子照射水溶性穩定放射性核素化合物使其轉化為激活的放射性核素化合物；(b)將活性放射性核素化合物溶於水中形成溶液；(c)將脫乙醯殼多糖在酸性溶液(pH2-4)中溶解以形成脫乙醯殼多糖溶液；和(d)將激活的放射性核素化合物溶液加入到脫乙醯殼多糖溶液中以形成內照射治療組合物。因此，治療組合物的製備是以聚和材料(脫乙醯殼多糖)的溶解度特性，和脫乙醯殼多糖的良好的生物適應性和生物可降解性以及放射性核素化合物和脫乙醯殼多糖之間發生結合反應為基礎的。必須強調的是當溶液的pH值被調節到接近中性時(生理條件下)，將不是放射性核素化合物的覆膜而是形成一種膠質放射性活性脫乙醯殼多糖複合物大顆粒聚合物。
US5,965,123是關於覆膜殺蟲試劑在暴露於紫外輻射後仍然能夠保留大部分原有的活性。這種方法包括以下步驟(a)製備一種依賴pH的聚合物的含水混和物，(b)用鹼調節步驟(a)中混和物的pH值使其高於依賴pH值的聚合物的增溶pH以溶解依賴pH值的聚合物；(c)向步驟(b)中的溶液中加入一種殺蟲劑，一種紫外輻射保護劑，非強制性的加入一種1，2-二苯乙烯化合物，任選的加入一種分解劑和一種滑動劑並混合以產生一種均一的含有溶解的依賴pH值聚合物的懸浮液；(d)將步驟的(c)中均一的懸浮液乾燥；和非強制性的(e)磨碎步驟(d)中的乾燥材料。殺蟲劑是殺蟲病原菌，例如病毒病原菌，細菌病原菌和真菌病原菌。病毒病原菌是野生舞麥蛾核型多角體病毒，苜蓿銀紋夜蛾多角體病毒，黃杉毒蛾核型多角體病毒，松柏鋸角葉蜂核型多角體病毒和美洲棉鈴蟲核型多角體病毒。依賴pH值的聚合物選自由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲基酯共聚物，順丁烯二酸和苯乙烯共聚物所組成的組。權利要求2限定了在步驟(b)中將pH值調到8.5和10之間。
Ignoffo等(Ignofo，C.M.和Batzer，F.1971.「用微膠囊和紫外輻射保護劑來提高昆蟲病毒對陽光的穩定性」。經濟與昆蟲學雜誌64850-853)也研究了暴露於人工或天然光照下所造成的微膠囊化的美洲棉鈴蟲核型多角體病毒的失活。作者比較了(1)病毒+碳；(2)病毒+氨黑+油以及(3)病毒+鋁粉這三種微膠囊並且得出結論病毒+碳的微膠囊的穩定性是只有病毒的穩定性的3.6倍並且是病毒+紫外輻射保護劑其他組合的1.3到2.2倍。
事實上，光照-紫外輻射(SUV)使病毒和其他微生物殺蟲劑在田間失活一直是研究課題，其目的是為了解決許多農業問題。對影響這些不同類型微生物殺蟲劑穩定性的因素的研究的實例有Ignoffo，C.M.和Garcia，C.1994.「抗氧化劑和氧化酶對模擬光照-紫外輻射造成的美洲棉鈴蟲杆狀病毒包涵體的失活中的效果」環境昆蟲學.23(4)1025-1029；Teakle，R.E.1995.「利用杆狀病毒作為生物殺蟲劑的前景」。熱帶害蟲控制合作研究中心-昆士蘭大學.澳大利亞.5(6)345-347；Ignoffo，C.M.，Hostetter，D.L.和Smith，D.B.1976.「味覺刺激劑，光照防護劑，脫水生長延緩劑微生物殺蟲劑佐劑的三種特性」。經濟與昆蟲學雜誌69(2)207-210；Ignoffo，C.M.，Hostetter，D.L.，Sikorowski，P.P.，Sutter，G.和Brooks，W.M.1977.「用紫外輻射光源使各種昆蟲致病病毒，細菌，真菌，和原生動物失活」.環境昆蟲學.6(3)411-415；Shapiro，M.1985。「維生素B用於舞麥蛾(鱗翅目毒蛾科)核型多角體病毒防止紫外輻射的有效性」.環境昆蟲學14(6)705-708；Ignoffo，C.M.和Garcia，C.1995.「芳族/雜環胺基酸和模擬光照-紫外輻射使美洲棉鈴蟲/helicoverpa杆狀病毒失活」..環境昆蟲學.24(2)480-482；Ignoffo，C.M.和Garcia，C.1992.「環境因素和模擬光照的結合對美洲棉鈴蟲(鱗翅目毒蛾科)核型多角體病毒包涵體活性的影響」.環境昆蟲學21(1)210-213.Bull，D.L.1978.「微生物殺蟲劑的配方微膠囊和佐劑」.Misc.Publ.Entomol.Soc.Am.10(5)11-20。
Shapiro和Argauer開展了一項特別有意義的研究(Shapiro，M.和Argauer，R.1995.「pH，溫度，和紫外輻射對用作舞麥蛾杆狀病毒病毒增強劑的光學增亮劑活性的影響(鱗翅目毒蛾科)」經濟與昆蟲學88(6)1602-1606)。這些結果中提到了在另一項用LdNPV(Lymantria dispar核型多角體病毒)和pH緩衝液(從3.0到10.0)的研究中，在這一pH範圍，病毒活性不受影響。
另一項有趣的研究WO98/15183顯示了關於紫外輻射對生物殺蟲劑的破壞作用的。該文獻描述了一種用堅固的改進的二氧化鈦顆粒給這些殺蟲劑覆膜的方法，其數量足以獲得堅固的覆膜。在一個優選的實施方案中提到，在中性pH值下(通常在5.5到8.0之間)將堅固的二氧化鈦水懸浮液加入到攪拌了的杆狀病毒懸浮液中，或者反過來將病毒懸浮液加入到二氧化鈦懸浮液中，使二氧化鈦和杆狀病毒發生共沉降。但是，這種方法並不能夠提供堅固的覆膜。
Lessa和Medugno也觀察到了這種情況(Lessa，M.M.和Medugno，C.C.2000.「脒聚苯乙烯膠乳和黎豆葉蛾核型多角體病毒的異絮凝(Heterofloculation)作為模型系統用於研究對光照的防護」。膠體和表面科學雜誌.225317-322)。作者發現儘管本方法中所用的顆粒(脒聚苯乙烯膠乳和黎豆葉蛾核型多角體病毒)有很大的動電勢差，仍然獲得低親和力等溫線並且在電子顯微鏡的掃描下仍然能夠看到多角體表面有裸露區。這種意想不到的特性被認為是由於存在能夠克服靜電引力的額外的斥力，該力被證明是水和力的，這存在於很多膠體系統中，例如矽膠和蛋白質中。因此，它不能保證多角體表面充分覆膜並對陽光產生較好的物理屏障作用。
因此，上述研究說明得到令人滿意的覆膜方法並不簡單。相反，成功的方法需要了解有關覆膜材料和核心表面之間相互作用的知識，其目的是獲得堅固並且充分的覆膜，從而不用保護劑或者至少降低所用保護劑的濃度，所述保護劑通常用於工業配方中。事實上，顯然，提高覆膜模板顆粒的相關性在於尋找有效且穩定的覆膜材料，尤其對於生物殺蟲劑來說。
發明概述本發明的目的是通過調整pH條件從而改變要覆膜的顆粒表面的電荷以提供增強的顆粒覆膜，其目的是消除對抗有效覆膜模板顆粒結合的阻力或使阻力其達到最小。
本發明的第一個實施方案涉及穩定的覆膜顆粒，包括(a)由天然表面帶電的或者能夠對帶相反電荷的材料產生潛在的靜電引力的材料組成的核心以及(b)含有聚合物的外圍薄層基質，所述聚合物選自由聚乙烯磷酸或聚苯乙烯磷酸，聚乙烯硫酸或聚苯乙烯硫酸，聚乙烯磺酸或聚苯乙烯磺酸，聚乙烯膦酸或聚苯乙烯膦酸，聚丙烯酸以及它們各自的鹽所組成的組並且可選擇超細顆粒，其中核心顆粒是不可逆的並且各自被覆膜。
本發明的第二個實施方案涉及持久的覆膜杆狀病毒顆粒，包括(a)由病毒顆粒所構成的核心，病毒顆粒選自由黎豆葉蛾杆狀病毒(Baculovirus anticarsia)和天然表面帶電核型多角體病毒所組成的組以及(b)含有5-30％聚合物的外圍薄層基質，聚合物選自由聚乙烯磷酸或聚苯乙烯磷酸，聚乙烯硫酸或聚苯乙烯硫酸，聚乙烯磺酸或聚苯乙烯磺酸，聚乙烯膦酸或聚苯乙烯膦酸，聚丙烯酸以及它們各自的鹽所組成的組並且非強制性地是超細顆粒，其中核心顆粒是持久的並且分別覆膜。
第三個實施方案是一種製備覆膜顆粒的方法，包括這些步驟(a)將聚合物在水中製備成合適濃度的懸浮液，所述聚合物選自由聚乙烯磷酸或聚苯乙烯磷酸，聚乙烯硫酸或聚苯乙烯硫酸，聚乙烯磺酸或聚苯乙烯磺酸，聚乙烯膦酸或聚苯乙烯膦酸，聚丙烯酸以及它們各自的鹽和非強制性的超細顆粒所組成的組；(b)將步驟(a)中的水懸浮液的pH值調整到4以下；(c)把要覆膜的顆粒在水中製備成合適濃度的懸浮液並且把所得到的懸浮液的pH值調整到4以下；(d)將步驟(b)中的懸浮液加入到(c)的懸浮液中並輕輕攪拌所得到的混合液一段時間直到全部的核心顆粒完全被覆膜；(e)將步驟(d)中的懸浮液的pH值調整到5-7以獲得覆膜顆粒的中性懸浮液；和非強制性的(f)從水懸浮液中回收不可逆覆膜顆粒。
本發明的第四個實施方案涉及含有根據上述方法獲得的不可逆覆膜杆狀病毒特別是黎豆葉蛾杆狀病毒的組合物。這些組合物的物理形式可以是顆粒劑，片劑，乾粉劑等等。
附圖的簡要說明


圖1表示在pH3.0時用聚苯乙烯硫酸鹽乳膠覆膜的大小為0.084微米的杆狀病毒多角體顆粒的等溫吸附線；nads/nBV是每個杆狀病毒多角體所吸附的聚苯乙烯硫酸鹽乳膠的數目；neq/ml是處於平衡中的聚苯乙烯硫酸鹽乳膠顆粒的數量。
圖2顯示了在電子顯微鏡掃描下，用NaOH調整為中性後，被聚苯乙烯硫酸鹽乳膠覆膜的杆狀病毒多角體顆粒的大小是0.084微米。
圖3表示用聚苯乙烯硫酸鹽乳膠覆膜的大小為0.249微米的杆狀病毒多角體顆粒在(A)pH3.0時和(B)中性後的等溫吸附線，nads/nBV是每個杆狀病毒多角體所吸附的聚苯乙烯硫酸鹽乳膠的數量；neq/ml是處於平衡中的聚苯乙烯硫酸鹽乳液顆粒的數量。
圖4說明了在電子顯微鏡掃描下，在pH為3.0時被聚苯乙烯硫酸鹽乳膠覆膜的杆狀病毒多角體顆粒的大小是0.249微米。
發明的詳細描述很多生產覆膜產品的工業方法是以相反電荷的膠體顆粒之間的靜電相互作用為基礎的。但是最終的物理化學平衡狀態和物質結構，例如聚集體，複合物等等是不同的並且取決於化學，生物化學和所用的生物種類性能和特性以及相互作用的條件。
在不同的機制下，例如凝聚和異絮凝，帶相反電荷的膠體顆粒和大分子之間發生反應。在這樣的過程中，大分子通常形成網狀物以固定或保持膠體顆粒在一起作為聚集體核心。最終聚集體的大小和濃度之間的關係是決定最終聚集體穩定性或顆粒沉降為大聚集體的因素。
凝聚和異絮凝之間的主要區別涉及到每個顆粒的覆膜方式。哪一種機制佔優勢尤其取決於所涉及物質的顆粒大小以及存在的抵抗核心-覆膜結合的阻力。在異絮凝作用中，傾向於每一個顆粒都被覆膜，而凝聚作用是不均勻的，在異絮凝過程中顆粒的幾何特性得到保持。
根據最廣泛接受的膠體穩定性理論，即Deryaguin，Landau，Verwey和Overbeek(DLVO)理論，當兩種帶有相反電荷的顆粒在一種給定的介質中相互接觸時，會發生絮凝作用。如果顆粒的大小和數目的關係滿足要求，就可以獲得全部被覆膜的顆粒。
通常用DLVO理論來解釋膠體之間的相互作用，其中範德瓦耳斯引力和雙層膜間的排斥力起了主要的作用(Derjaguin，B.V.和Landau，B.V.1941.Acta Phys.Chim.URSS.14，633)。這種理論可以擴展到異絮凝作用的情況(Derjaguin，B.V.1954.Discuss.Farady Soc.18，85)；Devereux，O.F.和De Bruyn，P.L.1963「平面平行層的相互作用」MIT出版社劍橋MA.)並且已經被試驗所證實(Isam A.M.，chowdhry，B.Z.和Snowden，M.J.1995.「平面平行層的相互作用」62，109；Overbeek，J.Th.G.1997.膠體表面科學雜誌58，408)。但是，很多膠體系統只有在通過考慮其他類型的相互作用才能夠被深刻理解。例如，眾所周知一些生物表面和大分子在很高的離子強度的水溶液中仍然是分開的，而根據DLVO理論在這種條件下預計會發生凝聚。
對這種現象的一種可能的解釋是由於存在有排斥力。這種很強的排斥力當表面之間的距離較接近時會產生並且用一種表面力測量裝置(Pashle，R.M.和Isreaelachvili，J.N.1984。膠體表面科學雜誌101，511；Israelachvili，JH.N.1985.化學科學25，7)可以測量出來。這種力也會在低能量的浸溼的固體與水之間發生，該排斥力可能歸因於對去除表面水合水所需要的能量，這種非DLVO力被認為是結構或水合力。
在本發明中，覆膜的過程是通過促進覆膜模板顆粒的結合從而減少或消除這些阻力來完成的，其目的是在保持模板核心的期望特性的同時獲得堅固而有效的覆膜。通過改變pH條件而使擬覆膜的顆粒表面的電荷發生變化是中和上述力的決定因素。尤其是就多角體病毒來說，該方法是以pH值降低到低於4為基礎的，這時表面電荷從負電變為正電並且阻力(主要是水和力)被中和。該多角體具有疏水特性首次由Small等描述(Small，D.A.，Moore，N.F.和Entwistle，P.E.1986.杆狀病毒同疏水表面相互接觸時所發生的疏水相互作用。應用環境微生物學.52(1)220-223)。作者也發現疏水作用和pH值負相關，即pH值的升高使疏水相互作用減弱。
覆膜中核心顆粒和最終的聚集體的大小和濃度之間的關係也都很重要並且必須考慮到。本發明提供的小聚集體含有各自被平均分子直徑比模板顆粒小5-15倍的細且均一的薄層所覆膜的顆粒。覆膜材料的顆粒大小約為10-3到1微米。
核心模板是一種有機，無機或生物固體材料，比如象US4844896中所提及的病毒，微生物，蛋白質，蛋白質聚集體，核酸，化學物質；具有特定的結構和形狀，即多角體形，球形，杆形。這些模板顆粒能夠對帶相反電荷的材料產生出潛在的靜電吸引或者原有的帶電錶面可通過改變環境條件發生變化。
本發明中用於製備覆膜顆粒的方法包括以下步驟(a)將聚合物和非強制性超細顆粒在水中懸浮得到一個合適的濃度，所述聚合物選自由聚乙烯或聚苯乙烯磷酸，聚乙烯或聚苯乙烯硫酸，聚乙烯或聚苯乙烯磺酸，聚乙烯或聚苯乙烯膦酸，聚丙烯酸以及它們各自的鹽所組成的組，(b)將步驟(a)中水懸浮液的pH條件調整到低於4；(c)將要覆膜的顆粒在水中懸浮得到一個合適的濃度並將所得到的懸浮液的pH條件調整到低於4；(d)將步驟(b)中的懸浮液加入到步驟(c)的懸浮液中並輕輕攪拌混合液一段時間以獲得完全覆膜的顆粒；(e)將步驟(d)中的懸浮液的pH值調整到5-7以獲得覆膜顆粒的中性懸浮液；以及(f)非強制性的從水懸浮液中回收不可逆覆膜的顆粒；根據本發明，在合適的試劑濃度下進行杆狀病毒的覆膜(BV顆粒大小約為10μm)以提供102到3×103乳液顆粒/多角體顆粒。BV懸浮液含有大約108到1012顆粒/毫升且乳膠懸浮液含有1011到1012顆粒/毫升時適合於獲得上述乳膠/病毒比率。乳膠材料的顆粒大小範圍從10-2到1.0微米。如上所述，杆狀病毒覆膜的改進是以在pH值低於4時，優選的pH值為3.0時其表面的電荷從負電變為正電為基礎的，此時水和力被中和。
關於加入超細顆粒作為覆膜層的非強制性成分的可能性，它們可選自有機和無機顆粒，特別是無機顆粒，例如二氧化矽，二氧化鈦，碳黑或類似物。就杆狀病毒覆膜來說，也可以用光學增亮劑來提高病毒的生物活性(Shapiro和Argauer，1995)。
覆膜的顆粒可以通過用已知的純化和分離方法，比如離心，膜處理，乾燥處理等來回收。
本發明中獲得的覆膜顆粒通過上述細緻且均一的覆膜而使其穩定性和生物活性免受周圍環境影響，覆膜的穩定性是由於阻力即水和力被中和。
本發明最優選的實施方案是關於黎豆葉蛾杆狀病毒(BV)的覆膜。該杆狀病毒為被包裹在被稱作多角體的蛋白質結構中雙鏈DNA。該病毒是一種環保生物殺蟲劑特別用來控制在許多國家是主要的大豆食葉蟲之一的黎豆夜蛾Anticarsia gemmatalis。但是紫外輻射光是主要的破壞因子，它能夠影響病毒在田間存活。因此，需要獲得好的抵抗陽光的物理屏障。這樣，按照本發明的病毒的不可逆覆膜是解決這一問題的很好的方法，可在商業配方中減少或消除陽光保護劑的用量，陽光保護劑通常由於氣候條件(下雨，露水等等)作用而被從病毒中去除。而且，它也是提供有效的抵抗黎豆夜蛾的殺蟲劑保證。
覆膜的多角體病毒可以水懸浮液的方式用于田間。最優選地，為了使其儲藏穩定性達到最大限度並且便於處理，將覆膜多角體從懸浮液中回收並乾燥以獲得一種可以用作乾粉或片劑或顆粒劑混合物的固體材料。在片劑或顆粒劑中，本發明的覆膜多角體病毒可以用已知的材料例如矽石，矽鎂土，高嶺石，膨潤土，蒙脫石(見Medugno，C.C.，Ferraz，J.M.G.，Maia，A.de H.N.Freitas，C.C.L.對為黎豆夜蛾核型多角體病毒(Lep.Noctuidae)的溼粉配方的評價。殺蟲劑科學1997.51，153-156)配製。
下面的實施例的目的是為了對本發明作進一步的說明並非對本發明的限制。
實施例1黎豆夜蛾杆狀病毒(BV)多角體顆粒懸浮液的獲得。
用107多角體/毫升的懸浮液感染在28℃下人工飼養的鱗翅目黎豆夜蛾五齡幼蟲。感染六到十天後，將顯示出核型多角體症狀的幼蟲在-18℃下冷凍。然後用改進的van der Geest建議的方法純化多角體(van der Guest，L.P.S.一種純化多角體的方法。J.Invert.Pathol.11502.1968)。解凍後，研磨幼蟲，用合成纖維過濾並用1％的十二烷基硫酸鈉(SDS)稀釋到固體濃度為每立方分米10克。然後在5000xg下離心懸浮液並且在蒸餾水和去離子水中再懸浮固體。重複操作直到用光學顯微鏡可以觀察到的高純度多角體；然後濃縮的懸浮液在4℃下保存。
將濃縮的懸浮液稀釋到108到109BV顆粒/毫升的濃度就得到了要覆膜的杆狀病毒(BV)懸浮液。
實施例2製備硫酸聚苯乙烯乳膠分散劑將市購的硫酸聚苯乙烯乳膠母液稀釋到合適的顆粒濃度(1011到1012乳膠顆粒/毫升)。用HCl(分析純級)將懸浮液的pH值最終調整到3.0。聚苯乙烯硫酸鹽的特性如表1所示。
表1用於給杆狀病毒覆膜的聚苯乙烯硫酸鹽乳膠的特性(供應商驗證)大小(微米)表面電荷密度單位帶電基團的面(μC/cm2) 積(A2/C(NH)NH20.084±10.5％0.8 19970.249±3.5％ 2.08 772
實施例3用顆粒大小為0.084微米聚苯乙烯硫酸鹽乳膠覆膜的杆狀病毒。
把根據實施例1所得到的杆狀病毒懸浮液稀釋到濃度為1.1×1010顆粒/毫升，同實施例2中得到的聚苯乙烯硫酸鹽乳膠懸浮液(顆粒大小為0.084微米)混合就達到異絮凝。在pH3.0，25℃條件下將懸浮液混和於離心管中溫和攪拌以達到一個BV顆粒有1200個乳膠顆粒的比率從而獲得完全，細緻而均一的覆膜。然後將混合物在10,000rpm下離心30分鐘。在pH3.0時多角體核心顆粒帶正電而聚苯乙烯硫酸鹽的表面帶負電。檢測上清液的濁度可以鑑定通過異絮凝作用的成功覆膜過程。沒有結合到杆狀病毒上的顆粒數可以通過400nm下對上清液濁度測定的吸光度同pH3.0時的乳膠校準曲線的吸光度相比較來確定。
離心用於異絮凝作用平行測定的相同濃度的0.084微米的乳膠顆粒懸浮液，確定一個乳膠沉降校正係數並引入到計算仍然存在於上清液的游離乳膠顆粒的數目中。
圖1顯示了顆粒的高親和性。加入的乳膠顆粒/多角體顆粒的比率變化範圍是從10到1600。為了證明在覆膜過程中所發生化學反應的穩定性，在離心前，混合物樣品的pH值通過加入0.2毫升0.1N的NaOH而變為中性並測量吸光度。
兩次離心和用去離子水洗滌的循環後，將異絮凝了的材料乾燥並且通過用掃描電鏡LEO estereoscan 440所拍攝的顯微照片證明覆膜的有效性。
圖2說明了本發明覆膜方法良好的結果。
實施例4用於杆狀病毒顆粒覆膜的聚苯乙烯硫酸鹽乳膠大小為0.249微米。
異絮凝的發生如實施例3的描述。區別涉及到覆膜材料的顆粒大小。在本實施例中，聚苯乙烯乳膠硫酸鹽顆粒的大小為0.249微米。然後，將混合物在2000rpm下離心。
對照試驗顯示，在上述條件下離心後，在與實施例3相同的條件下測定0.249微米的乳膠懸浮液的吸光度沒有變化，並且零點吸光度可以被測定以用於離心的杆狀病毒懸浮液的上清液。
圖3的等溫線顯示了高親和性結果。隨加入的顆粒數目的增加聚苯乙烯硫酸鹽乳膠的吸光度升高。乳膠顆粒/多角體顆粒的比率的變化範圍從5到600。
如實施例3，在離心前混合物樣品的pH值通過加入0.2毫升0.1N的NaOH被中和並且測定吸光度。在中和前後對異絮凝樣品上清液的濁度測量結果是相同的，因此證明了本發明的覆膜的穩定性。圖4顯示了從掃描電鏡LEO estereoscan 440所拍攝的顯微照片說明了這一結果。
實施例5本發明的覆膜顆粒和方法同用脒聚苯乙烯乳膠顆粒的覆膜顆粒和方法的比較。
在25℃下，將新製備的杆狀病毒和大小為0.120微米和0.172微米的乳膠顆粒懸浮液，乳膠顆粒由於脒而帶正電(從Dynamic Corp.購得)，在1200顆粒/多角體的濃度下，經溫和攪拌達到異絮凝。然後在2000rpm下離心混合物30分鐘。在這樣的條件下，乳膠不沉澱並且沒有結合到BV上的顆粒數目可以通過濁度來測定。結果證明了顆粒的低親和性，表明0.120微米和0.172微米的顆粒的覆膜係數分別為64％和56％。
這一試驗證明中和BV表面電荷所必須的-吸附作用所確定的乳膠顆粒數目取決於顆粒的大小並且大於剩下的結合到生物表面的顆粒數目。的確，這些結果只能夠用上文中提到的在系統中存在著產生作用的額外的排斥力(即水和力)來解釋。
權利要求
1.一種覆膜顆粒，其特徵在於它含有(a)由一種天然表面帶電的材料或能夠對帶相反電荷的材料產生潛在的靜電引力的材料組成的核心和(b)一個含有一種聚合物的外圍基質薄層，所述聚合物選自由聚乙烯磷酸或聚苯乙烯磷酸，聚乙烯硫酸或聚苯乙烯硫酸，聚乙烯磺酸或聚苯乙烯磺酸，聚乙烯膦酸或聚苯乙烯膦酸，聚丙烯酸以及它們各自的鹽所組成的組以及非強制性地是(c)超細顆粒，其中核心顆粒是不可逆地並且每一個都被覆膜。
2.根據權利要求1的覆膜顆粒，其特徵在於該核心材料是一種多角體病毒。
3.根據權利要求2的覆膜顆粒，其特徵在於多角體病毒是一種杆狀病毒。
4.根據權利要求3的覆膜顆粒，其特徵在於所述杆狀病毒是一種黎豆夜蛾杆狀病毒。
5.根據權利要求3的覆膜顆粒，其特徵在於外圍基質薄層含有一種聚苯乙烯硫酸乳膠，其中乳膠顆粒/多角體顆粒的比例範圍從102到3×103。
6.根據權利要求3的覆膜顆粒，其特徵在於外圍基質薄層含有一種聚苯乙烯硫酸鹽乳膠，其乳膠顆粒/多角體顆粒的比例範圍從103到3×103。
7.一種製備覆膜顆粒的方法，其特徵在於包括如下步驟a)在水中懸浮一種聚合物和非強制性的超細顆粒到合適的濃度，所述聚合物選自由聚乙烯磷酸或聚苯乙烯磷酸，聚乙烯硫酸或聚苯乙烯硫酸，聚乙烯磺酸或聚苯乙烯磺酸，聚乙烯膦酸或聚苯乙烯膦酸，聚丙烯酸以及它們各自的鹽所組成的組；b)將步驟(a)中的水懸浮液的pH條件調整到低於4；c)在水中懸浮要覆膜的顆粒到合適的濃度並將所得的懸浮液的pH值條件調整到低於4，所述顆粒由天然表面帶電或能夠對帶相反電荷的材料產生潛在靜電吸引的材料所組成；d)將步驟b)的懸浮液加入到步驟c)的懸浮液中並輕輕攪拌所得的混合物直到獲得完全覆膜顆粒；e)將步驟d)中的懸浮液的pH值調整到5-7以獲得接近中性的覆膜顆粒懸浮液；和f)非強制性的從水懸浮液中回收不可逆覆膜顆粒。
8.根據權利要求7的方法，其特徵在於步驟a)所用的聚合物是硫酸聚苯乙烯乳膠。
9.根據權利要求7的方法，其特徵在於步驟c)中的要被覆膜的顆粒是多角體病毒顆粒。
10.根據權利要求7的方法，其特徵在於多角體病毒是杆狀病毒。
11.根據權利要求10所述的方法，其特徵在於杆狀病毒是黎豆夜蛾杆狀病毒。
12.根據權利要求7的方法，其特徵在於步驟b)和c)的懸浮液的pH值被調整到3.0。
13.根據權利要求7的方法，其特徵在於膠體顆粒/多角體顆粒的比例範圍是從102到3×103。
14.根據權利要求13的方法，其特徵在於聚合物的濃度範圍是從1011到1012乳膠顆粒/毫升。
15.根據權利要求13的方法，其特徵在於核心材料的濃度範圍是從108到109乳膠顆粒/毫升。
16.一種殺蟲劑組合物，其特徵在於它是含有權利要求2的多角體病毒和固體形式的可配伍成份。
17.根據權利要求16的殺蟲組合物，其特徵在於多角體病毒是杆狀病毒。
18.根據權利要求17的殺蟲組合物，其特徵在於杆狀病毒是黎豆夜蛾杆狀病毒。
19.根據權利要求16殺蟲組合物，其特徵在於固體形式是片劑，顆粒劑或乾粉劑。
20.一種殺蟲組合物，其特徵在於它是含有權利要求2的多角體病毒和水懸浮液形式可配伍成份。
全文摘要
本發明涉及穩定的覆膜顆粒，它含有(a)由天然表面帶電的材料和能夠對帶相反電荷的材料產生潛在靜電引力的材料組成的核心和(b)含有聚合物的外圍基質薄層，聚合物選自由聚乙烯磷酸或聚苯乙烯磷酸，聚乙烯硫酸或聚苯乙烯硫酸，聚乙烯磺酸或聚苯乙烯磺酸，聚乙烯膦酸或聚苯乙烯膦酸，聚丙烯酸以及它們各自的鹽所組成的組，和非強制性的超細顆粒，其中核心顆粒是不可逆的並且各自被覆膜。
文檔編號A01N25/26GK1402615SQ00816349
公開日2003年3月12日 申請日期2000年9月28日 優先權日2000年9月28日
發明者C·C·麥杜格諾, M·M·萊薩 申請人:巴西農業研究公司