以stat3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型及其構建和應用的製作方法
2023-04-26 17:14:26
專利名稱：以stat3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型及其構建和應用的製作方法
以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型及其構建和應用技術領域
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型，尤其涉及一種以具有組成型STAT3活性細胞為基礎的抗腫瘤藥物篩選細胞模型；本發明同時還涉及該抗腫瘤藥物篩選細胞模型的構建方法和應用。
背景技術：
信號轉導及轉錄激活因子3 (STAT3)作為重要的轉錄因子在癌症的發生和發展中發揮著重要的的作用，被公認為是癌症相關蛋白。在許多腫瘤細胞中，如結腸癌、乳腺癌、 神經膠質瘤細胞、肺癌、頭頸部癌等等細胞中，STAT3常常以持續活化的形式存在，STAT3受到上遊信號細胞因子刺激或在某些酪氨酸激酶持續活化的狀態下，其C端705位酪氨酸被磷酸化而形成二聚體，進而入核調節轉錄，啟動一系列基因的調控，在促進細胞轉化、轉移、 防止凋亡方面發揮多重作用。通常胞外調節STAT3的細胞因子的有IL-6，LIF, OSM, EGF, PDGF，G-CSF等，胞內維持STAT3持續活性的因素來自於上遊受體或非受體酪氨酸激酶的持續活化或自身突變。研究表明，抑制STAT3活性將會大大降低多種腫瘤細胞的生長、生存和轉移，從而大大降低它們惡性程度(Ni等人Cancer Res 2000 ； Leong等人Proc Natl Acad Sci 2003 ； Barton 等)κ Mol Cancer Ther 2004 ； Kortylewski 等)κ Nat Med 2005 ； Xin等人Cancer Res 2009)。此外研究表明，在不少腫瘤細胞中，STAT3可以促進和維持NF-κ B的活性，而NF-κ B則是腫瘤發生和轉移的另一重要促成因素，在這一類腫瘤中抑制STAT3活性，不僅抑制了 STAT3本身調控的腫瘤相關基因，也在一定程度上下調NF- κ B 的活性，達到一點雙靶的目的(Yang J等人Cancer Res 2005 ； Yang J等人Genes & Dev 2007 ； Torres J等人Nat Cell Biol 2008 ；Lee H等人Cancer Cell 2009 ；Yu H等人 Nat Rev Cancer 2009)。
目前基於STAT3為靶點的藥物篩選系統通常具有效率低下、步驟繁瑣等缺點，例如每次篩藥都需要使用外源細胞因子例如白細胞介素6 (IL-6)和白細胞抑制因子(LIF)激活細胞內STAT3，額外的步驟將使篩藥系統的穩定性大大降低，成本也因IL-6或LIF的使用將大大增加。發明內容
本發明的目的是針對現有技術中存在的問題，提供一種以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型。
本發明的另一目的是提供一種以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型的構建方法。
本發明還有一個目的，就是提供一種以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型在抗腫瘤藥物篩選中的應用。
(一)以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型本發明以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型，是利用含有STAT3特異性結合序列的報告系統載體，以具有組成型STAT3活性細胞為基礎，構建成穩定的以STAT3信號為靶點高通量抗腫瘤藥物篩選細胞模型。
所述STAT3的特異性結合序列為5』 -TT (C/A) CNNNAA-3，，N為鹼基。
所述報告系統載體是在含有螢光素酶報告基因的報告載體多克隆位點中插入包含有STAT3特異性結合序列作為報告系統載體的響應序列，構建成的報告系統載體。
所述具有組成型STAT3活性細胞為DU145前列腺癌細胞、H1299人肺癌細胞、AM9 人肺癌細胞、HCTl 19人結腸癌細胞、Hela人宮頸癌細胞、MCF-7人乳腺癌細胞、MDA-MB-468 人乳腺癌細胞或MDA-MB-231人乳腺癌細胞等等。
(二)以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型的構建。
本發明以STAT3為靶點的藥物篩選細胞模型的構建，包括以下工藝步驟(1)報告系統載體構建利用分子生物學方法在含有螢光素酶報告基因的報告載體多克隆位點中插入包含有STAT3特異性結合序列以及3』端含有TATA盒序列的DNA片段， 作為報告系統載體的響應序列，構建成報告系統載體。插入序列位於螢光素酶報告基因的上遊，當STAT3活化時，便可增強螢光素酶報告基因的轉錄和螢光素酶翻譯，從而增強了螢光素酶的活性，加入螢光素酶底物時即可檢測到更強的螢光；抑制STAT3活性時，螢光素酶報告基因的轉錄和螢光素酶翻譯的水平都降低，也就抑制細胞內螢光素酶的活性，加入螢光素酶底物時螢光強度也就減弱。
(2)細胞模型的構建將報告系統載體轉染具有組成型STAT3活性細胞後，用嘌呤黴素進行陽性克隆篩選，選取對已知STAT3信號抑制劑(如PD-180970，等已知特定細胞中 STAT3上遊信號抑制劑)有響應的克隆，即為以STAT3為靶點的藥物篩選細胞模型。
在具有組成型STAT3活性的細胞中，報告系統載體能很好地被活化，當使用STAT3 信號通路抑制劑時即可使螢光被顯著抑制，構建的細胞模型也就無需在外源刺激下靈敏地用於高通量藥物篩選。
(三)以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型在抗腫瘤藥物篩選中的應用。
本發明以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型用於篩選由STAT3組成型活化造成的癌變及腫瘤的治療藥物。具體篩選抗腫瘤藥物的方法包括以下工藝步驟(1)將所述抗腫瘤藥物篩選細胞模型用100μ 1培養基接種於96孔板中，培養至細胞匯合度為30% 40% ；(2)在培養基中加入待篩選化合物0.1μ廣2μl，繼續培養 小時；(3)在上述96孔板中加入50μ 1穩定型螢光素酶底物，使用螢光/化學發光分析儀測定螢光強度並分析螢光抑制率，當螢光抑制率達到40%以上得到初篩產物；(4)以化合物細胞毒性實驗消除化合物對細胞模型的直接損傷，螢光抑制率達仍在40% 以上得到復篩產物，即為以STAT3為靶點的抑制藥物。
本發明相對於現有技術具有以下優點以STAT3信號通路為靶點，採用基於具有組成型STAT3活性(即持續STAT3活性)的細胞係為策略，使報告系統本身在細胞中處於高度活化狀態，得到的穩定細胞模型，無需使用外加刺激，可直接用於化合物的篩選；不僅大大降低了篩選的成本，同時也使整個篩選流程從「細胞培養一激活STAT3 —加化合物一檢測」簡化為「細胞培養一加化合物一檢測」，縮短了篩選的周期，減少了操作步驟，提升了系統的穩定性、高效性及易用性，更適用於高通量藥物篩選。
圖1為使用Western-Blot方法檢測本發明所涉及的細胞中STAT3活性結果。
圖2為使用凝膠電泳阻抑試驗(EMSA)檢測本發明所涉及的細胞中STAT3活性結^ ο
圖3為所用報告載體基本骨架。
圖4為所構建的報告系統載體SIE-Iuc插入序列的測序結果圖。
圖5為利用細胞檢測報告系統載體SIE-Iuc響應能力。
圖6為使用Western-Blot方法檢測A549細胞在已知抑制劑PD180970處理後的 STAT3活性變化。
圖7為抗腫瘤藥物篩選細胞模型AM9R對STAT3活性降低或升高的響應。
圖8為使用Western-Blot方法檢測所篩的化合物3412對STAT3活化的抑制能力。
具體實施方式
下面以A549細胞為例，本發明抗腫瘤藥物篩選細胞模型的結構、構建方法和應用作進一步說明。
實驗中所採用的儀器和試劑如下儀器=PerkinElmer Victor3螢光/化學發光分析儀。
試劑性內切酶、T4 DNA連接酶購自！^rmentas公司；引物合成及測序，上海生工提供；DMEM (高糖)及胎牛血清購自Hyclone (Thermo公司)，轉染試劑Ger^scort II購自南京慧基生物；螢火蟲螢光素酶測定試劑盒購自Promega公司；IL-6購自P^rotech公司；PD180970及Puromycin購自Sigma-Aldrich公司；用於篩藥的96孔板購自Corning 公司；待篩選的化合物來自國家小分子化合物資源中心；各種抗體購自Cell Signaling Technology 公司。
1、報告系統載體構建將人工合成的包含的16個SIE (即STAT3特異性結合序列)以及通用的TATA盒輔助序5，-TATATAA-3，的DNA片段，以KpnI和HindIII的酶切位點插入到通用的螢光素酶報告載體pBR322-luC-puro，得到的報告系統載體命名為SIE_luc。上述STAT3特異性結合序列包含 8 個 5，-TTCCCGTAA-3，(M67 序列，hyperactive mutated form of SIE )， 8個5，-TTCCTGTAA-3，(來自Ly6E基因)交替連接，兩種元件對STAT3都具有高度特異的親和力。螢光素酶報告載體pBR322 - Iuc - puro由pBR322載體HindIII和Ml I 之間插入北美螢火蟲螢光素酶(Firefly Luciferase，參見J R de Wet等人Mol. Cell. Biol. 1987)報告基因和嘌呤黴素基因(Puromycin，參見Lacalle RA等人Gene. 1989， GenBank :M25346. 1)所得，並且螢光素酶報告基因和嘌呤黴素篩選基因通過內部核糖體進入序列(IRES)相連，嘌呤黴素基因終止密碼子下遊有AATAAA序列為poly A加尾信號。 pBR322-luc-puro多克隆位點位於原EcoR I和Hind III之間(參見圖3)。
至此，在pBR322-luC-puro螢光素酶報告載體上的完整插入序列如下(測序結果見圖4)
2、報告系統載體性能測試由於細胞對各種外源細胞因子的刺激比較敏感，便於在外加細胞因子刺激時檢測相應信號通路的活化情況，所以使用該細胞作為代表檢測報告系統載體是否響應正常。 結果(見圖5)表明，在相應信號通路活化時所使用報告系統載體響應正常，刺激後與刺激前螢光素酶活性的比例約為18. 7 :1，其中細胞使用IL-6刺激激活。將細胞於12 孔板生長至50% 70%密度，轉染SIE-Iuc (2 μ g/孔)，載體與轉染試劑的使用比例為1 2 (即2 μ g質粒，4 μ 1轉染試劑，各溶於50 μ 1 DMEM無血清培養基，混合成100 μ 1預混液，室溫靜置20 min，再加入150 μ 1無血清DMEM，混勻後加入12孔板各孔內)4小時後換成完全培養基(即含有10%胎牛血清的DMEM培養基)，12小時以後，用IL-6 (250 ng/ ml)處理24小時，吸去培養基，加入200 μ 1裂解液裂解細胞，輕搖lOmin，取150 μ 於96 孔板中，加入20 μ 1普通螢火蟲螢光素酶底物，使用螢光/化學發光分析儀立即測定(Imin 以內)螢光素酶的活性，對照及處理各3個重複，並獨立重複試驗3次(***，ρ<0. 001)。
3、藥物篩選模型細胞選擇通過Wiestern-Blot及EMSA凝膠阻抑實驗分析細胞中STAT3的活性，得到多種適用與本報告系統載體的STAT3活性高(無需額外使用IL-6等細胞因子刺激細胞)的腫瘤細胞系(圖1，圖2)，圖1為使用Western-Blot方法檢測本發明所涉及的細胞中STAT3活性結果。結果表明包括AM9在內的一系列腫瘤細胞比正常細胞具有更高的STAT3活性，以 STAT3第705位酪氨酸(Tyr705)的磷酸化表徵，標註為「pTyr705-STAT3」，磷酸化水平越高，活性越高。圖2為使用凝膠電泳阻抑試驗(EMSA)檢測本發明所涉及的細胞中STAT3活性結果。表明圖1中所用幾種腫瘤細胞活化的STAT3都比正常細胞HMEl具有更高的DNA 結合能力。其中，HME1，人乳腺表皮細胞(正常對照細胞);DU145，前列腺癌細胞；H印G2，人肝癌細胞；H1299和A549為人肺癌細胞，HCT119，人結腸癌細胞；Hela，人宮頸癌細胞；MCF-7、 MDA-MB-468和MDA-MB-231為人乳腺癌細胞。
4、藥物篩選模型構建及性能測試將SIE-Iuc轉染AM9細胞(IOcm培養皿)48小時後，1傳3，並加入puromycin 進行陽性克隆篩選，初始濃度為5 yg/ml,2周後降為2.5 yg/ml。待形成克隆(共約3 周)後，用胰酶消化單克隆於96孔板，長起後再轉入48孔板，6孔板直至10 cm培養瓶和凍存，期間用終濃度為2.5 yg/ml puromycin的繼續維持2周。首選選取螢光素酶陽性的克隆，再檢測這些克隆是否響應正常；雖然是組成型活化，細胞一般還能對外加細胞因子有所反應，故所選陽性克隆的螢光素酶活性在外加IL-6刺激時應當還能有所增加。經過驗證，外加IL-6 (250 ng/ml)刺激時還能使該細胞模型STAT3活性提升2. 5倍
權利要求
1.以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型，其特徵在於利用含有STAT3特異性結合序列的報告系統載體，以具有組成型STAT3活性細胞為基礎，構建成穩定的以STAT3信號為靶點高通量抗腫瘤藥物篩選細胞模型。
2.如權利要求1所述以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型，其特徵在於所述 STAT3的特異性結合序列為5』 -TT(C/A)CNNNAA-3', N為鹼基。
3.如權利要求1所述以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型，其特徵在於所述報告系統載體是在含有螢光素酶報告基因的報告載體多克隆位點中插入包含有STAT3特異性結合序列作為報告系統載體的響應序列，構建成的報告系統載體。
4.如權利要求1所述以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型，其特徵在於所述具有組成型STAT3活性細胞為DU145前列腺癌細胞、H1299人肺癌細胞、A549人肺癌細胞、 HCTl 19人結腸癌細胞、Hela人宮頸癌細胞、MCF-7人乳腺癌細胞、MDA-MB-468人乳腺癌細胞或MDA-MB-231人乳腺癌細胞。
5.如權利要求1所述以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型的構建方法，包括以下工藝步驟(1)報告系統載體構建利用分子生物學方法在含有螢光素酶報告基因的報告載體多克隆位點中插入包含有STAT3特異性結合序列以及3』端含有TATA盒序列的DNA片段， 作為報告系統載體的響應序列，構建成報告系統載體；(2)細胞模型的構建將報告系統載體轉染具有組成型STAT3活性細胞後，用嘌呤黴素進行陽性克隆篩選，選取對STAT3信號抑制劑有響應的克隆，即為以STAT3為靶點的藥物篩選細胞模型。
6.如權利要求1所述以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型用於篩選由STAT3組成型活化造成的癌變及腫瘤的治療藥物。
7.如權利要求6所述以STAT3為靶點的抗腫瘤藥物篩選細胞模型用於篩選由STAT3組成型活化造成的癌變及腫瘤的治療藥物，其特徵在於所述篩選抗腫瘤藥物的方法包括以下工藝步驟(1)將所述抗腫瘤藥物篩選細胞模型用100μ 1培養基接種於96孔板中，培養至細胞匯合度為30% 40% ；(2)在培養基中加入待篩選化合物0.1μ廣2μl，繼續培養 小時；(3)在上述96孔板中加入50μ 1穩定型螢光素酶底物，使用螢光/化學發光分析儀測定螢光強度並分析螢光抑制率，當螢光抑制率達到40%以上得到初篩產物；(4)以化合物細胞毒性實驗消除化合物對細胞模型的直接損傷，螢光抑制率達仍在40% 以上得到復篩產物，即為以STAT3為靶點的抑制藥物。
全文摘要
本發明提供了一種以STAT3為靶點的藥物篩選細胞模型，屬於生物醫藥領域。該模型利用含有STAT3特異性結合序列的報告系統載體，以具有組成型STAT3的活性細胞為基礎構建而成，用於篩選由STAT3組成型活化造成的癌變及腫瘤的治療藥物。由於採用具有組成型STAT3活性的細胞，模型細胞中報告基因處於高度活化狀態，無需使用外加刺激物，得到的穩定細胞模型可直接用於化合物的篩選，不僅大大降低了篩選的成本，同時也使整個篩選流程從「細胞培養→激活STAT3→加化合物→檢測」簡化為「細胞培養→加化合物→檢測」，縮短了篩選的周期，減少了操作步驟，提升了系統的穩定性、高效性及易用性，更適用於高通量藥物篩選。
文檔編號C12N15/85GK102517373SQ20111042300
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者杜宇平, 楊金波, 王勤, 陳星 申請人:蘭州大學