產生pha的基因工程微生物的製作方法

2023-04-26 17:10:16

產生pha的基因工程微生物的製作方法
【專利摘要】本發明的目的在於一種天然產生PHA的微生物的基因工程形式，其與具有編碼聚羥基烷羧酸酯(PHA)合成酶的至少一個基因的野生型微生物相比具有增加的拷貝數，並最終引起在24小時後微生物以與野生型相比至少1.2倍的量來過量產生中鏈長度的PHA或長鏈長度的PHA，其中用於評估過量產生的參考條件是含有15mM辛酸鈉的經修改的MM培養基。另外，在微生物中PHA的產生可以被編碼PHA降解中涉及的蛋白質的基因的失活有利地影響，這導致微生物的化合物增加的生產而沒有隨著時間的PHA含量的下降。本發明的微生物可用於PHA的商業生產。本發明還涉及用於產生PHA的方法。DSM2622520130409DSM2622420130409
【專利說明】產生PHA的基因工程微生物
[0001] 本發明涉及聚羥基烷羧酸酯（PHA)的生物合成領域。本發明尤其涉及具有編碼 PHA合成酶的至少一種基因的基因工程微生物，與野生型微生物相比，其繁殖穩定且增加拷 貝數，其中，基因工程使微生物過量產生中鏈長度或長鏈長度的PHA。
[0002]PHA屬於聚合物類型，其為由可再生資源生產的生物可降解的和生物相 容性的塑性材料（3-羥基脂肪酸的聚酯），可廣泛的用於工業和生物醫學應用 (Williams&Peoples, 1996,Chemtech26:38-44)。PHA通過多種細菌合成，並且由於其替代 常規的基於石油化學的塑料以保護環境免受塑料廢物的有害影響的潛在用途而已經被廣 泛地研宄。
[0003] 根據PHA的側鏈長度和其生物合成途徑，可將其分為兩類。具有短的側鏈的那些是 結晶熱塑性塑料，例如PHB、（R)-3-羥基丁酸的均聚物，而具有長的側鏈的PHA更具彈性。前 者已經知道約 70 年了（Lemoigne&Roukhelman, 1925,AnnDesFermentation, 527-536)，而 後者是相對近期發現的（deSmet等人，1983,J.Bacteriof. 154:870-78)。然而，在該命名之 前，已經識別了包含具有5至16個碳原子的較長側鏈（R)-3-羥基酸單元和（R)-3-羥基丁 酸單元二者的生物來源的PHA(Wallen&Roweder1975,Environ.Sci.Technol. 8:576-79)。 已經識別了產生含有5至16個碳原子的一種或更多種長側鏈羥基酸單元和 (R) -3-輕基丁酸的共聚物的多種細菌（Steinbuchel&Wiese, 1992,Appl.Microbiol. Biotechnol. 37:691_97;Valentin等人，1992,Appl.Microbiol.Biotechnol. 36:507-14; Valentin等人，Appl.Microbiol.Biotechnol. 1994,40 :710_16;Abe等人，1994,Int. J.Biol.Macromol. 16:115-19;Lee等人，1995,Appl.Microbiol.Biotechnol. 42:901-09 ; Kato等人，1996,Appl.Microbiol.Biotechnol. 45:363-70;Valentin等人，1996,Appl. Microbiol.Biotechnol. 46:261-67和美國專利號4876331)。這些共聚物可以被稱為 PHB-co-HX(其中X為具有6個或更多個碳原子的烯羧酸酯（alkenoate)或3-羥基烷 羧酸酯）。特定的二元共聚物的一個有用例子為PHB-co-3-羥基己酸酯（PHB-C〇-3HH) (Brandi等人，1989，Int.J_Biol.Macromol.il: 49-45 ;Amos&McInerey，1991，Arch. Microbiol. 155:103-06 ;美國專利號 5292860)。
[0004]儘管由於PHA作為可再生資源用於生物可降解的熱塑性塑料和生物聚合 物（如上述的）的潛在用途而已經對其進行廣泛地研宄，並且已經商業開發和銷 售（Hrabak, 1992,FEMSMicrobiol.Rev. 103:251-256)，但是其生產成本遠高於常 規的基於石油化學的塑料的生產成本。這對其更為廣泛的應用構成了主要障礙 (Choi&Lee, 1997,BioprocessEng. 17:335-342)。如上所述，許多細菌產生PHA，例如，真 養產喊桿菌（Alcaligeneseutrophus)、肥大產喊桿菌（Alcaligeneslatus)、掠色固氣 菌（Azotobactervinlandii)、嗜酸假單胞菌（Pseudomonasacitophila)、Pseudomonas oleovarans、大腸桿菌（Escherichiacoli)、富養紅球菌（Rhodococcuseutropha)、紫色色 素桿菌（Chromobacteriumviolaceum)、酒色著色菌（Chromatiumvinosum)、泊庫島食焼菌 (Alcanivoraxborcumensis)等。在現有技術中已知所有這些產生PHA的細菌產生細胞內 PHA並且將其累積在PHA顆粒中（Steinbuchel，1991，Biomaterials，第 123-213 頁）。
[0005] 與基於石油化學的塑料相比，使得PHA生產昂貴且因此不利的主要方面在於難以 高產率來生產材料和難以從累積PHA的細菌細胞中回收所產生的PHA。為了降低PHA的 總生產成本，據認為有效回收工藝的開發通常是必要的：其通常目的在於通過i)適當的溶 劑，ii)PHA的次氯酸鹽提取和/或iii)非PHA細胞材料的消化進行的細胞破碎（Lee，199 6,Biotech,Bio-eng. 49:1-14)〇
[0006] 在工業規模上，可獲得的微生物仍提供相對少的PHA，這使得利用這些微生物產生 PHA在經濟上是不可行的。例如，在將惡臭假單胞菌U(PseudomonasputidaU)的野生型細 胞在經修改的包含辛酸鈉（15mM)作為碳源的MM培養基中培養，在第一個24小時期間，在 微生物中僅累積了 24. 4%的PHA。現有技術中已知的用於基於PHA生產的微生物的所有方 法在生產期間需要大量水，以及用於PHA回收的化學試劑和/或酶，這是對降低生產成本的 障礙。因此，迫切需要用於PHA生產的替代策略。
[0007] 除了整體低的微生物的PHA生產之外，在特定培養階段所累積的PHA的量開始減 少。這種減少的原因可以追溯至以下事實：微生物產生PHA作為食物儲存材料，其在變化的 環境中作為快速能量來源和還原能力提供給細菌。所有獨立生存的微生物實行某種碳源管 理到了可能的程度，而許多動物和植物通常調節碳源攝取以滿足代謝需求，其他生物，尤其 是經受過可用碳源大幅波動的機會性環境微生物能夠捕獲過量的碳源並管理其利用，如一 方面通過消耗和生長，另一方面通過轉化保存以儲存聚合物。在可容易代謝的儲存產品和 更加惰性的細胞內儲存產品，在某種程度上還有細胞外存儲產品之間的相互轉化是該機制 的核心。甚至調節碳源攝取的生物體也利用這種相互轉化用於微調它們的碳源管理以最優 化其細胞代謝網絡和機體生理生態過程。
[0008] 如以上所提及的，PHA是微生物界中廣泛利用的儲存產品。為了允許微生物中以 PHA儲存的碳源的利用，對生物而言至關重要的是在微生物需要額外的碳源時能夠將PHA 轉化成羥基烷羧酸酯（即，單體）。負責將聚合物轉化為單獨的單體單元的是PHA解聚酶。
[0009] 由於微生物含有負責PHA產生和降解的兩種類型蛋白質，生物體確保其生存和發 展的關鍵問題是調節PHA合成酶與PHA解聚酶的相對量，這是通過酶的調節生成來確定的 (Uchino等人，2007;Ren等人，2009a;以及deEugenio等人，2010a, 2010b)。然而，迄今 為止，對控制聚合與解聚合過程的因子知之甚少。例如，僅敲除假單胞菌菌株中的PHA解聚 酶並不導致提高的PHA累積（Huisman等人，1991 ;Solaiman等人，2003)。因此，事實證明 僅消除負責PHA解聚的基因來有效地增加微生物中PHA的含量是不夠的。
[0010] 增加微生物中PHA生成的不同途徑是操控在微生物中負責PHA生成的PHA合成 酶。例如，已發現PHA基因的代謝工程是用於提高中鏈長度的PHA生成的良好策略。之前 的研宄試圖通過phaCl的過表達來增加惡臭假單胞菌中的PHA產率（Kraak等人，1997 ; Prieto等人，1999;Conte等人，2006;Kim等人，2006;Ren等人，2009b)。然而，這些研宄 遇到了以下問題：含有PhaC的質粒在其對於生長不重要時丟失並且在細胞中施加不利影 響。結果，經修改的微生物經繁殖後不穩定，且丟失了負責PHA過量產生的遺傳信息。在其 他情況中，得到了較少的PHA累積，因為啟動子的高誘導性並不總是必然伴有高活性的基 因產物Oiederich等人，1994;Ren等人，2009) ?
[0011] 這些嘗試不成功的原因可以在涉及微生物中PHA的生成、存儲和降解的許多不同 蛋白質中找到。多數微生物具有多於一個的PHA合成酶，因此，增加一種合成酶的基因拷 貝數會使微生物耗盡對生成其他PHA合成酶重要的代謝物，這導致微生物中僅中等提高的PHA合成。
[0012] 此外，顆粒結合蛋白（phasin)在微生物中對PHA顆粒穩定起重要作用。例如， 顆粒結合蛋白控制PHA顆粒的數量和大小（Grage等人，1999)，其生成介於細胞質與PHA 顆粒疏水核心之間的中間相，由此防止各個顆粒聚結（Steinbuchel等人，1995 ;York等 人，2002)。還已經提出顆粒結合蛋白PhaF以及一些球形轉錄因子（如Crc)對PhaC活 性的調節是重要的（Prieto等人，1999b;Casta_neda等人，2000 ;essler&Witholt, 2001 ; Hoffmann&Rehm, 2005;Ren等人，2010)。P.putidaKT2440(Galan等人，2011)中的最近研 宄已經證明PhaF在顆粒分離中起重要作用，而甚至缺少這種顆粒結合蛋白使得細胞質中 的這些包含體結塊。
[0013] 因此，這對修飾微生物提出了相當大的挑戰：所述修飾使得微生物以顯著程度過 量產生PHA，且同時確保導致過量產生的該修飾在微生物經繁殖後穩定，並且確保在PHA微 生物的操作中涉及的蛋白質都不被嚴重地影響以使得過度補償期望的結果。對於目前所嘗 試的多數途徑，另外還難以找到PHA累積處於其峰值的精確時間點，且難以在PHA分解前回 收PHA。
[0014] 在W0 2007/017270A1中已經描述了一種途徑，就這方面而言其在一定程度上已 經成功，其中泊庫島食烷菌已經通過消除類tesB基因而被修飾。該基因編碼硫酯酶，硫酯 酶將（R)-3-羥基-醯基-CoA中間體轉化成相應的酸。這是重要的副反應，其使微生物耗 盡對PHA合成而言重要的中間體。雖然這種途徑由於實現較高的PHA累積而已經被證明在 一定程度上是成功的，但是有待觀察是否經修飾的微生物具有需要的穩定性以允許成功實 施進入工業規模的PHA生產。
[0015] 另一個途徑為過表達PHA合成酶如已經由Kim等人（2006,Biotechnol. Prog. 22:1541-1546)描述的在p.putidaKCTC1639 中的phaCl和phaC2。在該研宄中，將 另外的phaCl和phaC2基因的拷貝通過質粒引入微生物中，其中，所述基因不受啟動子控 制。Kim等人描述了在經修飾的微生物中PHA合成酶的活性多於野生型的活性的1. 6倍。 雖然在過表達phaCl的微生物的情況下可以觀察到增加的PHA生產（至多約0. 8g/l)，但是 過表達phaC2的微生物並未表現出相對於野生型而言增加了PHA產生。該觀察可能是由於 phaC2合成酶的非活性形式的形成引起的。
[0016] 另外一個途徑是將PHA合成酶基因插入微生物中，這在其野生型形式 中不產生PHA。例如，TO99/14313、DE44 17 169A1 或Qi等人（1997，FEMS Microbiol,Lett. 157:155-162)描述了將PHA合成酶基因引入大腸桿菌（Ecoli.)中。然 而，在這些經改造的微生物中，所生產的PHA的產率非常低，使得它們不適合PHA的工業生 產。
[0017]最後，Cat等人（2009,Biores.Technol. 100:2265-2270)已經報導了通過敲除 P.putidaKT2442.中的PHA解聚酶基因提高PHA生產。在該研宄中，在將微生物在高碳源 濃度例如12g/l存在下培養時，可以觀察到PHA生產的增加。
[0018] 儘管有這些進步，但是仍存在對基因修飾的微生物的需求，所述基因修飾的微生 物具有增加的PHA過量產生且同時經繁殖後是穩定的，因為它們不會丟失為此目的而插入 的遺傳信息。本申請滿足這個需求。
[0019] 發明的簡要說明
[0020] 本申請的一個目的是提供基因工程微生物，其中在微生物中負責中鏈長度的PHA 或長鏈長度PHA的過量產生的遺傳信息經繁殖後是穩定的。本發明的另一個目的是修飾微 生物，使得避免暴露於培養基一定時間後PHA下降，並且同時增加PHA累積的百分比。另外， 本申請的另一目的是修飾微生物，使得防止在已經累積PHA之後發生顯著的PHA降解。
[0021] 本發明基於以下發現：通過修飾產生PHA的微生物以使得它們與具有編碼PHA合 成酶的至少一個基因的野生型微生物相比增加的拷貝數可以實現這些目標。優選地，在另 外的拷貝中存在的基因編碼phaC2或其同系物。當在本申請中使用該術語時，野生型微生 物是指當微生物在自然界中出現時的典型形式。優選地，天然形式的野生型微生物包含編 碼PHA合成酶的至少一種基因。
[0022] 術語"同系物"在本申請的實踐中定義為基本上具有相同的功能但是具有不同 (儘管相似）的親本肽序列和結構的蛋白質或肽。本申請的上下文中，術語"同源百分比" 和"序列相似度"可互換地使用。在本申請的實踐中，優選同系物相對於親本肽應當具有 至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、最優選至少95%的序列一致性。用 於比較兩個序列的數學算法的一個優選非限制性實例是Karlin等人的算法（1993,PNAS 90:5873-5877)。將該算法引入NBLAST程序中，該程序可以用於識別相對於本發明的核酸 序列具有期望的一致性的序列。
[0023] 因此，本申請的一個主要方面是天然的產生PHA的微生物的基因工程形式，其與 具有編碼PHA合成酶的至少一種基因的野生型微生物相比具有增加的拷貝數，其中所述增 加的拷貝數提供均衡性的所述PHA合成酶的過量產生，並最終使微生物在24小時後以與野 生型相比至少1.2倍的量過量產生中鏈長度的PHA或長鏈長度的PHA，其中用於評估過量產 生的參考條件是含有15mM辛酸鈉的經修改的MM培養基。在一個優選實施方案中，基因工 程微生物經繁殖後是穩定的且優選地與具有編碼PHA合成酶的至少一個基因的野生型微 生物相比具有另一個拷貝。
[0024] 已經出乎意料地發現，這些基因修飾的微生物允許由便宜且容易獲得的原料高成 本效率地產生PHA，所述原料包括來源於植物脂肪和植物油的脂肪酸。已經觀察到本發明微 生物提供高的PHA峰值濃度，根據培養條件，甚至在一些情況下在僅24小時後達到峰值濃 度。此外，本發明微生物表現出高的遺傳穩定性並且融合微生物中的多個PHA顆粒以形成 單個PHA顆粒。這進而大大地簡化了從微生物中回收PHA，因為它們可以用非氯化溶劑如丙 酮提取，並具有與用氯化溶劑提取相當的產率。
[0025] 術語"基因工程的"（或基因修飾的）是指人工操控本發明的微生物、其基因和/ 或基因產物（多肽）。
[0026] 優選地，本發明微生物經繁殖後是穩定的。"經繁殖後穩定"（如該術語在本申請 的實踐中應當被理解的）是指，生物體在經過多倍（例如5或更高倍數）繁殖周期後保持 遺傳信息且不丟失遺傳信息。
[0027] 如以上所述的，本發明微生物優選經繁殖後是穩定的，這意味著在繁殖和/培養 的微生物中保持了基因修飾。除了這種穩定性之外，優選的是微生物不需要抗生素的壓力 來保存基因修飾。這種微生物對於PHA生產是高度有利的，因為可以省略抗生素的添加，從 而消除了抗生素汙染PHA的風險。在本申請的一個優選實施方案中，本發明微生物由此在 繁殖和/或培養期間保持其基因修飾，而與受抗生素的存在或不存在無關。
[0028] 術語"均衡性過表達"是指過表達為使得以小於由增加的拷貝數可預期的量產生 由過表達產生的蛋白質。例如，如果野生型包含基因的一個拷貝而基因修飾的微生物包含 兩個拷貝，可以預期基因修飾的微生物產生與野生型相比約兩倍的蛋白質。蛋白質的量可 以由生長期的微生物中的固有PHA合成酶的活性來估算。術語均衡性過表達意思是：過表 達優選地僅導致24小時候生長期中的固有PHA合成酶活性相對於野生型微生物而言增加 至多0. 6倍，優選至多0. 5倍，更優選至多0. 35倍，最優選至多0. 2倍。
[0029] 通過使用"均衡性過表達"，確保了沒有大量無活性蛋白質形成。例如，蛋白質的大 量的（或不均衡的）過表達可導致形成包涵體，其以非活性形式並作為不溶解的蛋白質包 含蛋白質。因此，儘管過表達了蛋白質，但觀察不到增加的蛋白質活性。確保均衡性過表達 的一種方法是利用滲漏啟動子（leakypromoter)系統，其即使在誘導物不存在的情況下也 使蛋白質產生受抑制。
[0030] 在本申請的一個優選實施方案中，過量產生至少部分是由增加的編碼PHA合成酶 的至少一個基因的拷貝數引起的。在另一個優選實施方案中，微生物含有多於一個拷貝的 基因是編碼PhaC2合成酶的基因。在本發明的實踐中已經發現，插入phaC2基因或其同系 物的多拷貝與有益效果相關，特別地phaC2的超表達涉及PHA顆粒的形態變化，其看上去聚 結在一起，尤其在對數生長相期間如此。
[0031] 此外，據認為在滲漏啟動子控制下的PhaC2合成酶基因的多拷貝的插入影響PHA 代謝中涉及的其他蛋白質，以使得微生物的整體PHA生產和存儲系統不受負面影響。
[0032] 在另一個優選實施方案中，PHA合成酶基因的表達因此受滲漏啟動子系統調節。滲 漏啟動子系統允許啟動子控制的基因的轉錄，但是與系統中啟動子用相應活化劑激活的系 統相比具有被抑制的效率。滲漏啟動子系統優選是基於蛋白質的啟動子系統，更優選是17 聚合酶/I7聚合酶啟動子系統。在一個甚至更優選的實施方案中，在17聚合酶/I7聚合酶 啟動子系統中17聚合酶的產生包含能夠在暴露於小分子後誘導形成17聚合酶的誘導物。 這種系統具有增加的益處：其通過添加導致誘導17聚合酶形成的小分子可以選擇性觸發 17聚合酶的產生。然後這進而觸發PHA合成酶產生。在一個特定的優先實施方案中，小分 子是3-甲基-苯甲酸酯。
[0033] 天然地產生PHA的微生物的一個高度優選的創造性基因工程形式是在萊布尼茲 研宄所DSMZ德國微生物和細胞培養物保藏中心以DSM26224保藏（保藏日期為2013年4 月9日）的假單胞菌屬的基因工程形式，其在下文中將被指定為PpU10-33。
[0034] 在本申請的實踐中進一步優選的是，其與具有編碼PHA合成酶的至少一個基因的 野生型微生物相比，除了增加的拷貝數之外，基因工程微生物還在編碼PHA降解中涉及的 蛋白質的至少一個基因中含有至少一個修飾。已經發現在微生物中這樣的修飾組合導致對 所觀察的PHA累積的協同效應。在一個優選的實施方案中，在所述微生物中編碼PHA降解 中涉及的蛋白質的至少一個基因中的至少一個修飾導致所述基因完全或部分失活，優選地 導致所述基因完全失活。這種微生物也稱為敲除相應基因的微生物。
[0035] 基因敲除突變體可以通過本領域技術人員已知的任意合適的方法製備。然而，優 選的是基因的完全或部分失活是通過雙重組交換事件途徑實現的。
[0036] 在一個特定優選的實施方案中，PHA降解中涉及的蛋白質是PHA解聚酶，優選地是 PhaZ或其同系物。另外，優選的，基因工程微生物中編碼PHA降解中涉及的蛋白質的基因含 有至少一個修飾，其僅含有在所述微生物中編碼PHA降解中涉及的蛋白質的單個基因，其 即，僅修飾該基因。換言之，優選的是微生物不含有可以取代所述微生物中PHA降解中涉及 的酶的任何其他酶。
[0037] 天然地產生PHA的微生物的一個高度優選的創造性基因工程形式是在萊布尼茲 研宄所DSMZ德國微生物和細胞培養物保藏中心以DSM 26225保藏（保藏日期為2013年 4月9日）的假單胞菌屬的基因工程形式，其中所述的天然地產生PHA的微生物包含編碼 PHA合成酶的基因的多拷貝和失活的phaZ基因二者。該微生物在下文中將被指定為PpU 10_33_ AphaZ〇
[0038] 典型的羥基酸單元聚酯（PHA)含有具有5至6個碳原子的側鏈羥基酸單元 [(R)-3-羥基酸單元]。在本發明的實踐中，術語"長鏈長度的PHA"意在涵蓋每個單體（分 子）含有至少12個碳原子、優選地至少14個碳原子的PHA，而5至12個碳原子的意在用 "中鏈長度的PHA"表示。在一個優選的實施方案中，基因工程微生物過量產生中鏈長度的 PHA〇
[0039] 在本發明的一個特別優選實施方案中，基因工程微生物是由基因工程引起的，即， 例如，插入與具有編碼PHA合成酶的至少一個基因的野生型相比增加的拷貝數，和/或在編 碼所述微生物中的PHA降解中涉及的蛋白質的至少一個基因中插入至少一個修飾，以在24 小時後與野生型相比以至少1.2倍（重量）、優選至少1.5倍（重量）以及特別地至少2倍 (重量）的量過量產生PHA，其中用於評估過量產生的參考條件是含有15mM辛酸鈉的修改 麗培養基。
[0040] 形成本申請的基因工程微生物的基礎的微生物不受任何方式限制，只是該微生物 必須具有編碼PHA合成酶的至少一個基因。優選地，微生物還應當具有編碼在所述微生物 中PHA降解中涉及的至少一個基因、更優選單個基因。
[0041] 根據本發明的創造性微生物優選地選自產生PHA的細菌，特別地選自惡臭假單胞 菌、綠胺假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、丁香假單胞菌（Pseudomonassyringae)、 焚光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)、嗜酸假單胞菌（Pseudomonasacitophila)、 Pseudomonasolevarans、熱液海源菌（Idiomarinaloihiensis)、泊庫島食燒菌、不動 桿菌屬（Acinetobactersp.)、新月柄桿菌（Caulobactercrescentus)、真養產喊桿菌 (Alcaligeneseutrophus)、肥大產鹼桿菌（Alcaligeneslatus)、棕色固氮菌、富養紅球 菌（Rhodococcuseutropha)、青紫色素桿菌（Chromobacteriumviolaceum)或酒色著色菌 (Chromatiumvinosum)。根據本發明的一個特別地優選的微生物是惡臭假單胞菌菌株，更 優選地是惡臭假單胞桿菌U。
[0042] 已經觀察到，本發明的微生物在不存在誘導物分子的情況下表現出PHA合成酶的 過量產生。出乎意料地，通過非誘導的微生物的PHA產生匹配或甚至超過用誘導物處理的 相同微生物的PHA產生。這表明經誘導的微生物可以超越過表達的PHA合成酶的最佳量，這 導致形成合成酶的非活性形式例如包涵體或不溶解的形式。因此，本發明的另一方面是如 上所述的基因工程微生物，其中所述微生物能夠在沒有添加誘導物分子的情況下產生PHA。 這對於工業規模的PHA生產具有優勢，因為可以省去昂貴的誘導物和來自生產工藝的潛在 汙染風險。
[0043] 還已經出乎意料地觀察到，本申請的微生物生產與野生型相比具有不同形貌的 PHA，因為各個細胞均產生減少的PHA數目或者甚至僅單個PHA顆粒。因此，本申請的另一 方面是如上所述的基因工程微生物，其中所述微生物與野生型細胞相比每個微生物能夠產 生減少數目的細胞內PHA顆粒，優選地為單個細胞內PHA顆粒的形式。據認為單個顆粒的 形成與減少的PHA穩定化酶的量相關，這簡化了PHA分離與純化。
[0044] 還出乎意料地觀察到本申請的微生物產生PHA更快且在某些情況下在長的時間 內維持高水平的累積PHA。因此，本申請的另一方面是如上所述的基因工程微生物，其中所 述微生物在暴露於含有辛酸鈉的經修改MM培養基24小時後能夠產生最大含量的PHA，並且 優選地也能夠在最初24小時累積期後至少48小時的時間內將PHA含量維持在最大PHA含 量的±20重量％範圍內，其中用於評估PHA產生的參考條件是含有15mM辛酸鈉的修改麗 培養基。
[0045] 本發明的另一方面涉及用於產生PHA的方法，其包括以下步驟：
[0046] a.培養本發明的微生物或細胞和
[0047]b.從培養基中回收PHA。
[0048] 用於在合適的條件下培養微生物或細胞的標準方法是現有技術中眾做周知的。例 如，參見以下實施例、材料以及Sambrook&Russel1 (2001)。PHA可以通過常規程序從培養基 中回收，所述程序包括通過離心或過濾從培養基中分離細胞，沉澱或過濾成分（PHA)，隨後 純化，例如通過層析程序如離子交換、層析、親和層析或相似的本領域認可的程序來純化。
[0049] 優選的是在上述過程中的PHA是利用具有3至8個碳原子的酮、優選用丙酮提取 的。與提取溶劑無關，提取優選在60°C或更低的溫度下、優選在20至40°C進行。
[0050] 在本申請的一個特別優選的實施方案中，方法不涉及或不需要添加誘導物分子 來引發PHA過量產生和/或過量產生PHA合成酶。此外，在本申請的實踐中不必要在抗 生素存在下培養本發明的微生物，原因是已經出乎意料地發現所微生物中所引入的修飾 是穩定的，即使在不存在抗生素的情況下也是如此。這種抗生素包括但不限於亞碲酸鹽 (Tellurite)、利福平（Rifampicin)和卡那黴素（Kanamycin)。
[0051] 作為用於上述過程的碳原料，可以利用容易獲得的且便宜的可得自植物脂肪和植 物油的脂肪酸。這種脂肪酸的優選實施例包括飽和羧酸例如己酸、庚酸、辛酸和葵烯酸，以 及不飽和脂肪酸例如1-^^一碳烯酸、油酸或亞油酸。此外可以將多元醇用作原料，例如優 選甘油。
[0052] 本發明的另一方面涉及本發明的微生物、核酸、載體和/或細胞用於過量產生 PHA、尤其是中鏈長度PHA和/長鏈長度PHA的用途。
[0053] 附圖簡要說明
[0054] 圖1.以下細胞的電子顯微照片：PpU(a-c);未誘導的PpU10-33細胞（d-f)和經 誘導的PpU10-33細胞（g-i);未誘導的（j-1)和經誘導的（m-o)AphaZ-PpU10-33細胞。 培養物在含有35mM辛酸鈉作為碳源的修改MM培養基中生長（以15mM和20mM兩次給予） 並在31小時（&、(1、8、」、111)、48小時〇3、6、11、111)和72小時（〇、廠1、1、〇)取樣。
[0055] 圖2.pha基因的表達和P.PutidaU中PHA的累積。各柱狀圖顯示PpU(各個編號的 第一列）、非誘導的PpU10_33((a)和（c)中各個編號的第二列）、經誘導的PpU10-33((a) 和（c)中各個編號的第三列）、非誘導的AphaZ-PpU10_33((b)中各個編號的第二列）和經 誘導的AphaZ-PpU10-33((b)中各個編號的第二列）中pha基因表達的歸一化倍數增長。 在圖（c)中，還以帶圓點的直線（PpU)、下方的帶三角形的虛線（經誘導的PpU10-33)、圓 點（非誘導的PpU10-33)、上方的帶三角形的虛線（非誘導的AphaZPpU10-33)以及帶 矩形的虛線（經誘導的AphaZPpU10-33)顯示PHA濃度。
[0056] 圖3.P.putidaU中用於超表達phaC2的基因組織的兩部分系統。該圖顯示被整 合進染色體的兩個載體：pCNBlmini_Tn5xylS/Pm: :T7pol和pUTminiTn5-Tel_T7phaC2。
[0057] 圖4.以下微生物中隨著時間的PHA產生：野生型PpU(方形）以及非誘導的基因工 程構造PpU10-33(實心環形）、經誘導的PpU(空心環形）、非誘導的AphaZ-PpU10-33(實 心矩形）和經誘導的AphaZ-PpU10-33(空心矩形）。
[0058] 圖5.在存在和不存在相應抗生素的情況下，當在作為底物的辛酸鹽（20mM)和 MM+0. 1%YE培養基中培養時，PpU和PpU10-33-AphaZ的生物量和PHA產率。結果是指 複製數。
[0059] 在下文中，通過實施例的方式進一步說明本申請，但是所述實施例無意於以任何 方式限制本申請的範圍。 實施例
[0060] 實驗步驟
[0061] 在本工作中所使用的微生物和載體、細菌菌株、突變體和質粒匯總於附錄1中。
[0062] 培養基條件
[0063] 除非另有說明，大腸桿菌和惡臭假單胞菌在LuriaMillerBroth(LB)中培養並分 別在37°C和30°C下孵育。在需要的情況下，向培養基中加入的抗生素如下：利福平（Rf，固 體培養基中20ygmr1，液體培養基中5ygmr1)、卡那黴素（Km，固體培養基中25ygmr1， 液體培養基中12. 5ygml-1)、氨苄青黴素（Ap，100ygml-1)、亞碲酸鹽（Tel，100ygml-1)、 慶大黴素（Gm，30iigmr1)、氯黴素（Cm，30iigmr1)、異丙基-0-D-硫代半乳糖苷（IPTG， 70yM)和5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-0 -D-半乳糖苷（XGal，34ygmr1)。
[0064]DNA操控
[0065] 所有的基因程序按Sambrook&Russell(2001)所描述的進行。利用相應的Qiagen 試劑盒（德國）按照製造商的使用說明進行基因組和質粒DNA的提取、瓊脂糖凝膠純化和 PCR清洗。在本工作中使用的所有DNA修飾酶（限制性內切酶、DNA連接酶、鹼性磷酸酶 等）均購自NEB(美國麻薩諸塞州）。聚合酶鏈式反應（PCR)在Eppendorfvapo.protect ThermalCycler(德國）中進行。50y1PCR反應混合物由以下成分組成：2y1經稀釋的 染色體DNA(50ygmrllXPCR緩衝液和 2mMMgCl2(PROMEGA(：〇.，舊六）、0.211河的各引 物（Eurofinsmgw操縱子）、0.2mMdNTPs(Amersham，GEHealthcare,英國）、1.25UGo-Taq 熱啟動聚合酶（PROMEGACo.，美國）。PCR循環條件為：起始步驟96°C/10分鐘，隨後為 96°C/30秒至60°C/30秒、72°C/1分鐘的30個循環，最後補充72°C/5分鐘。通過三親本雜 交實驗將質粒轉移到假單胞菌菌株（Selvaraj&Iyer，1983 ;Herrero等人，1990)完成。簡單 地說，將帶有自殺質粒pCNBlmini_Tn5xylSPm: :T7pol或pUTminiTn5_Tel-phaC2 的E.coli CC18Apir供體菌株、E.coliRK600輔助菌株以及假單胞桿菌受體菌株分別培養8小時， 以0. 75:1:2的比例混合，用LB清洗兩次。在硝化纖維素濾器上收集懸浮液，並於30°C在 LB板上孵育過夜。然後將在濾器上生長的細菌重懸於3ml無菌鹽溶液（NaCl0.9%)中， 並將連續稀釋液接種於補充以相應選擇抗生素的LB瓊脂。將板於30°C孵育過夜，通過PCR 確認在板上生長的轉化結合子克隆。
[0066]DNA測序
[0067] 利用一組特定的寡核苷酸或通用引物M13F和M13R進行用於測序的PCR反應（附 錄3)。10y1反應混合物由6-12ng純化的PCR產物（或200-300ng質粒）、2y1BigDye ReadyReactionMix、lylBigDye測序緩衝液和lyl特異性引物（25yM)組成。循 環條件包括：起始步驟96°C/I分鐘，隨後96°C/20秒-52°C-58°C/20秒-60°C/4分鐘 的25個循環，和60°C/I分鐘的最後補充步驟。用雙脫氧鏈終止法確定核苷酸序列（Big DyeTerminatorv3.1 試劑盒，AppliedBiosystems，美國福斯特市）。用QiagenDyeEx 2.0SpinKit(德國）純化PCR產物。將團粒重懸於20yl水中，然後加載到ABIPRISM 3130遺傳分析儀（AppliedBiosystems，美國加利福尼亞州）。將所獲得的部分序列與非 冗餘核苷酸資料庫中的已知序列比對（www.ncbi.nlm.nih.gov)。利用Softberry(http:// linuxl.softberry.com/egi-bin/programs/gfindb/bprom.pi) >Prom-Scan(http: // molbiol-tools.ca/promscan/)和PDBG在線http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter,html)；以及Arnold(http://rna.igmors.u-psud.fr/toolbox/amold/index. php#Results)生物信息學工具來識別潛在的轉錄啟動子區域和端子。
[0068] phaC2超表達菌株PpU10-33的設計和構造
[0069]PpU10-33是惡臭固氮菌U衍生的，其中用17聚合酶啟動子：!7聚合酶系統來驅動 phaC2基因表達的額外拷貝。17聚合酶系統由兩個染色體整合的盒組成：一個含有從17聚 合酶啟動子表達的phaC2基因，另一個含有17聚合酶基因，該基因從Pm啟動子表達且受來 源於T0L質粒的同源苯甲酸酯/苯甲酸酯可誘導的XylS調節因子調節。phaC2盒構造如 下：將P.putitaU的phaC2 基因從pBBRlMCS-3-phaC2 質粒中切除（Arias等人，2008)，克 隆進pUC18N〇tI/I7載體（Herrero等人，1993)，並通過測序確認基因的正確取向。然後將 phaC2基因和T7啟動子作為盒轉移進入pUTminiTn5_Tel載體中（Sanchez-Romero等人， 1998)。首先，通過濾膜接合法將miniTn5衍生物pCNBlxylS/Pm: :I7pol轉移至P.putida U，然後通過Km選擇標記物進行選擇（Harayama等人1989 ;Herrero等人，1993)。由於轉座 子在基因組中的整合基本上是隨機的，並且不同插入位點可顯著地影響被插入的基因的轉 錄水平，所以準備了約100個轉移結合子的池用於第二次轉移。將該池的5mLLB培養物孵 育3小時（30°C，180rpm)，並使用受體的池用於pUTmini-Tn5-Tel-I7phaC2構造的轉移。通 過當轉移結合子轉化亞碲酸鹽（選擇標記物）時其顯示的黑色容易地對轉移結合子計分， 隨後通過PCR確認。隨後針對PhaC2和PHA(結果）的水平對兩個盒的插入位點不同的最 終受體計分，選擇最好的並將其指定為PpU10-33。
[0070]PpU10-33中phaZ的敲除與互補
[0071]通過利用 1983 年Quant&Hynes和 1991 年Donnenberg&Kaper描述的方法完成phaZ 基因的刪除，其涉及雙重組事件和通過致死sacB基因的表達來選擇所需要的突變體。首 先，通過GENERTAG(德國）合成在phaZ基因附近含有ORFs的DNA，其編碼PHaCl和PhaC2合 成酶；隨後將該基因克隆進含有Gm和SacB選擇標記物的PJQ200SK載體。然後將雜交質粒 通過三親本雜交引入PpUlO-33菌株。在含有Gm+km和Tel的板上選擇其中質粒通過單交換 整合進入染色體中的轉移結合子，並通過PCR確認。隨後在有10%蔗糖的LB板上選擇來源 於第二次重組的刪除突變體，對針對Gm的敏感度計分，並通過PCR進一步分析以確認刪除 的位置和程度。為此，使用了在用於同源重組的片段之外或之內退火的兩個不同啟動子組， 名稱分別為PhaCl-check-F/PhaC2-check-R和RT-phaZF_PpU/RT-phaZR_PpU。選擇了一 個刪除突變體並指定為AphaZPpU10-33。為了刪除突變體的互補，通過PCR(phaZ-F-KpnI lphaZ-R-Xbal)將phaZ基因（921bp)擴增，然後克隆進入pBBRlMCS-5載體中。針對其Gm 抗性選擇轉移結合子並進一步通過PCR確認。
[0072] 焚光顯微鏡法
[0073] 在1. 5ml微量離心管中將1毫升培養物與2滴尼羅紅二甲亞碸（0. 25mg/ml)溶 液混合，於4°C以6500轉每分鐘離心5分鐘。用2mlMgCl2(10mM)洗沉澱物兩次，重懸於 500y1溶液中，將5-10y1細胞懸浮液放置在顯微鏡載玻片上。利用裝備有Cy3濾鏡（EX 8? 550/25,85?1 570，已]\18? 605/70)(2￡155，>的，德國）和六叉1〇￥181〇11代14.6.3軟體 的ZEISSAxioImagerA1落射螢光顯微鏡可以看到PHA顆粒的存在和形貌。以1. 1秒的 曝光時間使細胞成像（Bassas等人，2009)。
[0074] 透射電子顯微鏡法
[0075] 在4°C下，在生長培養基中用2%戊二醛和5%甲醛固定細菌，用二甲砷酸鹽緩衝 液（0. 1M二甲砷酸鹽，0. 01MCaCl2,0. 01MMgCl2,0. 09M蔗糖，pH6. 9)衝洗，在室溫下用 1% 鋨水溶液鋨化1小時。然後將樣品在分級系列丙酮（10%、30%、50%、70%、90%、和100% ) 中脫水，每個步驟30分鐘。70%丙酮脫水步驟包括2%醋酸雙氧鈾，並且執行過夜。利用 根據用於固體樹脂的Spurr配方的環氧樹脂浸潤樣品，所述環氧樹脂為一種用於電鏡的低 粘度環氧樹脂包埋介質（Spurr，1969)。用純樹脂的浸潤進行數天。用金剛石刀切成超薄 切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛復染，在TEM910透射電子顯微鏡（CarlZeiss，德國）中以 80kV加速電壓檢查。利用線複製品以帶刻度的放大倍率拍攝圖像，並用具有ITEM-軟體 (OlympusSoftImagingSolutions,德國）的慢速掃描CCD-Camera(ProScan,l〇24xl〇24, Scheuring,德國）數位化地記錄。
[0076]RNA操控
[0077] 從生長階段過程中（處、711、2411、2711、3111、4811和5511)的培養物中取樣品（31111)並 立即與等體積的RNA保護緩衝液（Qiagen，德國）混合。室溫下孵育5分鐘後，將懸浮液以 13000轉每分鐘離心，棄去上清液，將沉澱物在-80°C保存。利用包括脫氧核糖核酸酶處理 的RNeasy迷你試劑盒（Qiagen，德國）按照製造商的使用說明提取總RNA。最後，在100y1 不含核糖核酸酶的水中洗脫RNA並保存在-80°C。RNA的完整度通過甲醛瓊脂糖凝膠電泳評 估，濃度和純度通過分光光度計確定（分光光度計ND-100，peQIab-bi〇techn〇l〇gieGmbH， 德國）。
[0078]cDNA利用10yg總RNA和隨機引物在20y1反應體系中進行。所有試劑（包括 SuperscriptIIIRT)購自Invitrogen(USA)且反應根據製造商的方案進行。將其中未添 加SuperscriptIIIRT的樣品用作陰性對照。在cDNA合成後，用1MNaOH將殘留的RNA 沉澱，以65°C孵育10分鐘，隨後在25°C孵育10分鐘。立即用KC1 1M平衡反應。然後利用 PCR純化試劑盒（Qiagen)將產生的cDNA純化，用分光光度計測量濃度和純度。用DEPC水 將cDNA稀釋至100ng/y1並在4°C保存。
[0079] 相對RT-PCR分析
[0080]藉助於引物 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)和OligoCalc(http:// www.basic,northwestern,edu/biotools/oligocalc.html)生物信息工具設計用於RT-PCR 分析（EurofinsmgwOperon,德國）的寡核苷酸，該寡核苷酸匯總於附錄2。各個組設計 成具有相似的G+C含量，因此具有相似的退火溫度（約60°C)，並具有大小不長於300bp的 擴增子，不存在預測的髮夾環、雙鏈體或引物-去引物（dimmer)結構。按照用於實驗設計 的MIQE指南（Bustin等人，2009)。首先，分析各組引物的最佳PCR條件，利用標準組樣品 (染色體DNA)作為模板確定退火溫度和引物濃度。通過熔點曲線分析和擴增條帶的凝膠 可視化確定引物特異性。用cDNA池確定引物有效性並在五個點上進行連續的4倍稀釋序 列以執行標準曲線。執行標準PCR方案，對每次稀釋執行三次。在所有情況下，所測量的 有效性在89%至100%之間。對於該分析，使用了CFX96?實時PCR檢測系統（Bio-Rad，美 國）和CFX管理軟體（版本1. 5. 534. 0511，Bio-Rad)。鑑於良好的變異係數值和約0. 5-1 的M值，利用存在於CFS軟體中的geNorm法並且考慮到在不同實驗條件之間和時間點之間 的目標穩定性來選擇用於數據歸一化的適宜參考基因。測試了數個候選基因，包括"管家" 基因0^1)、在一般代謝中涉及的其他基因（8]^、83口-141'〇(：141'〇02)、細胞分裂（1]1^13、 ftsZ)或信號功能（ffH)，最後選擇gltA和pr〇C2作為參考基因。對於相對RT-PCR，為了 數據歸一化，執行實驗的三個重複，包括總是在各個板中的內部校準器。將沒有cDNA的樣 品用作陰性對照。PCR反應含有 12. 5yl的iQ?SYBRGreenSupermix(2X) (Bio-Rad，美 國）、lyl正向引物（10yM)、lyl逆向引物（lOyM)、2yl〇0嫩(1/10稀釋），並用至多 20y1的milliQ水進行反應。PCR循環條件為：50°C/2分鐘和95°C/10分鐘，隨後95°C/15 秒-60°C/30秒-72°C/30秒，40個循環，最後補充72°C/10分鐘。在各個循環結束時測量 螢光。對於熔點曲線，設定初始變性步驟在95°C/10分鐘，隨後以0. 5°C/5秒從65°C增加 到95°C，然後繼續信號採集。用採用均數的標準偏差和歸一化表達方法（AA(Ct))的CFX 軟體（Bio-Road，美國）計算目標基因的相對表達比例。以表達的歸一化倍數增長來表示數 值。
[0081] 用於PHA產生的培養條件
[0082] 將3-苯甲酸甲酯（3-MB)作為用於通過Pm啟動子激活XylS轉錄激活因子的誘導 物，所述Pm啟動子驅動17聚合酶基因，其進而觸發phaC2合成酶的表達。為了確定用於 PpU10-33中phaC2表達/PHA合成的最佳條件，在不同條件下提高3-MB(從0. 2至3mM)、 誘導次數（〇D55Clnm 0.4-1.5)和碳源濃度。用在具有20mM琥珀酸鹽的MM瓊脂板上30°C下培 養過夜的細胞懸浮液接種於含有400mlMM修改培養基（Martinez-Bianco等人，1990)加 上0. 1%酵母提取物、15mM辛酸鈉以及合適的抗生素的錐形瓶。然後將錐形瓶以180轉每 分鐘在旋轉振蕩器（INFORSAG，瑞士）於30°C下孵育。一旦培養物0D55tol達到約0.8,將 培養物分成兩份（1升錐形瓶中含有200ml)，然後向錐形瓶中的一個添加3-MB至最終濃度 0.5mM。同時，第二次加入辛酸鈉（20mM)。對於野生型對照菌株，程序是相同的但是沒有誘 導。每24小時收集一次樣品並測定生物量（CDW，細胞乾重）、PHA、0D55tol、尼羅紅染色和NH4+ 濃度。對於CDW測定，樣品在80°C乾燥24小時，並以原始培養物的g/1表示。
[0083] PHA提取和純化
[0084]將培養樣品於 4°C以 6500xg離心 15 分鐘（Allegra25R,BeckmanCoulter,美 國），在蒸餾水中清洗沉澱物兩次，然後在-59°C和0. 140mbar下凍幹（Lyophilizeralpha1-4LSC，Christ,德國）。從生長期取5ml樣品以監測PHA產生並按如上所述凍幹。如前 所述的，用l〇ml氯仿於80°C提取經凍幹的生物量3小時（Basas-Galia等人，2012)。PHA 含量（重量％ )被定義為由PHA表示的CDW百分比。
[0085]NMR分析
[0086] 對於1H-NMR分析，將5-10mg聚合物溶解於0? 7ml的CDC13，使用5-10mg的聚合物 用於記錄13C譜。在300K下在BrukerDPX-300NMR波譜儀上記錄屯譜和13C譜，所述波譜儀 鎖定於溶劑⑶(：13的氘共振。以相對於溶劑信號的ppm給出化學位移（屮：7. 26,13C77. 3)， 以Hz給出耦合常數。全部使用標準Bruker脈衝程序。
[0087] 檢測PHA的分子量
[0088] 在具有色譜柱StyragelHR5E並裝備有2414示差檢測器（Waters，美國）的HPLC 系統中（Waters2695AllianceseparationsModule)，通過凝膠滲透色譜法測定平均分 子量。在45°C，以流速0. 5ml/分鐘（等度的），用四氫呋喃（THF)作為洗脫劑。樣品濃 度和進樣體積分別為〇. 5mg/ml和50y1。利用聚苯乙烯標準物試劑盒獲得分子量範圍在 10000-700000g/mol的標準曲線。
[0089]PHA的熱性能
[0090] 利用10_20mg用於分析的經純化的聚合物，通過差示掃描量熱法（DSC)測定微生 物聚醋的熱性能，用DSC-30(MettlerToledoInstruments，美國）執行DSC分析。將樣品 放置在鋁盤上，在氮氣條件下（80ml/分鐘）以10°C/分鐘從_100°C加熱至400°C。所有數 據是通過STARe系統採集和處理軟體（MettlerToledo)獲得。
[0091] 實施例1 :惡臭假單胞菌U中phaC2的超表達
[0092] 設計了兩部分的用於PpUPhaC2合成酶的基於微型轉座子的超表達系統，其由以 下兩部分構成：（i)特殊化的mini-Tn5,pCNBlxylS/Pm: :I7pol，其由XylS-3-苯甲酸甲醋 (3-MB)-調節的啟動子Pm表達17聚合酶；和（ii)雜交pUT-miniTn5-Tel衍生物，其由T7 聚合酶啟動子表達phaC2 (見圖3)。兩個微型轉座子組件單獨並隨機地插入P.putidaU(下 文中為"PpU"）染色體中。在兩輪篩選後選出最佳的PHA生產者，所述兩輪篩選涉及通過細 胞蛋白的SDS-PAGE分離來半定量PhaC2生產，和通過尼羅紅染色的細胞的螢光顯微鏡法檢 查PHA顆粒形成。該菌株被指定為PpU10-33。
[0093] 在下文中，將非誘導培養物稱作NI，將用0. 5mM的3-MB誘導的細胞成為I。分析 phaC2基因的劑量對重組菌株PpU10-33中PHA濃度的影響。培養物分別在具有辛酸鈉的修 改的麗中生長，所述辛酸鈉以15mM和20mM分兩次給予（第二次是在誘導時給予）。對於兩 個菌株PpU和PpU10-33均在48小時後達到峰值生物量生產（分別為3. 1和3. 2g1-1CDW)。 結果示於表1中：
[0094]表1 :菌株PpU、PpU10-33和PpU10-33-AphaZ的生物量產率
[0095]
【權利要求】
1. 一種天然產生PHA的微生物的基因工程形式，其與具有編碼聚羥基烷羧酸酯（PHA) 合成酶的至少一個基因的野生型微生物相比具有增加的拷貝數，其中所述增加的拷貝數提 供所述PHA合成酶的均衡性過量產生，並且其中所述基因工程使所述微生物在24小時後與 所述野生型相比以至少1.2倍的量來過量產生中鏈長度的PHA或長鏈長度的PHA，其中用於 評估所述過量產生的參考條件為含有15mM辛酸鈉的經修改的MM培養基。
2. 權利要求1中所述的基因工程微生物，其中所述基因編碼PhaC2合成酶或其同系物。
3. 權利要求1或2中所述的基因工程微生物，其中所述PHA合成酶的表達由啟動子系 統調節，所述啟動子系統優選為基於蛋白質的，更優選為T7聚合酶/T7聚合酶啟動子系統。
4. 權利要求1至3中任一項所述的基因工程微生物，其還在編碼所述微生物中的PHA 降解中涉及的蛋白質的至少一個基因中具有至少一個修飾，其中所述修飾使編碼所述PHA 降解中涉及的蛋白質的基因完全或部分失活，更優選地使所述基因完全失活。
5. 權利要求4中所述的基因工程微生物，其中所述PHA降解中涉及的蛋白質是PHA解 聚酶，優選地是PhaZ和其同系物。
6. 權利要求1至5中任一項所述的基因工程微生物，其中所述基因修飾在經繁殖和/ 或培養的所述微生物中被維持，優選地在不存在或存在抗生素的兩種情況下均被維持。
7. 前述權利要求中任一項所述的基因工程微生物，其中所述基因工程使所述微生物在 24小時後與野生型相比優選地以至少1. 5倍的量、更優選以至少2倍的量來過量產生中鏈 聚羥基烷羧酸酯PHA，其中用於評估所述過量產生的參考條件為含有15mM辛酸鈉的經修改 的麗培養基。
8. 前述權利要求中任一項所述的基因工程微生物，其中所述微生物選自惡臭假單 胞菌、綠膿假單胞桿菌、丁香假單胞桿菌、螢光假單胞桿菌、嗜酸假單胞菌、Pseudomonas olevarans、熱液海源菌、泊庫島食烷菌、不動桿菌屬、新月柄桿菌、真養產鹼菌屬、肥大產鹼 桿菌、棕色固氮菌、富養紅球菌、青紫色素桿菌或酒色著色菌，優選為惡臭假單胞菌菌株，更 優選為惡臭假單胞桿菌U。
9. 前述權利要求中任一項所述的基因工程微生物，其中所述微生物能夠在沒有添加誘 導物分子的情況下產生PHA。
10. 前述權利要求中任一項所述的基因工程微生物，其中所述微生物能夠產生為單個 細胞內顆粒形式的PHA。
11. 前述權利要求中任一項所述的基因工程微生物，其中所述微生物在暴露於含有辛 酸鈉的經修改的麗培養基24小時後能夠生產最大的PHA含量，並且優選地也能夠將在所 述最大的PHA含量±20重量％範圍內的PHA含量維持至少48小時的時間。
12. -種用於產生PHA的方法，其包括以下步驟： a. 培養權利要求1至11中任一項所述的微生物；和 b. 從培養基中回收PHA。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述方法不涉及或不需要添加用以引發所述微 生物中的PHA過量產生和/或PHA合成酶過量產生的誘導物分子，和/或不涉及或不需要 添加用以防止丟失基因修飾的抗生素。
14. 根據權利要求12或13所述的方法，其中所述PHA是利用具有3至8個碳原子的 酮、優選丙酮在60°C或更低的溫度下、優選地在20°C至40°C的溫度下通過提取來回收的。
15.權利要求1至11中任一項所述的基因工程微生物用於過量產生中鏈長度PHA和/ 或長鏈長度PHA的用途。
【文檔編號】C12N1/20GK104520433SQ201380019207
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年4月11日 優先權日:2012年4月11日
【發明者】薩格拉裡奧·阿里亞斯, 莫尼卡·巴薩斯, 加布裡埃爾·莫裡納瑞, 肯尼思·奈傑爾·蒂莫斯 申請人:赫姆霍爾茲傳染病研究中心有限責任公司