獲取用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記方法

2023-04-26 16:41:26 1

專利名稱：獲取用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記方法
技術領域：
本發明涉及一種雜交稻的分子標記技術，特別是一種獲取用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記的方法。
背景技術：
普通「三系」雜交稻是有由不育系、保持系和恢復系配套而成。其中，恢復系的作用就是使雄性不育性狀在F1代育性得到完全恢復，該基因是位於恢復系細胞核內的特異恢復基因。由於恢復基因的恢復性常常受到年度之間，甚至年度內抽穗時間的前後差異的影響，導致恢復性評價不準確；所以育種家不得不通過「初測」、「複測」、「再測」等多次重複來評價恢復株系的恢復性，即便如此也很難確保它的準確性。因此，在育種實踐中對恢復系恢復基因的確認十分困難，尤其是對優良恢復基因的鑑別，這樣嚴重限制了育種資源的充分利用。
專家學者一致認為分子標記方法是實現作物快速、高效育種的手段。它不受環境因素變化的影響，結果可靠；其技術的核心是獲得與育種目標性狀緊密連鎖的分子標記，通過PCR技術實現其輔助育種的目標。就水稻作物而言，現已獲得了不少與質量性狀緊密連鎖的分子標記，並得到了廣泛應用；在雜交水稻方面，通過許多努力也獲得了一些與水稻恢復基因相關的分子標記；然而這些分子標記有的與恢復基因連鎖不夠緊密，所以至今無法應用於雜交育種中。

發明內容
針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供一種獲取用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記方法。
本發明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現的提供一種獲取用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記方法，包括以下步驟1)、在「三系」雜交稻中收集8～10個生產中常用的優良恢復系，與另一組8～10個恢復率在20～65％的育種中間材料作為參照；2)、對上述優良恢復系和育種中間材料分別進行種植和基因組DNA的提取；3)、採用常規AFLP分子標記方法，進行AFLP分子標記；尋找所有優良恢復系與對照之間存在一致的多態性的DNA片段，稱為目標片段；4)、採用DNA克隆法克隆上述目標片段，並進行序列測定；5)、根據上述序列測定結果，設計能擴增該目標片段的PCR引物。
本發明的獲取用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記方法，步驟3)的AFLP分子標記方法，具體為嚴格按照PROMAGA化學試劑公司提供的AFLP試劑盒和方法，應用E-2或E-3分別與M-3的64～128對引物組合，進行PCR擴增反應；再用8～10％聚丙烯醯銨凝膠，300～350V電泳2小時後，用0.1～0.2％硝酸銀染色法染色，記錄結果。
步驟4)的DNA片段的克隆和測序，具體為採用常規T載體克隆方法，對特異片段進行克隆。然後再將上述片段克隆、轉化到大腸桿菌中，完成序列測定。
步驟5)引物設計，具體為利用常用的PCR引物設計程序「DNASIS」，在上述序列的特異性片段範圍內，設計引物長度為19～25bp，GC控制在35～50％之間，退火溫度57～62℃，設計出一對正向和反向引物。
本發明的獲取方法及所獲得的用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記，具有如下優點1)、利用本發明的方法能有效地獲得與恢復系的高恢復性狀密切連鎖的分子標記；2)、本發明的方法利用另一組8～10個恢復率表現為20～65％的育種中間材料為有效參照；所獲得的分子標記能將一些具有一定恢復能力、但達不到要求的恢復基因與優良的恢復基因區分開來，充分滿足生產應用要求；3)、本發明的方法採用不同遺傳背景、又有相同目標性狀的多個材料為研究對象，使最終獲得的分子標記更有較廣泛的代表性；4)本發明的方法選取大面積生產應用的品種為研究對象，其研究結果即所得的分子標記具有更大的實用性。
具體實施例方式
實施例1、一種獲取用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記方法，依次進行以下步驟1)、研究材料收集生產應用的恢復系「明恢63」、「密陽46」、「桂99」、「IR26」、「9308」、「川農527」、「蜀恢162」、「秈粳一號」、「多系一號」和「J413」這10份，它們的恢復度在85％以上，作為優良恢復系。
參照為已穩定的育種中間材料，分別是「鄂貝啦」(恢復度20％左右)、「R-892」(恢復度25％左右)、「R-1326」(恢復度為40％左右)、「T-47」(恢復度42％左右)、「培矮64」(恢復度45％左右)、「T-761」(恢復度45％左右)、「R-902」(恢復度50％左右)、「R-961」(恢復度55％左右)、「R-47」(恢復度60％左右)、「T-886」(恢復度為63％左右)和「R-156」(恢復度為65％左右)這10份。
2)、對上述優良恢復系和育種中間材料分別按常規方法進行浸種、播種、移栽種植，以及進行基因組DNA的提取。
DNA樣品製備具體為在移栽22天後，每份材料取幼葉5.0克，放入液態氮中冰凍、研磨成粉狀，轉入12ml 65℃預熱的提取液中保溫20分鐘(提取液50Mm pH8.0 Tris，500Mm NaCl，10Mm EDTA，1％SDS，0.1％β-mercaptalethanol)，再加入等體積的氯仿(氯仿∶異戊醇＝24∶1)混勻；在常溫下，低速振蕩15分鐘後，以12000轉/分速度離心15分鐘，取上清液，加入2/3體積的異丙醇沉澱DNA；取出絮狀DNA，用70％乙醇清洗二次，讓其自然乾燥後，加入500μl pH8.0TE緩衝液溶解、定量，待用。
3)、AFLP分子標記嚴格按照PR0MAGA化學試劑公司提供的試劑盒和方法，應用E-2或E-3和M-3的64對全部引物組合，進行PCR擴增反應；再用10％聚丙烯醯銨凝膠，300V電泳2小時後，用0.2％硝酸銀染色法染色。結果獲得DNA多態性條帶1233條，其中由E-ACA和M-ATT引物所擴增的多態性條帶中，分子量約為1.5KB位置的一條多態性片段顯示，所有10個優良恢復系樣品中均表現為陽性(有該片段出現)，而對照的10個樣品呈現陰性(無該片段)，這說明該條帶與優良恢復系的恢復性性狀存在緊密的連鎖關係，即所有優良恢復系與對照之間存在一致的DNA多態性。
4)、連鎖片段克隆
採用常規T載體克隆和TAKARA公司提供的方法，對特異片段進行克隆、轉化到大腸桿菌中。
5)、測序與引物設計為了獲得該特異性DNA片段的分子標記，對該片段進行鹼基序列測定，該項工作可委託INVITROGEN公司完成。根據INVITROGEN公司提供的測序結果，採用「DNASIS」計算機分析程序設計出一對引物(1)正向引物是5』ATTTCTACGGCGTCCAATGA3』其特徵為長度20bp，GC含量45％，退火溫度61.0℃；(2)反向引物是5』CTTGTAGGAAACCTCAAGATATTG3』其特徵為長度24bp，GC含量37％，退火溫度61.2℃；並委託SONGON公司合成設計此引物。
為了證明本發明的優點，發明人對所得的引物特異性進行了如下的檢測1、PCR擴增分別選用步驟2)所得的20份樣品，每份5.0μl(20ng/μl)與15.0μl PCR反應液(2.0μl 10x緩衝液，1.6μl 25mM dNTP，2.0μl 25mM MgCl2，和0.3μl設計的引物(1)，0.3μl設計的引物引物(2)，0.2μl 5U/μlTaq DNA聚合酶，8.6μl雙蒸水)混合，進行PCR反應第一步94℃預變性保溫3分鐘；第二步94℃保溫45秒，59℃保溫60秒，72℃保溫80秒，並依次循環36次；第三步72℃延伸保溫5分鐘，結束反應。
2、凝膠電泳配製1.2％葡聚糖凝膠，將20μl PCR反應後的樣品放入凝膠孔中，6伏特/釐米的電壓進行穩壓電泳60分鐘；取出凝膠，放入1.0μg/ml溴化乙錠溶液中，染色15分鐘；放在254nm紫外燈下，結果顯示優良恢復系的10個品種均出現1.5KB明顯的擴增條帶，而參照沒有。因此本發明設計的分子標記對優良恢復系具有特異性。
實施例2、利用本發明所得的分子標記，進行鑑定「三系」雜交稻是否為優良品種，依次進行以下步驟1、選擇已知的優良恢復系「IR24、TP32、楊R、4663-5、中恢9331、多恢一號和測253」作為待鑑定的品種。然後按照常規方法對其進行浸種、播種、移栽種植，作為材料。
2、DNA樣品製備等同於實施例1。
3、引物特異性檢測PCR擴增等同於實施例1；凝膠電泳等同於實施例1。結果顯示出現1.5KB明顯的擴增條帶。
為了證明本發明的創造性，發明人還作了如下的對照實驗應用常規分子標記方法，通過「汕優63」的F2代分離群體進行基因定位和分子標記，獲得的分子標記結果顯示1)在「汕優63」群體內，分子標記與恢復性狀的連鎖強度為91.2％。然而在「汕優64」，「汕優9331」組合中，其連鎖強度僅為71.6％。2)將該標記用於其它恢復系恢復性狀的檢測，可靠性更低。
以上實驗證明使用本發明的方法能有效地鑑定出「三系」雜交稻恢復系恢復性狀的分子標記，達到目的。而現有方法則不行。
最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
序列表SEQ ID NO1atttctacgg cgtccaatga 20SEQ ID NO2cttgtaggaa acctcaagat attg 2權利要求
1.一種獲取用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記方法，其特徵是包括以下步驟1)、在「三系」雜交稻中收集8～10個生產中常用的優良恢復系，與另一組8～10個恢復率在20～65％的育種中間材料作為參照；2)、對上述優良恢復系和育種中間材料分別進行種植和基因組DNA的提取；3)、採用常規AFLP分子標記方法，進行AFLP分子標記；尋找所有優良恢復系與對照之間存在一致的多態性的DNA片段，稱為目標片段；4)、採用DNA克隆法克隆上述目標片段，並進行序列測定；5)、根據上述序列測定結果，設計能擴增該目標片段的PCR引物。
全文摘要
本發明公開了一種獲取用於鑑定「三系」雜交稻恢復系性狀的分子標記方法，包括以下步驟1)在「三系」雜交稻中收集8～10個生產中常用的優良恢復系，與另一組8～10個恢復率在20～65％的育種中間材料作為參照；2)對上述優良恢復系和育種中間材料分別進行種植和基因組DNA的提取；3)採用常規AFLP分子標記方法，進行AFLP分子標記；尋找所有優良恢復系與對照之間存在一致的多態性的DNA片段，稱為目標片段；4)採用DNA克隆法克隆上述目標片段，並進行序列測定；5)根據上述序列測定結果，設計能擴增該目標片段的PCR引物。利用本發明的方法，能有效地獲得與恢復系的高恢復性狀密切連鎖的分子標記。
文檔編號A01H1/02GK1884582SQ20061005174
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月31日 優先權日2006年5月31日
發明者劉小川, 陳集雙 申請人:浙江理工大學