基於陣列的生物分子分析方法
2023-04-26 10:31:56
專利名稱：基於陣列的生物分子分析方法
技術領域：
本發明涉及生物分子樣品的分析，特別是蛋白質。
背景技術：
在最近的文獻中關於「蛋白質晶片」的發展的討論已經很多了。廣意上講，這些是蛋白質陣列(一般稱作微陣列)。以目前的想像蛋白質微陣列將能夠同時檢測幾千個蛋白質、蛋白質-蛋白質間的相互作用、小分子間相互作用和酶底物反應。
目前多數研究是開發一種基於將蛋白質固定在基板上的蛋白質晶片，典型地是用表面化學來固定蛋白質。晶片的基板可以是矽晶片，但是例如鋁晶片和玻璃等其它材料也已經用作或提出用作該基板。基板製備之後，需要在晶片上附著蛋白質捕獲劑，例如抗體。在由一個加利福尼亞的公司，ZyomyxInc.，提出的一項研究中，用薄的有機膜塗覆基板，將附著用的標記物加在有機層上面，例如抗體片段或多肽等，蛋白質捕獲劑則鍵合在標記物的自由末端。
目前的策略是在晶片表面用什麼來形成塗層，例如抗體，或者在某些情況下，用親和捕捉分別純化了的已知的表達蛋白，並隨後固定。
還提出了其它塗層抗體的方法。但是，塗層抗體或其它蛋白質捕獲劑的任務還很複雜。進一步的問題在於蛋白質不象DNA那樣牢固，並且易斷裂，如果不小心處理它們，則會變性。蛋白質對於特定基板的物理和化學特性還極其敏感。
現有的「蛋白質晶片」的主要缺點如下。首先，蛋白質必須鍵合在晶片上陣列的位置中。如上所述，這通常使用排成陣列的抗體，例如，製造緩慢並昂貴的單克隆抗體或使用排成陣列的抗原來實現。但是，鍵合的抗原和鍵合的抗體的特異性不高。
第二個問題是單一抗體的使用不能顯現蛋白質具有多種異構體的問題。可能不是所有的異構體都具有生物活性。存在生物活性異構體被非活性異構體所掩蓋的可能性。
主要問題是在樣品中的大量蛋白質由於與陣列的非特定鍵合而產生高背景「噪聲」。
一個解決方案，重組抗原的使用，並不產生可信的修飾，因為重組蛋白質將幾乎肯定會對真正的蛋白質產生不同的翻譯後修飾。因此，不能確信在蛋白質晶片上的相互作用就類似於在真正的蛋白質和，例如，其它蛋白質之間發生的「真正的」相互作用。
本發明試圖應對並緩和上面討論的現有技術的問題。
發明內容
在本發明的第一方面包括產生大分子的陣列並隨後將大分子陣列轉移到支撐物上的步驟。該步驟產生一個主陣列或宏陣列。該工藝的一個主要優點是可以排列和固定真正的大分子，而沒有任何在現有技術的「蛋白質晶片」中所需的固定過程的任何化學方法。
本發明工藝的下一個步驟是一般通過使用圖像捕獲來定義坐標，將試劑的第二(或微)陣列「列印」到捕獲的主陣列的每個坐標上。執行該功能的設備在標題為「分子分析(Analysis of Molecules)」的澳大利亞專利No 722578中作了介紹。其中描述了一種設備用於捕捉在平面支撐物上的點的陣列的圖像，並用該圖像驅動列印頭到特定的點以便將試劑塗覆到該點。
大分子在此指包括了任何從由蛋白質、多肽、糖類、脂類、核酸分子、包括糖蛋白的複雜生物分子及其混合物構成的組中選擇的任何生物分子。
生物分子最好用色譜法分離，以形成樣品陣列。色譜法最好是電泳，更優選在聚丙烯酸胺凝膠中進行的電泳。
電泳可以在一維中進行，包括採用等電聚焦電泳、自然聚丙烯醯胺凝膠電泳和十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳。或者，聚丙烯醯胺凝膠電泳可在二維中進行，第一維為等電聚焦電泳，第二維為自然聚丙烯醯胺凝膠電泳或SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳。
只要可能，最好利用非變性電泳分離工藝，因為這將產生更為可靠的自然陣列，而不是變性的蛋白質。
支撐物可以是由聚偏二氟代乙烯、硝化纖維素、尼龍、特氟隆、zitex、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)及其具有一個或多個功能基的衍生物製成。
圖像分析可以確定在微陣列中可以實際列印的點的最大數量，並且確定在宏陣列中每種分子的各自點-點的解析度。
識別相互作用是特異的或非特異的工藝為採用公有領域的方法。
但是，可以應用列印過程中一個獨特的性質非特異性相互作用被衝洗而形成外部暈圈，而特異性相互作用仍集中在沉積的坐標上。因此，特異性相互作用的存在或其它情況可通過是否存在暈圈而揭示出來。
蛋白質可以用標記物等直接標記，或用夾層技術，例如第二抗體螢光標記來檢測。
在該工藝中的下一個步驟，使用檢測裝置檢測是否在蛋白質點和由化學印表機塗覆的一種或多種試劑之間發生了相互作用。檢測可以由任何合適的方法進行，例如球形捕捉透鏡如CCD、照相機、掃描或雷射掃描、顯微鏡方法等。
在可選實施例中，可以直接驅動檢測裝置到微陣列的每一個坐標。
可以預見，本發明的工藝可用於批量方式純化含有親合標記的表達蛋白質。例如，一批比如384克隆表達的特定但不同的His-標記可在IMAC(固定金屬親合色譜(immobilished metal affinity chromatography))柱上純化。然後，柱的洗出液(即，所有384克隆)可以用二維電泳排成陣列並轉移到基板，從而產生非預先確定陣列。這直接與現有技術的依賴於保持預先確定的陣列並保持位置信息的教義相矛盾。該例子的一個優點是表達蛋白質的陣列將通過與預知產品的比較來提供對表達產品的質量控制(例如，預測的Mr和pI與觀察到的Mr和pI相比)。
本發明與現有技術相比的主要優點是產生真正的蛋白質陣列而不需要已有的蛋白質晶片所需的用於表面的化學固定。
在一個特徵中，包含在主陣列的圖像中的信息可以用於限定列印在主陣列上的微陣列的類型。例如，分析的特定點的尺寸可以用來確定類型，以及分配到點上的試劑的間隔。例如，具有20微滴的試劑的8×8陣列可以列印到具有200微米直徑的點上，試劑點間隔25微米，或者列印道更大的400微米的點，上試劑點間隔50微米。
由於在沉積系統中具有足夠的精度，所以可以在主陣列的各個位置上列印非常高密度的陣列，並且精確的光學纖維應當能夠識別微小相互作用。
在一個特殊的優選特性中，將多個蛋白水解酶作為微陣列放在宏陣列的特定的蛋白質點上將是有利的。例如，在500微米直徑的蛋白質點上，多種蛋白內切酶(胰蛋白酶、LysC內切酶、GluC內切酶和Asp-N內切酶，優選酶為胰蛋白酶和GluC)的微陣列列印為間隔200微米的200微米大小的點群(中心到中心)。點的尺寸和間隔足夠小，從而通常MALDI-TOF-MS氮雷射束(100微米)可以定位，從而只釋放出在宏陣列的點中的一個特定酶反應的分析物。該特徵的優點是在MALDI-TOF-MS對宏陣列蛋白質的點進行分析的過程中，多種蛋白酶的微陣列將增加多肽覆蓋範圍。
下面將只通過例子的方式並結合附圖介紹本發明的特定實施例，其中圖1示出了已經被二維電泳分離並轉移到支撐膜上的蛋白質陣列；圖2示出了用於在圖1所示的陣列中已識別的蛋白質點的上面沉積一系列微陣列小點的化學印表機；圖3示出了圖1中所示的一個點的放大，在該點上沉積了一個微陣列；
圖4是一個概要的示意圖，示出了通過得到或記錄在陣列中的至少一個組分或樣品位置的圖像以從複合物或樣品的點陣獲得信息的過程，並利用記錄的圖像以便允許至少一個組分或樣品的原位操作。
圖5是用於成像、操作和分析複合物或樣品陣列中的至少一個組分或樣品的設備的概要的圖示。
圖6A到6C示出了用來夾緊硝化纖維膜的設備；圖7A和7B示出了在38kDa TB抗原上的微噴射(micro-jetting)抗TB陰性或陽性的人血清的結果；圖8示出了在有或沒有直接藍著色(Direct Blue Staining)的變性的38kDa TB抗原上微噴射抗TB陰性或陽性的人血清的結果；圖9示出了用雙面膠帶粘附到Axima MALDI目標片上的膜印跡B745；以及圖10是由沉積在其上的矩陣中的胰蛋白酶和GluC內切酶消化的蛋白質的放大圖。
具體實施例方式
在本發明中，分餾蛋白質的混合物以去掉大量多餘的蛋白質並在窄範圍的pH梯度下，以溶解異構體(一維電泳)。可以使用多室電解槽(multicompartment electrolyser)進行分餾工藝，正如在國際專利申請NoPCT/AU00/01391中所介紹的，引入其整個內容作為參考。代替一維電泳，將去掉多餘蛋白質的樣品用二維電泳分離，形成如圖1所示的陣列(10)，然後用印跡電泳將陣列轉移到例如硝化纖維的膜上。現在蛋白質陣列被固定並且準備作為「晶片」處理。應當注意，陣列不是預先確定的，並且不需要在當時就確定所產生的陣列中哪種蛋白質位於陣列上的哪個位置。
圖1示出了圈出的蛋白質點12。該工藝的下一個步驟是在蛋白質點上印上試劑陣列。這通過使用在AU 722578中介紹的化學印表機來實現，下面參考圖4和5來介紹。
圖4示出了印表機系統功能的概要圖示。系統包括陣列100、圖像採集系統200、圖像分析系統300、計算機400、x、y、z可調平臺500、多化學藥劑分配控制單元600、多頭分配和貯存器700、分析儀控制單元800、分析儀900和數據分析站910。
陣列100定位在x、y、z可調平臺上面或臂500的下面，得到圖像200並作為數字圖像傳送到計算機400。該圖像或者由圖像分析系統300將陣列的每個組分的坐標轉換為反映真正的x、y、z的值；或者，不進行轉換，用存儲在計算機400中的圖像，使在陣列100中的一個特定組分的坐標驅動裝載有分配頭(噴射裝置)700的x、y、z可調平臺或臂500。由計算機控制的化學分配控制單元600控制分配頭700，在陣列100中選定的樣品上分配試劑。當完成處理時，使用在陣列100中的被處理組分的坐標移動裝載有分析儀900的x、y、z可調平臺或臂500。分析儀900在分析控制單元800的控制之下，當操作人員通過計算機400選定它時，分析儀900對處理過的選定的樣品100進行分析。數據分析和管理系統910校對分析得到的數據，該系統與來自圖像分析系統300在陣列中的每個樣品的等同轉換坐標相關聯。
如圖5所示，x、y、z可調平臺、化學藥劑分配控制單元、分配頭和貯存器以及分析儀，都在計算機的控制之下。陣列102固定到平臺502上。通過數位相機202得到陣列102的圖像。陣列102由照相機的閃光燈或外部的鎢燈206照明。圖像從照相機202傳送到計算機402。圖像處理並輸入到「click-on-a-spot」軟體。該處理將圖像像素坐標翻譯成自控裝置坐標。然後用「click-on-a-spot」軟體通過x、y移動杆504驅動分配裝置702移動到陣列中被選定的樣品。通過分配裝置支撐單元506在z軸方向移動分配裝置702。直接與分配裝置702連接604的化學分配控制單元602通過計算機402的控制從試劑貯存器508分配試劑。
圖2示出了分配裝置702以印表機頭14的形式移動到蛋白質點12上方，在點12上沉積試劑點。印表機利用壓電列印，在不接觸點的情況下，在點上面留下非常少量的液體(p1數量級)。
使用在AU 722578中介紹的並在上面重複的技術，列印頭14利用之前產生的陣列圖象所提供的陣列中特定點的x、y坐標而直接移動到這些點上。
圖3示出了沉積在蛋白質點12上的4×4的試劑陣列的圖像。
因此，與現有技術相比，本發明的蛋白質晶片提供真正的蛋白質陣列、具有解析異構體問題的能力和去除多餘蛋白質的技術。一個特定的被正視(envisage)的技術是使患者產生抗體並將患者的血清列印到蛋白質陣列上。
使用本發明的用途還包括用抗體來篩選新抗原、測定多肽/蛋白質的相互作用和蛋白質/蛋白質的相互作用。
實施例1本實施例的目的是在硝化纖維的基板上用純化的結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis(TB))抗原來確定患者對TB的免疫反應的研究中開發一種用來微分配人血清的化學列印(chemical printing)技術，該血清對於TB即可能呈血清反應陰性也可能為陽性。應當理解，該方法可以通過使用適當的抗原將患者的免疫反應明確為多種條件和疾病。
材料和方法1.1由兩個患者分離的人類血清，其中一個對TB的血清反應陰性，另一個為陽性，分別用pH 7.4，加入0.05％(w/v)疊氮化鈉、0.1％(v/v)Tween-20的PBS(PBS緩衝洗液(PBS-WB))稀釋10倍，然後通過0.22μm注射過濾器(Millipore，North Ryde，Australia)過濾。將4μl的370μg/ml的純化的38kDa TB抗原的PBS溶液，pH7.4，塗覆到硝化纖維膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上，然後使其乾燥。然後，在硝化纖維上的非特定結合點用0.5％(w/v)的酪蛋白(Sigma，Castle Hill，Australia)PBS-WB溶液封閉。隨後用AB-55微噴射裝置(MicroFab Technologies，Piano，Texas)在240Hz的頻率下用具有55μm孔的#B0-13-12將每個血清樣品以每點100滴的4×4陣列噴射到分離的TB抗原點上。在分配血清時用浸有PBS-WB的濾紙墊在下面使硝化纖維膜保持溼潤。血清噴射十秒後，用移液管滴幾滴PBS-WB輕輕衝洗硝化纖維膜。隨後在稀釋100倍的0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB中孵育硝化纖維膜1小時，使抗人IgG與FITC(Zymed，San Francisco，CA)結合，再用PBS-WB衝洗。用Bio-Rad FluorSTM Multi-Imager(Hercules，CA)檢測被標記的抗原。
材料和方法1.2重複上述方法，除了使用圖6A到6D中所示的設備在硝化纖維下面墊吸收棉紙。將吸收棉紙填滿在含有TB抗原的硝化纖維下面。該材料隨後全部夾在圖6A到6C所示的設備內部，將要噴射的區域暴露在圓孔18上。慮及瞬間或特定反應，棉紙襯墊物保證噴射的溶液或者任何塗覆的小體積緩衝液或試劑能馬上透過硝化纖維進入棉紙。該方法既防止免疫球蛋白的非特定乾燥和由此發生的非特定反應，還防止分配的特定抗體穿過硝化纖維的表面(參看下面)。與方法1相比，在噴射期間該裝置保持硝化纖維膜乾燥。然後用移液管滴一滴PBS-WB處理膜，隨後如上所述將血清噴射到抗原上。
圖7A和7B示出了微噴射抗TB陰性或陽性人類血清到38kDa TB抗原上的效果。TB血清反應陰性(-)或血清反應陽性(+)的人類血清的4×4陣列20噴射到含有1.48μg的38 kDa TB抗原的4μl點的硝化纖維上。用被PBS-WB浸溼的濾紙(A)或緊緊塞滿的乾燥的吸收棉紙(B)墊在硝化纖維膜下面。用標記為FITC的第二抗體檢測標記的抗原，隨後用BIO-RADFLUOR-STM Multi-Imager分析。這清楚的表明填塞棉紙和如圖7B的20所示的乾燥的膜導致抗原檢測敏感性和解析度的提高。
實施例2用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳)純化的TB抗原並電轉移到硝化纖維上用或不用隨後的直接藍著色(Direct Blue staining)來定義患者對TB的免疫反應性的研究中，開發一種用來微分配人血清的化學列印技術，該血清對於結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis(TB))即可能呈血清反應陰性也可能為陽性。
材料和方法21.48μg的38 kDa TB抗原用x1 SDS-PAGE非減少樣品緩衝液稀釋到200μl。隨後使用4-12％(w/v)Tris-Bis聚丙烯醯胺梯度凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)通過SDS-PAGE分析樣品(每行1.48μg抗原)，隨後電轉移到硝化纖維上。使用直接藍著色可以看到兩行印跡(圖3)，同時另外兩行沒有著色。兩種印跡在室溫下乾燥，並隨後用0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB溶液封閉15分鐘。然後用PBS-WB衝洗兩種印跡，並乾燥。隨後印跡安放到圖1所示的吸入裝置中，然後TB血清反應陰性或血清反應陽性的血清以如上所述的1×5陣列噴射到交替的直接藍著色和沒有著色的印跡的38kDa帶上。大約10秒後，用移液管滴兩滴PBS-WB清洗印跡。用移液管滴兩滴PBS-WB之後10秒，5μlFITC標記的第二抗體用0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB稀釋10倍，塗覆到印跡上。用BIORAD FluorSTM Multi-Imager(Hercules，CA)檢測標記的抗原。
圖8所示為噴射TB陰性或陽性人類血清到用或不用直接藍著色的38kDa TB抗原+/-上的效果。(A)38 kDa TB抗原，每行1.48μg，用4-12％的聚丙烯醯胺梯度凝膠通過SDS-PAGE分離。然後蛋白質電傳送到硝化纖維上。隨後其中的兩行被直接藍著色。(B)用0.5％(w/v)的酪蛋白/PBS-WB溶液封閉之後，TB血清反應陰性(1和3行)或血清反應陽性(2和4行)的人類血清的1×5陣列噴射(如上所述)到38 kDa TB抗原帶上。使用如圖6A到6C中所示的設備進行噴射期間，用緊緊塞滿的乾燥的吸收棉紙墊在硝化纖維膜下面。在噴射血清(A)之前只有第3和第4行被直接藍著色。用FITC標記的第二抗體檢測標記的抗原，隨後用BIO-RAD FLUOR-STMMulti-Imager分析。
目前，使用化學印表機分配納升(nanolitre)體積的人類血清以限定固定在硝化纖維膜上的抗原的方案已經證明非常成功，並提供檢測TB-免疫反應性IgG極其迅速的方法(少於1分鐘)。沒有觀察到背景或非特定結合。最初的研究證明在噴射後血清抗體散布到潮溼的硝化纖維膜的表面，而產生低解析度抗體陣列。在乾燥的硝化纖維膜下面的鋪襯吸收棉紙有效的克服了這個問題，並且現在允許高特異的和解析良好的抗體陣列。
實施例3本實施例涉及用矩陣輔助的雷射解吸附離子化(MALDI)分析在質譜儀中的蛋白質片段之前對陣列上應用蛋白質-酶反應。眾所周知，不同的酶在不同的胺基酸位點切開蛋白質。一些酶，例如lysC、AspN、ArgC只在一個特定的胺基酸位點切開蛋白質。這在MALDI分析中是一個問題，因為它只能產生幾個大的片段，不能產生非常有用的信息光譜。其它酶，例如，胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在許多胺基酸位點切開蛋白質。在MALDI分析之前使用這些酶也有問題，因為產生了太多的小片段，他們將在光譜中產生大量非常小的峰，這也非常難以分析。胰蛋白酶和GluC在兩個胺基酸位點切開蛋白質，這將產生較好的可用於分析光譜，因此選擇用為在MALDI分析中的酶。
雖然如此，因為這些酶只在特定的胺基酸位點分開蛋白質，所以使用單個酶只能產生蛋白質的有限數量的信息和覆蓋的範圍。但是，使用本發明的方法將兩種不同的酶噴射到陣列中的蛋白質點上將增加對蛋白質的覆蓋範圍，並且下面的實驗介紹了本發明的方法的使用，噴射胰蛋白酶和GluC到兩個人前載脂蛋白上以得到改善的覆蓋範圍(匹配的多肽)，並將使用GluC和胰蛋白酶與單獨使用胰蛋白酶或單獨使用GluC相比較。
本實施例的目的是開發用於微分配多個蛋白內切酶到經過SDS-PAGE的純化的蛋白質上並電印跡到具有直接藍著色的聚二氟代乙烯的膜上以改善蛋白質識別的化學列印技術。
材料和方法樣品為36μl在7M尿素、2M硫脲、2％(w/v)Chaps和5mM Tris的全血漿。樣品用X三丁基膦還原，用z碘乙醯胺烷基化。將樣品超聲，然後離心分離，收集上清液。在多室電解槽中進行預分餾，採用Herbert，B.和Righetti，P.G.所描述的方法一個蛋白質代謝分析中的轉變點等電位膜通過多室電解槽進行樣品的預分餾(A turning point in proteome analysissampleprefractionation via multicompartment electrolyzers with isoelectricmembranes)電泳(Electrophoresis)21，3639-3648(2000)。其整個內容在此引入作為參考。
乾燥的11cm長5-6IPG帶在200μl蛋白質樣品中再水化的6小時。再水化的帶在最大為10000V的條件下聚焦120kVhr。聚焦的IPG帶在含有6M尿素、2％(w/v)SDS的平衡緩衝液中平衡20分鐘。
平衡的IPG帶插入到6-15％凝膠粉的裝料管(loading well)中。在每個凝膠50mA的條件下進行電泳1.5小時。蛋白質在400mA下經過1小時20分鐘電印跡到Immobilon PSQPVDF(聚偏二氟代乙烯)膜上。用直接藍71著色蛋白質。
然後膜印跡用3M雙面導電膠帶粘附到Axima-CRF MALDI-TOF MS目標盤上(參考圖9)。特定的蛋白質點用5ηl含有1％的聚乙烯吡咯烷酮的50％甲醇封閉，在一個蛋白質點上在以間隔1mm的兩個位置上分配直徑300μm的50個的液滴。過多的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)用MilliQ輕輕衝洗。50ηl 200μg/ml的GluC蛋白內切酶噴射到在蛋白質上的一個PVP點上，一定量的200μg/ml的胰蛋白酶噴射到同一個蛋白質上的剩餘的PVP點上。然後膜片放入密封的午餐盒中，加入極少量水，以創造一個溼潤的環境，並在37℃下孵育3小時。消化之後，將100ηl溶於20％異丙醇、20％2-丁醇、30％甲醇以及0.5％甲酸中的10mg/ml的α-氰基-羥基肉桂酸(α-cyano-hydroxycinnamic)噴射到消化的蛋白質點上(圖10)。用Axima CRF MALDI-TOF的質譜儀分析分解的片段。
目前用微分配多種蛋白內切酶來增加胺基酸的覆蓋範圍以識別蛋白質的過程已經證明是成功的，其匹配的多肽的聯合覆蓋範圍達到66.6％，而單獨用gluC和單獨用胰蛋白酶則分別達到的40％和46.09％相。
所用的基體溶液包括20％的2-丁醇、20％的異丙醇、30％的甲醇、30％的水以及0.1％的Tfa(三氟醋酸)。該基體溶液具有適當的粘度以便在延長的時間段內分配穩定的液滴的優點。
本領域的技術人員應當明鑑，對於本發明可以進行大量的變化和/或改進，如特定實施例中所示，而不脫離如明白介紹的本發明的精神和範圍。因此，本實施例在所有的方面只作為說明而不是限定。
權利要求
1.一種大分子混合物的分析方法，包括以下步驟在具有分隔為多個點的大分子的支撐物上產生大分子的陣列；以及將一個或多個試劑的第二陣列列印到在陣列中的一個或多個大分子點上。
2.根據權利要求1的方法，其中至少兩種不同的試劑被列印到該點上。
3.根據權利要求2的方法，其中樣品為從由蛋白質、多肽、糖類、脂類、核酸分子、包括糖蛋白的複雜生物分子和其混合物構成的組中選擇的生物分子。
4.根據上述任何一個權利要求的方法，其中陣列由色譜法產生。
5.根據權利要求4的方法，其中色譜法為電泳。
6.根據上述任何一個權利要求的方法，其中電泳是在聚丙烯醯胺凝膠中進行的。
7.根據權利要求6的方法，其中聚丙烯醯胺凝膠電泳在兩維中進行，第一維為等電聚焦電泳，第二維為自然聚丙烯醯胺凝膠電泳或SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳。
8.根據權利要求7的方法，其中在列印第二陣列之前將在凝膠體中產生的陣列轉移到支撐膜上。
9.根據權利要求8的方法，其中支撐膜是由聚偏二氟代烯、硝化纖維、尼龍、特氟隆、zitex、聚丙烯、PTFE及其具有一個或多個功能基的衍生物製成。
10.根據上述任何一個權利要求的方法，其中進一步包括使用檢測方法，以檢測是否在大分子點和試劑間或塗覆到點的試劑間發生了相互作用。
11.根據上述任何一個權利要求的方法，其中大分子為蛋白質。
12.根據權利要求11中的方法，其中試劑是從由lysC、GluC、胰蛋白酶、AspN、ArgC、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶構成的組中選擇的酶。
13.根據權利要求12中的方法，其中試劑包括胰蛋白酶和GluC。
14.根據權利要求12或13中的方法，進一步包括步驟在膜上的宏陣列的一個點中用MALDI-TOF-MS氮雷射束原位釋放一個特定酶反應的被分析物，以用於在MALDI-TOF質譜儀中分析。
15.根據權利要求1到10中任何一個權利要求的方法，其中大分子陣列包括抗原或抗體，試劑包括來自人類或動物的樣品。
16.根據權利要求15中所要求的方法，其中樣品為來自人類的樣品，並包括血漿、血清或組織樣品。
全文摘要
一個大分子陣列(100)(主陣列)，例如通過二維電泳得到的蛋白質，隨後通過電印跡或類似方法轉移到支撐膜(102)。捕捉主陣列的圖像(202)，確定在主陣列中的各種大分子點的坐標(402)。該過程的下一個步驟是用皮升(p1)分配器(702)將一種或多種試劑或化學物質的第二(或微)陣列印到主陣列的一個或多個點/坐標上。如果大分子為蛋白質，則試劑可以是酶，例如胰蛋白酶或GluC等。使用兩種不同的酶，將它們沉積到同一個點的不同坐標上，這將在不同的胺基酸位點分開蛋白質，並且當該點在MALDI－TOF質譜儀中分析時，將提供蛋白質中多肽的增加的分布或匹配。
文檔編號B01L3/00GK1493001SQ01823049
公開日2004年4月28日 申請日期2001年11月30日 優先權日2001年3月16日
發明者安德魯, 斯隆, 賈尼斯, 達夫, 馬爾科姆, 波拉斯卡, 古利, 古利 , 達夫 , 波拉斯卡 姆, 斯隆 安德魯 申請人:普羅託姆系統有限公司