一種甲胺磷人工抗原的製備方法

2023-04-26 12:32:51 1

專利名稱：一種甲胺磷人工抗原的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種甲胺磷人工抗原的製備方法，具體是採用重氮化法將甲胺磷與蛋白質分子偶聯製備甲胺磷人工抗原的方法，屬於免疫技術領域。
背景技術：
甲胺磷(Methamidophos，MTP)又名多滅靈，分子式=C2H8NO2PS,分子量141，化學名稱0，S-二甲基氨基硫代磷酸酯。甲胺磷作為廣譜高效的有機磷殺蟲劑，曾廣泛用於世界各地，主要用於小麥、水稻、棉花等農作物害蟲的防治。國家農業部和國家發改委下達公告決定從2008年1月1日起停止甲胺磷生產，從根本上杜絕甲胺磷等5種高毒農藥在國內的銷售和使用。但是，這些農藥在全國範圍內仍然時有檢出，已成為果蔬中農藥殘留的主體農藥，由此導致的安全事件依然屢屢發生，對人體健康造成了極大的危害。因此很有必要建立適用於現場檢測的快速、便捷的有機磷農藥殘留檢測方法。目前對甲胺磷的檢測方法主要有氣相色譜(gas chromatography，GC)、薄層色ill (thin layer chromatography, TLC)、1 效液才畫色i普(high performance liquid chromatography, HPLC)等。這些方法大多需要對被分析樣品進行前處理，且操作複雜，不能滿足現場快速檢測的要求。開發特異性強、靈敏度高、方便快捷、安全廉價的新分析技術極為迫切。甲胺磷分子量141，屬於小分子物質，不具備免疫原性。必需與載體蛋白偶聯合成人工完全抗原才能進一步用於製備多克隆抗體。國家專利局2003年7月公開的申請號為03114895. 6的專利涉及一種適用於甲胺磷殘留分析的酶聯免疫吸附測定試劑盒，對盒內試劑及測定方法進行了說明，但未涉及甲胺磷人工抗原的製備方法。國家專利局於2001年12月公開的申請號為01114706. 7的專利涉及一種甲胺磷人工抗原的製備，是將甲胺磷的前體產物0，S-二甲基硫化磷醯氯與蛋白質上的氨基基團直接偶聯而獲得人工抗原。2005年12月公開的申請號為200510126412. 0的專利也涉及一種甲胺磷半抗原、人工抗原及其製備方法，以0，S- 二甲基硫化磷醯氯為前體合成甲胺磷的結構衍生物(半抗原)該衍生物在保留甲胺磷結構的基礎上引入橋結構和用於偶聯大分子的活性基團。但該發明製備人工抗原步驟較繁瑣。

發明內容
本發明的目的在於提供一種甲胺磷人工抗原的製備方法，為以後篩選出它的特異性抗體和建立免疫分析方法奠定基礎。本發明選用重氮化法，在弱酸環境下，利用亞硝酸鹽先將甲胺磷分子上的氨基轉化為重氮基團，再在鹼性環境中利用重氮基團與蛋白質上的羧基反應將甲胺磷小分子與蛋白質分子偶聯。在重氮鍵合成時，保持微酸環境，重氮溶液加入到蛋白質溶液中，緩慢連續攪拌可以使其反應充分，增加偶聯物的結合比。
本發明依次通過以下步驟實現
(1)將牛血清白蛋白BSA溶於pH9.0的硼酸鹽緩衝液中，使BSA濃度達到0. 01 0. 03g/
mL ；
(2)將甲胺磷溶於0.01mol/L的HCl溶液中，使甲胺磷濃度達到0. 01 0. 05g/mL，冰浴，邊攪拌邊緩慢加入預冷的0. lmol/L亞硝酸鈉溶液，直至澱粉碘化鉀試紙變藍，繼續攪拌反應30 60min ；
(3)將步驟(2)溶液緩慢加入到步驟(1)溶液中，使牛血清白蛋白與甲胺磷的摩爾比為 1 500 1000，冰浴攪拌2h，4°C反應24h後，置於pH7. 4的磷酸鹽緩衝液中透析3 5d，每 12h換一次透析液；最後冷凍乾燥，即得到合成的甲胺磷人工抗原。上述方法中，蛋白質是牛血清白蛋白(BSA)，也可以用卵清蛋白(OVA)或辣根過氧化酶(HRP)代替。本發明的優點是採用重氮化法，操作簡便，試劑價廉，比一般方法節省成本15%， 並且一步完成反應，人工抗原製備的效率提高3 % 5 %。
具體實施例方式實例1
取IOOmgBSA溶於IOmL pH9. 0的硼酸鹽緩衝液中；
取IOOmg甲胺磷溶於IOmL 0. 01mol/L的HCl溶液中，冰浴，邊攪拌邊緩慢加入預冷的 0. lmol/L NaNO2溶液，直至澱粉碘化鉀試紙變藍，繼續攪拌反應30min ；然後將該溶液緩慢加入到BSA溶液中，冰浴攪拌》i，4°C反應24h後，置於pH7. 4的磷酸鹽緩衝液中，透析3d， 每1 換一次透析液，最後將透析液冷凍乾燥即得合成的甲胺磷人工抗原(簡稱MTP-BSA)。根據測得的紫外吸光值，計算各個結合物的結合比，並根據測得的磷含量計算各個偶聯物的濃度。經過計算，MTP-BSA中分子的結合比為14. 17:1，可用於動物免疫。甲胺磷人工免疫抗原(MTP-BSA)與原載體蛋白BSA紫外圖譜比較，MTP在221nm處有最大吸收峰，BSA在237. 5nm及276. 5nm處有最大吸收峰，而人工抗原MTP-BSA的最大吸收峰則位於229. 5nm及278nm處，偶聯物與其前體物質有不同的紫外吸收特徵。紅外圖譜比較，BSA的紅外光譜呈現了蛋白質類的共有吸收，在3406 cm"1,1639 cm—1、1570CHT1處有醯胺結構的特徵吸收；MTP的光譜在1206 cm—1、1044 cm—1及940CHT1處呈現甲氧基和硫氧基的特徵吸收；而偶聯物MTP-BSA在醯胺結構、甲氧基以及硫氧基的特徵吸收帶均有特徵吸收， 說明偶聯物MTP-BSA同時具備了 BSA和MTP的吸收峰，更進一步說明人工抗原合成成功。實例2:
取150mg0VA溶於IOmL pH9. 0的硼酸鹽緩衝液中；
取200mg甲胺磷溶於IOmL 0. 01mol/L的HCl溶液中，冰浴，邊攪拌邊加入預冷的 0. lmol/L NaNO2溶液，直至澱粉碘化鉀試紙變藍，繼續攪拌反應45min，然後將該溶液緩慢加入到BSA溶液中，冰浴攪拌》i，4°C反應24h後，置於pH7. 4的磷酸鹽緩衝液中，透析5d， 每1 換一次透析液，最後將透析液冷凍乾燥即得合成的甲胺磷包被抗原(簡稱MTP-0VA)。包被抗原(MTP-OVA)與MTP紫外掃描圖比較，OVA在230. 5nm及278nm處有最大吸收峰，MTP在221nm處有最大吸收峰，MTP-OVA的最大吸收峰在227. 5nm及279nm處，與OVA 和MTP的最大吸收峰皆有偏移。OVA的紅外光譜呈現了蛋白質類的共有特徵吸收，MTP的光譜在1206 cm"1,1044 cm—1及940CHT1處呈現甲氧基和硫氧基的特徵吸收；而偶聯物MTP-OVA 在醯胺結構、甲氧基以及硫氧基的特徵吸收帶均有特徵吸收，兼具蛋白質和甲胺磷的吸收特徵，進一步說明人工抗原合成成功。實例3:
取300mgHRP溶於IOmL pH9. 0的硼酸鹽緩衝液中；
取500mg甲胺磷溶於IOmL 0. 01mol/L的HCl溶液中，冰浴，邊攪拌邊加入預冷的 0. lmol/L NaNO2溶液，直至澱粉碘化鉀試紙變藍，繼續攪拌反應60min，然後將該溶液緩慢加入到BSA溶液中，冰浴攪拌》i，4°C反應24h後，置於pH7. 4的磷酸鹽緩衝液中，透析4d， 每1 換一次透析液，最後將透析液冷凍乾燥即得合成的甲胺磷包被抗原(簡稱MTP-HRP)。酶標半抗原(MTP-HRP)與MTP紫外掃描圖比較，HRP在206. 5nm處有最大吸收峰， MTP在220nm處有最大吸收峰，MTP-HRP的最大吸收峰在212nm處，與HRP和MTP的最大吸收峰皆有偏移。紅外圖譜中，偶聯物MTP-HRP在醯胺結構、甲氧基以及硫氧基的特徵吸收帶均有特徵吸收，兼具蛋白質和甲胺磷的吸收特徵，進一步證明人工抗原合成成功。
權利要求
1.一種甲胺磷人工抗原的製備方法，其特徵在於，依次通過以下步驟實現(1)將牛血清白蛋白BSA溶於pH9.0的硼酸鹽緩衝液中，使BSA濃度達到0. 01 0. 03g/mL ；(2)將甲胺磷溶於0.01mol/L的HCl溶液中，使甲胺磷濃度達到0. 01 0. 05g/mL，冰浴，邊攪拌邊緩慢加入預冷的0. lmol/L亞硝酸鈉溶液，直至澱粉碘化鉀試紙變藍，繼續攪拌反應30 60min ；(3)將步驟(2)溶液緩慢加入到步驟(1)溶液中，使牛血清白蛋白與甲胺磷的摩爾比為 1 500 1000，冰浴攪拌2h，4°C反應24h後，置於pH7. 4的磷酸鹽緩衝液中透析3 5d，每 12h換一次透析液；最後冷凍乾燥，即得到合成的甲胺磷人工抗原。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，牛血清白蛋白BSA用卵清蛋白OVA或辣根過氧化酶HRP代替。
全文摘要
一種甲胺磷人工抗原的製備方法，選用重氮化法，在弱酸環境下，利用亞硝酸鹽先將甲胺磷分子上的氨基轉化為重氮基團，再在鹼性環境中利用重氮基團與蛋白質上的羧基反應將甲胺磷小分子與蛋白質分子偶聯。在重氮鍵合成時，保持微酸環境，重氮溶液加入到蛋白質溶液中，緩慢連續攪拌可以使其反應充分，增加偶聯物的結合比。本發明操作簡便，試劑價廉，比一般方法節省成本15％，並且一步完成反應，人工抗原製備的效率提高3％～5％。
文檔編號C07K14/77GK102241766SQ20111014980
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月7日 優先權日2011年6月7日
發明者朱開祥, 李垚辛, 杜小粉, 董全 申請人:西南大學