一種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法
2023-04-26 10:44:16
專利名稱：一種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法
技術領域：
本發明涉及ー種基於氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS法)快速檢測動物樣品中脂肪酸含量的方法。
背景技術：
脂肪酸是構成人體脂肪和類脂的基本物質，是細胞膜磷脂的重要成分，直接調節細胞膜的組成及蛋白質與膜內受體。脂肪酸根據飽和度的不同可分為飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)。短鏈SFA可調節腸道運動，促進結腸細胞増殖，也可増加腸道黏膜損傷處的循環血流，促進腸道黏膜結構和功能的恢復；另外，短鏈飽和脂肪酸可治療轉流性結腸炎、遠段潰瘍性結腸炎和放射性結腸炎。此外，SFA攝入過多增加高胰島素(Ins)血症的風險以及患乳腺癌的危險。MUFA可降低血漿總膽固醇和LDL的水平，降低血小板的聚集率,減少機體內自由基脂質超氧化物的作用，也具有降低血壓的作用。MUFA改善了內皮白細胞黏附因子的基因表達，從而可預防動脈粥樣硬化，降低患冠心病的危險性。MUFA還能起到降血糖的作用，另夕卜，因為MUFA是神經元細胞膜組成成分，它能維持神經元細胞膜完整性，因此MUFA可防止記憶下降。PUFA是腦的成長、細胞間相互作用，第二信息向こ醯膽鹼的應答及神經傳導功能等腦功能發育不可缺少的物質，可用於治療精神分裂症。另外，不飽和脂肪酸有利於膜的流動性，更有利於胰島素(Ins)的透膜吸取及與受體的結合。在正常情況下人體內脂肪酸是ー穩定的化學組分，處於相對平衡，生物體內脂肪酸的改變能誘導神經生理、認知和其他行為的變化，尤其是必需脂肪酸含量的改變。而某些脂肪酸(如亞油酸，亞麻酸等高級脂肪酸)對人體保健極為重要，但人體又不能自行合成，根據測定含量的高低，可通過飲食營養加以調節，提高人們的健康和防止疾病的發生。血漿中游離脂肪酸的測定是先將脂肪酸與Cu2+作用，以氯仿萃取後用銅試劑測定Cu2+的濃度，進而得到游離脂肪酸的含量，該方法不僅繁瑣，而且只能測定脂肪酸總量。氣相色譜法雖然具有高分離能力，但對脂肪酸定性鑑定時要有標準物質對照，無標樣時測定較困難。另外，脂肪酸組分複雜，難以分離，傳統方法通常採用酸水解、鹼水解以及皂化法等，步驟繁瑣，所需樣品量大，不適用於科研、臨床中微量樣品的檢測。
發明內容
本發明的目的在於提供一種簡單、快速、實時的氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，特別適合對動物組織中微量樣品的檢測。為達到上述目的，本發明採用了以下技術方案I)樣品準備將IOmg動物組織剪碎後得樣品，將樣品置於螺ロ玻璃瓶中；2)提取、皂化及甲酯化將質量分數為37%的濃鹽酸與2，2- ニ甲氧基丙烷按照0. 02 0. 98的體積比混合得濃鹽酸2，2-ニ甲氧基丙烷溶液，向螺ロ玻璃瓶內的樣品中分別加入20 ii L質量濃度為lmg/mL的內標物石油醚溶液，以及ImL濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，然後充氮氣保護下震蕩20min，震蕩後用氮氣將螺ロ玻璃瓶內的液體吹乾，吹乾後向螺ロ玻璃瓶內加入2. 5mL質量分數為13%的三氟化硼甲醇溶液，然後將螺ロ玻璃瓶於80-85 °C水浴中加熱I小吋；3)加熱結束後向螺ロ玻璃瓶內加入2. 5mL去離子水，然後用石油醚萃取2次，取石油醚層，將石油醚層用無水Na2SO4乾燥，乾燥後過濾得濾液，將濾液減壓濃縮至體積不再減少得檢測樣，向檢測樣充入氮氣進行保護；4)採用氣相色譜-質譜聯用儀對檢測樣內的脂肪酸進行測定；5)數據分析及樣品鑑定經過步驟4)後，根據獲得的原始光譜數據及質譜數據，計算檢測樣內各脂肪酸組分的相對含量以及絕對含量。
所述動物組織包括大腦、肝臟、腎臟、心臟、血液或肌肉組織。所述動物組織的來源包括小鼠、大鼠、比格犬、恆河猴、豬、牛、雞、鴨、魚或人。所述氣相色譜的工作條件為檢測樣溶於500 L正己烷後上樣，進樣量為I U L，進樣方式為不分流，載氣為流速I. 5mL/min的氦氣，升溫程序為初始溫度為60°C，保持4min,然後以5°C /min升至150°C,然後以4°C /min升至300°C,保持5min。所述質譜的工作條件為採用EI源、正離子檢測，電子能量為70eV，離子源溫度為230°C，單四級杆溫度為150°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍增器電壓為1070V，溶劑延遲為 3. 75min。所述相對含量採用面積歸ー化方法進行計算。所述絕對含量的計算方法為脂肪酸組分對應的峰面積與內標物峰面積的比值乘以內標物的濃度。所述內標物包括十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十ー烷酸或二十三烷酸。本發明所述氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法與傳統常用的動植物、微生物油脂檢測方法相比，具有以下優點I)本發明利用2，2-ニ甲氧基丙烷-濃鹽酸對動物組織中脂類進行提取和皂化，將提取與皂化合併，簡化了操作步驟，再利用三氟化硼甲醇溶液甲酯化獲得脂肪酸甲酷，最後利用石油醚提取脂肪酸組分，檢測組織的樣品用量與現有技術相比顯著降低，提高了檢測的靈敏度，同時，每批次樣品檢測僅需要約2小時左右，節省了人力、物力、財力，可以達到快速檢測的目的，提高了工作效率。2)本發明可同時測定動物組織中幾乎所有的脂肪酸，碳數從碳9到碳26，分子量從100到400，且對功能性的多不飽和脂肪酸(PUFA)如含有1-6和雙鍵或三鍵的PUFA具有非常好的分離和定性、定量檢測效果；同時，對於具有相同碳數、相同分子量，而結構不同的PUFA的同分異構體(在生理調解和體內信號轉導等方面具有非常重要的作用)，本方法具有獨特的優勢；同時，本發明可對不同樣品間的脂肪酸組成及含量進行比較，應用性更廣，為科研實驗、臨床應用及食品質量和安全監測中對動物樣品脂肪酸組成及含量的快速檢測提供新的思路和方法。3)本發明採用質譜儀作為氣相色譜的檢測信號，與普通的FID和T⑶檢測器相比有兩大優勢其一是靈敏度高，且沒有校正因子的影響，色譜峰的峰面積真正代表了試樣中脂肪酸甲酯的質量，這ー優點對於未知脂肪酸的定量檢測尤為重要；其ニ是檢出限低，本發明直接檢測的信號是物質的質荷比(m/z)，與氫火焰離子和熱導檢測器相比，省去了將離子濃度(FID)或導熱係數(TCD)轉化為濃度的步驟，因此，不但降低了檢測限，而且還縮短了響應時間。另外，本發明解決了氣相色譜法(GC)定性定量分析檢測脂肪酸所需標準品數量眾多且價格昂貴等問題。
圖I為小鼠肝臟樣品GC-MS檢測的總離子流圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作進ー步說明，以昆明小鼠肝臟中脂肪酸的檢測為例，但本發明的保護範圍不局限於該實驗。本發明提供了一種基於分步ー鍋法提取及氣相色譜-質譜聯用法檢測微量動物脂肪酸含量的方法，具體步驟如下 一、樣品準備將取得的小鼠髒肝組織至於冰凍緩衝液中保存；準確稱量10. OOmg ( ±0. 02mg)的肝臟組織，剪至Imm左右，然後將樣品置於5mL的螺ロ玻璃瓶中。檢測實驗中該螺ロ玻璃瓶可替代傳統的加熱回流裝置，其具有以下特徵體積小，所需樣品量少(I-IOmg),有較好的密封效果(具螺ロ瓶蓋且耐壓0. 2-0. 3Mpa)。 ニ、樣品的提取、皂化及甲酷化取IOmg十七燒酸溶於石油醚(60-90), IOmL容量瓶定容,配置成lmg/mL的十七燒酸石油醚溶液，作為內標物標準液；將質量分數為37%的濃鹽酸與2，2-ニ甲氧基丙烷按照0.02 0.98的體積比混合得2%的濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液；向螺ロ玻璃瓶內的樣品中分別加入20 ii L質量濃度為lmg/mL的十七烷酸石油醚溶液，以及ImL濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，然後充氮氣保護、室溫下於SK-I漩渦振蕩器上震蕩20min，震蕩後用氮氣將螺ロ玻璃瓶內的液體(反應中產生的丙酮、甲醇以及2，2-ニ甲氧基丙烷)吹乾，吹乾後向螺ロ玻璃瓶內加入2. 5mL質量分數為13%的三氟化硼甲醇溶液，然後將螺ロ玻璃瓶於80-85°C水浴中加熱I小時；加熱結束後向螺ロ玻璃瓶內加入2. 5mL去離子水，然後用石油醚萃取2次，取石油醚層，將石油醚層用無水Na2SO4乾燥，乾燥後過濾得濾液，將濾液於循環真空水泵上減壓濃縮(減壓濃縮條件為常溫、-0. OlMpa)至體積不再減少，得檢測樣品，衝入氮氣保護。與其他的甲酯化方法相比，本發明採用的方法具有以下優點a酷化時間短，相同條件下，HCl甲醇溶液反應需兩小時；b反應易處理，若採用硫酸催化，因其強氧化性，則需要増加一歩水洗處理；c皂化產物較少，更真實的反應脂肪酸的實際含量，相對於鹼催化的酯化方法，本發明幾乎沒有皂化產物。三、分離、檢測色譜檢測採用安捷倫7890A/5975C，檢測樣溶於500 y L正己烷後上樣；
①分析柱是HP-5MS彈性石英毛細管柱(30m*0. 25id*0. 25um)；②載氣氦氣,流速為I. 5mL/min ； ③進樣量I y L，可自動進樣，也可手動進樣，進樣方式為不分流；④進樣ロ溫度290 0C，傳輸線溫度300 °C ；⑤程序升溫，初始溫度60°C,保持4min,以5°C /min升至150°C,然後以4°C /min升至300°C，保持5min ；質譜①EI源，正離子檢測，電子能量為70eV ；
②離子源溫度230°C，單四級杆溫度150°C ;③掃描方式為全掃描方式；④電子倍增器電壓1070V，溶劑延遲3. 75min ；四、數據分析及處理色譜圖的保留時間和積分面積由工作站自動完成，利用NIST08譜庫定性色譜峰。各脂肪酸組分的相對含量通過面積歸ー化法得到；絕對含量由對應的峰面積和內標物峰面積的比值乘以內標物的濃度得到。參見圖1，本檢測樣中可辨認的脂肪酸甲酷的峰為18個，其餘峰為小分子溶劑、化合物或膽固醇等留體。可辨認的脂肪酸甲酯及其保留時間列於表I。保留時間及峰面積用安捷倫Chemstation計算,相對含量用面積歸ー化的方法計算,絕對含量(mg/g組織)採用與內標物標準液脂肪酸C17:0的峰面積比獲得。表I.小鼠肝臟中脂肪酸的含量
權利要求
1.一種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，其特徵在於包括以下步驟 1)樣品準備將IOmg動物組織剪碎後得樣品，將樣品置於螺ロ玻璃瓶中； 2)提取、皂化及甲酯化將質量分數為37%的濃鹽酸與2，2-ニ甲氧基丙烷按照0.020. 98的體積比混合得濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，向螺ロ玻璃瓶內的樣品中分別加入20 u L質量濃度為lmg/mL的內標物石油醚溶液，以及ImL濃鹽酸2，2- ニ甲氧基丙烷溶液，然後充氮氣保護下震蕩20min，震蕩後用氮氣將螺ロ玻璃瓶內的液體吹乾，吹乾後向螺ロ玻璃瓶內加入2. 5mL質量分數為13%的三氟化硼甲醇溶液，然後將螺ロ玻璃瓶於80-85°C水浴中加熱I小時； 3)加熱結束後向螺ロ玻璃瓶內加入2.5mL去離子水，然後用石油醚萃取2次，取石油醚層，將石油醚層用無水Na2SO4乾燥，乾燥後過濾得濾液，將濾液減壓濃縮至體積不再減少得檢測樣，向檢測樣充入氮氣進行保護； 4)採用氣相色譜-質譜聯用儀對檢測樣內的脂肪酸進行測定； 5)數據分析及樣品鑑定經過步驟4)後，根據獲得的原始光譜數據及質譜數據，計算檢測樣內各脂肪酸組分的相對含量以及絕對含量。
2.根據權利要求I所述ー種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，其特徵在於所述動物組織包括大腦、肝臟、腎臟、心臟、血液或肌肉組織。
3.根據權利要求2所述ー種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，其特徵在於所述動物組織的來源包括小鼠、大鼠、比格犬、恆河猴、豬、牛、雞、鴨、魚或人。
4.根據權利要求I所述ー種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，其特徵在於所述氣相色譜的工作條件為檢測樣溶於500 UL正己烷後上樣，進樣量為Iy L，進樣方式為不分流，載氣為流速I. 5mL/min的氦氣，升溫程序為初始溫度為60°C，保持4min，然後以5°C /min 升至 15CTC,然後以 4°C /min 升至 30CTC,保持 5min。
5.根據權利要求I所述ー種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，其特徵在於所述質譜的工作條件為採用EI源、正離子檢測，電子能量為70eV，離子源溫度為230°C，單四級杆溫度為150°C，掃描方式為全掃描方式，電子倍増器電壓為1070V，溶劑延遲為3.75min。
6.根據權利要求I所述ー種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，其特徵在於所述相對含量採用面積歸ー化方法進行計算。
7.根據權利要求I所述ー種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，其特徵在於所述絕對含量的計算方法為脂肪酸組分對應的峰面積與內標物峰面積的比值乘以內標物的濃度。
8.根據權利要求7所述ー種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，其特徵在於所述內標物包括十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十ー烷酸或二十三烷酸。
全文摘要
本發明提供一種氣相色譜-質譜聯用檢測脂肪酸含量的方法，選擇GC-MS技術對動物樣品中脂肪酸含量進行檢測，是為了解決在實際生產、科研工作中，傳統方法中樣品處理步驟繁瑣且價格昂貴等問題，具體步驟包括1)動物組織樣品的處理；2)提取、皂化和甲酯化脂肪酸；3)確定GC-MS檢測脂肪酸的條件；4)數據分析及樣品鑑定。本發明對動物組織中的脂肪酸含量進行檢測具有操作簡單，檢測限低，實驗重現性好，實驗數據直觀可靠等特點，特別適用於微量樣品檢測，並可對不同樣品間的脂肪酸組成及含量進行比較，應用性更廣，為科研實驗、臨床應用及食品質量和安全監測中對動物樣品脂肪酸組成及含量的快速檢測提供新的思路和方法。
文檔編號G01N30/02GK102749396SQ201210247480
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月17日 優先權日2012年7月17日
發明者陳福欣, 龔頻 申請人:陝西科技大學