一種微重力環境下提高免疫力的藥物及其篩選方法
2023-04-26 11:47:11
專利名稱：一種微重力環境下提高免疫力的藥物及其篩選方法
技術領域：
本發明屬於航天醫學與組織工程領域，特別涉及一種微重力環境下提高免疫力的藥物及其篩選方法。
背景技術：
持續失重、太空輻射、高真空、微磁場以及晝夜節律改變等均成為太空環境中影響航天員健康的因素，在軌空間飛行過程中，航天員的免疫系統功能在失重環境下會出現抑制現象，從而導致其機體罹患各種感染性疾病和自身免疫疾病的機率大大提高。因此，針對可以提高微重力環境下免疫功能的藥物篩選是有效對抗失重效應措施的重要研究方面。然而，目前為止，未見利用旋轉式生物反應器模擬微重力環境進行提高免疫力藥物篩選的報導。本發明旨在公開一種微重力環境下提高免疫力的藥物及其篩選方法，該藥物可以對抗微重力環境下免疫功能降低的作用，同時該篩選方法具有高效、快速的特點，對未來航天員對抗失重效應的健康防護具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在於提供一種微重力環境下提高免疫力的藥物。本發明的目的還在於提供一種微重力環境下提高免疫力的藥物的篩選方法。一種微重力環境下提高免疫力的藥物，由黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖混合而成；黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖分別佔該藥物總質量的百分比為 20-50%、20-50%、10-40%、10-40%和 10-40%。—種微重力環境下提高免疫力藥物的篩選方法，按照如下操作步驟進行(1)製備淋巴細胞懸液用RMPI 1640培養液重懸製備細胞總數為5 X IO4 5 X IO8個的淋巴細胞懸液；(2)將製得的淋巴細胞懸液置於不同容積的旋轉式生物反應器中進行模擬微重力環境培養，同時添加不同濃度的淋巴細胞刺激物；(3)將不同比例的黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖的混合多糖溶於注射用水，其中混合多糖的濃度為0. 2-5mg/ml，將混合多糖溶液加入到步驟(2)所述的體系中培養，在3-96h中的不同時間點取樣，測定淋巴細胞免疫功能指標的改變，以此篩選出微重力環境下可以提高免疫力的藥物。所述淋巴細胞刺激物為刀豆蛋白A，其濃度為 10-40 μ g/ml ；或植物凝激素A，其濃度為10-40 μ g/ml。所述淋巴細胞免疫功能指標為淋巴細胞的增殖度、淋巴細胞細胞因子的分泌或淋巴細胞表面標誌的表達。所述淋巴細胞因子優選IL-2和IFN- γ ；所述淋巴細胞表面標誌優選⑶4和⑶8。 本發明的有益效果本發明採用旋轉式生物反應器進行對抗微重力環境免疫功能低下藥物的篩選，通過添加不同比例配伍的多糖混合物對淋巴細胞免疫功能的改變測定，包括淋巴細胞的增殖、細胞因子的分泌以及表面標誌的表達等，從而可以高效、快速篩選出對抗微重力環境免疫功能降低的藥物，對未來航天員對抗失重效應的健康防護具有重要意義。本發明的構建方法操作工藝簡單、實施條件溫和。
具體實施例方式通過以下實施例對本發明做詳細描述，但是以下實施例僅僅是作為例證，並不對本發明構成任何限制。以下實施例中未詳細說明的部分請參閱Robert Lanza, Robert Langer and Joseph Vacanti 編寫的〈〈Principles of Tissue Engineering〉〉第三版禾口 Anthony Atala, Robert P. Lanza 編寫的《Methods of tissue engineering》(2006)。以下實施例構建方法中使用的細胞分離、培養所需試劑(I)RMPI 1640 細胞培養基RMPI 1640 乾粉培養基一袋，2. 2g NaHCO3, 2. 383gHEPES，10萬單位青黴素，10萬單位鏈黴素，溶解於1000ml超純水中，調節pH值為 7. 2-7. 4，經0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，4°C保存。使用時添加10%胎牛血清(FBS)和淋巴細胞刺激物，用於淋巴細胞的培養。(2)PBS:稱取 8g NaCl,0. 2g KCl，3.491g Na2HPO4 『 12H20,0. 2g KH2PO4,溶解於 1000ml超純水中，調節pH值為7. 2-7. 4，121 °C高壓蒸汽滅菌20min，4°C保存。實施例1以人外周血單核細胞為種子細胞篩選多糖混合物(1)採用密度梯度離心法分離人外周血單核細胞取肝素抗凝血用Hanks液稀釋一倍，將其輕鋪在Ficoll分離液(比重為1. 077g/ mL)上，然後2000rpm，水平離心30min。單個核細胞懸於分離液上層，呈白色膜狀。用吸管小心吸取單個核細胞層，加入Hanks液後洗滌3遍。加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培
養基，常規培養。(2)將製得的人外周血單核細胞懸液(細胞總數為IXlO7)置於50mL的旋轉式生物反應器中培養，同時添加濃度為20 μ g/mL的植物凝激素A(PHP-A)。(3)將黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖按照質量百分比為 20 %、20 %、30 %、10 %、20 %混合，稱取Img混合多糖充分溶解於2mL注射用水中，並將其加入(2)中所述的體系中。(4)對添加了多糖混合物的淋巴細胞在!3h、6h、9h和1 分別取樣，測定淋巴細胞的增殖度、IL-2，IFN-Y分泌以及⑶4，⑶8表面標誌的表達。從而篩選出微重力環境下提高免疫力的藥物。實施例2以小鼠骨髓單核細胞為種子細胞篩選多糖混合物(1)採用密度梯度離心法分離小鼠骨髓單核細胞取已死亡小鼠股骨，將股骨放入無菌的冷PBS中；用ImL注射器衝出小鼠股骨中的細胞，直到股骨腔呈白色；充分混勻細胞，使用200目的濾網過濾，收集過濾液於IOmL離心管中，1500rpm。離心5min ；棄上清，加入8mLNH4Cl_Tris溶液，將細胞懸起，溶解紅細胞約 6min，1500rpm,離心5min。棄上清，在離心管中加入5mL無菌冷PBS，重懸細胞；將上述細胞懸液輕輕加到5mL Ficoll-paqul (1. 086g/mL)，1500rpm,離心30min ；小心取出離心管，溶液分為三層從上往下依次是透明的PBS層、單核細胞層、RBS層；用口徑較大的細吸管吸出單個核細胞到50mL的離心管中，加入30mLPBS混勻清洗細胞，1500rpm,離心5min。1 OmLPBS,1500rpm，離心5min再洗滌1次；重懸細胞，接種於含有10% FBS的RMPI1640培養液中，常
規培養。(2)將製得的小鼠骨髓單核細胞懸液(細胞總數為3 X IO7)置於50mL的旋轉式生物反應器中培養，同時添加濃度為25 μ g/mL的植物凝激素A(PHP-A)。(3)將黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖按照質量百分比為 30 %、30 %、20 %、10 %、10 %混合，稱取Img混合多糖充分溶解於2mL注射用水中，並將其加入(2)中所述的體系中。(4)對添加了多糖混合物的淋巴細胞在Muiai和24h分別取樣，測定淋巴細胞的增殖度、IL-2，IFN-Y分泌以及⑶4，⑶8表面標誌的表達。從而篩選出微重力環境下提高免疫力的藥物。實施例3以小鼠脾淋巴細胞為種子細胞篩選多糖混合物(1)採用密度梯度離心法分離小鼠脾淋巴細胞取已死亡小鼠的脾臟組織，置於盛有無菌的冷PBS中，然後將脾臟剪碎，使用 200目的濾網過濾，收集過濾液於IOmL離心管中，1500rpm。離心5min ；棄上清，加入 8mLNH4Cl-Tris溶液，將細胞懸起，溶解紅細胞約8min，1500rpm,離心5min。棄上清，在離心管中加入5mL無菌冷PBS，重懸細胞；將上述細胞懸液輕輕加到5mL Ficoll (1. 086g/mL)， 2000rpm，離心15min ；小心取出離心管，溶液分為三層從上往下依次是透明的PBS層、單核細胞層、RBS層；用口徑較大的細吸管吸出淋巴細胞到IOmL的離心管中，加入5mLPBS混勻清洗細胞2次，1500rpm，離心5min。重懸細胞，接種於含有10% FBS的RMPI1640培養液中， 常規培養。(2)將製得的小鼠脾淋巴細胞懸液(細胞總數為5X IO7)置於50mL的旋轉式生物反應器中培養，同時添加濃度為20 μ g/mL的刀豆蛋白A(ConA)。(3)將黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖按照質量百分比為 30 %、30 %、20 %、10 %、10 %混合，稱取aiig混合多糖充分溶解於2mL注射用水中，並將其加入(2)中所述的體系中。(4)對添加了多糖混合物的淋巴細胞在Mh、4 !和7 分別取樣，測定淋巴細胞的增殖度、IL-2，IFN-Y分泌以及⑶4，⑶8表面標誌的表達。從而篩選出微重力環境下提高免疫力的藥物。
權利要求
1.一種微重力環境下提高免疫力的藥物，其特徵在於，該藥物由黃芪多糖、人參多糖、 靈芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖混合而成；黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖分別佔該藥物總質量的百分比為20-50 %、20-50 %、10-40 %、10-40 %和10-40 %。
2.一種微重力環境下提高免疫力藥物的篩選方法，其特徵在於，按照如下操作步驟進行(1)製備淋巴細胞懸液用RMPI 1640培養液重懸製備細胞總數為5 X IO4 5 X IO8個的淋巴細胞懸液；(2)將製得的淋巴細胞懸液置於不同容積的旋轉式生物反應器中進行模擬微重力環境培養，同時添加不同濃度的淋巴細胞刺激物；(3)將不同比例的黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖的混合多糖溶於注射用水，其中混合多糖的濃度為0. 2-5mg/ml，將混合多糖溶液加入到步驟(2)所述的體系中培養，在3-96h中的不同時間點取樣，測定淋巴細胞免疫功能指標的改變，以此篩選出微重力環境下可以提高免疫力的藥物。
3.根據權利要求2所述一種微重力環境下提高免疫力藥物的篩選方法，其特徵在於， 所述淋巴細胞刺激物為刀豆蛋白A，其濃度為10-40 μ g/ml ；或植物凝激素A，其濃度為 10-40μ g/ml。
4.根據權利要求2所述一種微重力環境下提高免疫力藥物的篩選方法，其特徵在於， 所述淋巴細胞免疫功能指標為淋巴細胞的增殖度、淋巴細胞細胞因子的分泌或淋巴細胞表面標誌的表達。
全文摘要
本發明公開了屬於航天醫學與組織工程領域的一種微重力環境下提高免疫力的藥物及其篩選方法。本發明的藥物由黃芪多糖、人參多糖、靈芝多糖、茯苓多糖和香菇多糖混合而成。通過如下篩選方法獲得，首先製備淋巴細胞懸液，然後將淋巴細胞置於旋轉式生物反應器的模擬微重力環境培養並添加不同比例配伍的多糖混合物，通過淋巴細胞免疫功能的改變得到在微重力環境下提高免疫力的藥物配方。本發明的構建方法操作工藝簡單、實施條件溫和，可以高效、快速篩選出對抗微重力環境免疫功能降低的藥物，對未來航天員對抗失重效應的健康防護具有重要意義。
文檔編號A61K36/481GK102258564SQ201110185170
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月1日 優先權日2011年7月1日
發明者周瑾, 杜芝燕, 林秋霞, 段翠密, 王妍, 王常勇, 王灩濛, 郝彤 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所