一種複合菌劑高效轉化土壤弱酸結合態鎘的方法與流程

2023-05-10 11:46:16

本發明涉及處理重金屬鎘的微生物學方法，是利用綠色化的生物技術，尤其利用一種複合菌劑高效轉化土壤弱酸結合態鎘的方法。

背景技術：

近年來，土壤重金屬修復越來越偏向於生物修復，其中植物修複比較普遍，但高富集植物的馴化培養以及生長周期長等因素限制了植物修復的發展，而生物浸出以其經濟高效的優勢凸顯出來。生物浸出技術早已廣泛應用於冶金領域當中，但是由於土壤體系比較複雜，重金屬存在形式多樣，生物浸出技術在土壤重金屬治理方面還涉足未深，大多僅限於實驗室的搖瓶浸出，這在實際應用中是難以實現的。

土壤汙染修復根據方法可分為三類：物理化學治理法、化學治理法、生物治理法。傳統的物化治理法和化學治理法面臨的主要問題是成本高，實施複雜，周期長，並且容易產生二次汙染。如客土和換土法是典型的物理治理法，客土是指在汙染的土壤上加入未汙染的土，而換土是指用為汙染的土替代汙染土壤，這兩種措施都不能從本質上減少重金屬含量且只限於小規模使用。而典型的化學治理法如沉澱吸附法則是將重金屬固定化，固定化技術面臨的最大的問題就是土壤中總的金屬含量並未減少，隨著時間推移，已經被固定的重金屬可能再次被植物利用。生物治理法包括植物修復法，動物修復法以及微生物修復法。植物修復法雖然不會破壞土壤理化性質，但植物培養周期長，超量積累重金屬往往會導致植物生長緩慢。鑑於傳統方法的局限性，具有成本低、效率高、對環境影響較小的的微生物修復法應運而生。

技術實現要素：

本發明的目的是提出一種複合菌劑高效轉化土壤弱酸結合態鎘的方法。該方法利用綠色化的生物高效轉化土壤弱酸結合態鎘的技術，對環境造成零汙染，浸出液中雜質少，投資運行成本均比常規方法低。

一種複合菌劑高效轉化土壤弱酸結合態鎘的方法：將所述的複合菌劑投入鎘汙染土壤中，充分翻攪，混勻；靜置，待土壤沉澱，排掉上清液；

所述的複合菌劑由以下兩個菌群混合後富集培養得到：

(1)假絲酵母菌(candida)、單胞瓶黴菌(phialemonium)、圓紅東孢酵母菌(rhodosporidiumtoruloides)、隱球菌(cryptococcus)組成菌群1；

(2)嗜酸氧化硫硫桿菌(acidithiobacillusthiooxidans)、喜溫酸硫桿菌(acidithiobacilluscaldus)、氧化亞鐵鉤端螺旋菌(leptospirumferrooxidans)、嗜熱硫氧化硫化桿菌(sulfobacillusthermosulfidooxidans)，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、噬熱鐵質菌(ferroplasmathermophilum)組成菌群2。

所述的複合菌劑高效轉化土壤弱酸結合態鎘的方法，具體包括以下步驟：

①按照40l/畝‐60l/畝的比例施加微生物製劑到鎘汙染土壤；

②用農用翻耕機翻地1小時以上，沉降至少4小時後排水至回收池；

③每1‐2天重複步驟①②一次，微生物製劑用鎘已被回收處理的微生物製劑；如此反覆處理至少3次。

所述的複合菌劑由65‐75％假絲酵母菌(candida)、10‐15％單胞瓶黴菌(phialemonium)、5‐15％圓紅東孢酵母菌(rhodosporidiumtoruloides)、2‐6％隱球菌(cryptococcus)的數量比例組成菌群1；嗜酸氧化硫硫桿菌(acidithiobacillusthiooxidans)、喜溫酸硫桿菌(acidithiobacilluscaldus)、氧化亞鐵鉤端螺旋菌(leptospirumferrooxidans)、嗜熱硫氧化硫化桿菌(sulfobacillusthermosulfidooxidans)，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、噬熱鐵質菌(ferroplasmathermophilum)按1:(1-1.7):(1-1.9):(1-2):(1-2.4):(1-3)的數量比例組成菌群2；

假絲酵母菌(candida)包括近平滑假絲酵母(candidaparapsilosis)、熱帶假絲酵母(candidatropicalis)以及粗壯假絲酵母(candidavalida)，三種菌的數量比例為(4‐5):(2‐3):3；

隱球菌(cryptococcus)包括羅倫特隱球菌(cryptococcuslaurentii)、維多利亞隱球酵母菌(cryptococcusvictoriae)和新型隱球菌(filobasidiellabacillispora)，三種菌的數量比例為3:(2‐4):(2‐3)。

所述的菌劑中的各種菌在混合之前在含有鎘的培養基中進行馴化；馴化的具體步驟及條件如下：將菌置於100ml滅菌的含有0.5％‐1.5％9k培養基、4‰-12‰葡萄糖、4‰-9‰硫粉以及cdso4的培養基中，在轉速為150-200rpm溫度為22-27℃條件下馴化至少30代，馴化時cdso4的濃度梯度為0.5mmol/l，培養基中cdso4含量從0.5增加到15.0mmol/l。

作為進一步的改進，將菌群1、菌群2接種到富集培養基中，曝氣培養後，經過8—12次轉接培養後獲得微生物菌劑。

作為進一步的改進，將菌濃均為2.0×107-3.5×107個/ml的菌群1、菌群2和水按照3:(2-4):(5-6)的體積比例混合，初始接種量為2％‐5％接種到富集培養基中，曝氣培養後，將所培養的富集物以8％—15％的體積比例轉接到新鮮的培養基中，繼續曝氣培養，經過8—12次轉接培養後獲得微生物菌劑。

富集培養基組成如下：7％-11％9k培養基+4‰-9‰酵母粉+4‰-12‰葡萄糖+4‰-9‰硫粉+0.3‰‐0.8‰磁黃鐵礦，將體系定容到50l；

所述的9k培養基成分如下：蒸餾水1000ml，(nh4)2so4(0.3g/l)，k2hpo4(0.05g/l)，kcl(0.01g/l)，ca(no3)2(0.001g/l)，mgso4·7h2o(0.05g/l)；

培養基不做高壓滅菌處理，直接將各組成成分加入曝氣柱中。

作為進一步的改進，曝氣培養條件為：初始ph2.5—3.0，溫度20—30℃，曝氣量do2條件下富集培養1—3天。培養後富集物菌濃達5.0×108個/ml‐8.0×108個/ml，ph降至1.3-1.5。

近平滑假絲酵母(candidaparapsilosis)、熱帶假絲酵母(candidatropicalis)以及粗壯假絲酵母(candidavalida)、羅倫特隱球菌(cryptococcuslaurentii)、喜溫酸硫桿菌(acidithiobacilluscaldus)可在中國工業微生物菌種保藏管理中心(cicc)購買，編號分別為31861、1316、32439、32267、24169；維多利亞隱球酵母菌(cryptococcusvictoriae)和新型隱球菌(filobasidiellabacillispora)、嗜熱硫氧化硫化桿菌(sulfobacillusthermosulfidooxidans)，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、噬熱鐵質菌(ferroplasmathermophilum)；嗜酸氧化硫硫桿菌(acidithiobacillusthiooxidans)、氧化亞鐵鉤端螺旋菌(leptospirumferrooxidans)單胞瓶黴菌(phialemonium)、圓紅東孢酵母菌(rhodosporidiumtoruloides)可從北京萊耀生物科技有限公司購買。

本發明採用的菌群1通過將鎘汙染土壤中具有鎘轉化功能的微生物富集培養起來，最終通過測序獲得主要微生物的種類和數量比例，然後據此復配得到菌群1，再與菌群2混合進行曝氣培養，生成微生物菌劑。該菌劑能將鎘從土壤中高效轉化為土壤弱酸結合態鎘,實現了在綠色化無汙染條件下轉化為弱酸結合態鎘。在轉化過程中,不需要添加其他物質,故減少了生產成本。該生物法綠色環保,工藝簡單,易於推廣。

本發明製備的複合微生物菌劑生長速度快，產酸能力強，接種培養第三天ph值降到1.5，菌濃達到5x108個/ml以上。

具體實施方式

本發明有下列實施例進一步說明,但不受這些實施例的限制。

實施例1：

實施例1：耐鎘微生物的採集、培養和馴化

由71.5％假絲酵母菌(candida)、13.5％單胞瓶黴菌(phialemonium)、10％圓紅東孢酵母菌(rhodosporidiumtoruloides)、5％隱球菌(cryptococcus)組成菌群1；假絲酵母菌(candida)包括近平滑假絲酵母(candidaparapsilosis)、熱帶假絲酵母(candidatropicalis)以及粗壯假絲酵母(candidavalida)，三種菌的數量比例為5:2:3；隱球菌(cryptococcus)包括羅倫特隱球菌(cryptococcuslaurentii)、維多利亞隱球酵母菌(cryptococcusvictoriae)和新型隱球菌(filobasidiellabacillispora)，三種菌的數量比例為3:2:2；

混合之前各菌分別在含鎘培養基中進行馴化，馴化的具體步驟及條件如下：將菌置於100ml滅菌的含有10％9k、8‰葡萄糖、4‰硫粉及濃度梯度為0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l、…、14.5mmol/l、15.0mmol/lcdso4的培養基中，在轉速為180rpm溫度為25℃條件下馴化30代。

然後將嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(a.ferrooxidans,a.f)、嗜中高溫嗜酸古菌(f.thermophilum)、嗜熱硫氧化硫桿菌(s.thermosulfidooxidnas)、嗜鐵鉤端螺旋菌(l.ferriphilum)、氧化硫硫桿菌(a.thiooxidans，a.t)等6個菌種按1:1:1:1:1:1的比例組成菌群2；混合之前各菌分別在含鎘培養基中進行馴化。馴化的具體步驟及條件如下：將菌置於100ml滅菌的含有10％9k、8‰葡萄糖、4‰硫粉及濃度梯度為0.5mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、2.0mmol/l、…、14.5mmol/l、15.0mmol/lcdso4的培養基中，在轉速為180rpm溫度為25℃條件下馴化30代。

富集培養基的配製：10％9k培養基+4‰酵母粉+8‰葡萄糖+4‰硫粉+0.8‰磁黃鐵礦，將體系定容到50l。9k培養基成分如下：蒸餾水1000ml，(nh4)2so43g/l，k2hpo40.5g/l，kcl0.1g/l，ca(no3)20.01g/l，mgso4·7h2o0.5g/l。由於此富集培養基體系為50l，屬於大體系，故培養基不做高壓滅菌處理，直接將各組成成分加入曝氣柱中。

將菌濃均為3.0×107個/ml菌群1、菌群2和自來水按照3:2:5的體積比例混合，再按照2％‐5％接種到富集培養基中，在30℃，曝氣量為do2的條件下培養3天，ph降到1.5，菌濃為2×108個/ml。

將第一次富集的微生物以10％的濃度接種於培養基中，調節ph2.8，在相同條件下培養。重複傳代8次後得到生長周期短，活性好的菌群。ph值在最後一次傳代培養的第三天降到1.5，菌濃達到5x108個/ml。

實施例2：

本實施例在實驗土壤裡進行實地效果驗證，情況如下，取湖南省長沙市北山鎮環境治理vip實驗示範區汙染農田土壤，對土壤內的cd含量進行3次測量後取平均值為2.31ppm，應用本發明微生物製劑的具體步驟如下：①在被汙染的土壤表面積按照40l/畝‐60l/畝的比例均勻施加微生物製劑。②用農用翻耕機翻地1小時，沉降過夜後排水至回收池，測定土壤中的鎘含量。③每1‐2天重複步驟①②一次，微生物製劑可用回收處理過的，即溶液中的鎘已被回收處理微生物製劑。如此反覆處理3次，即可將被重金屬汙染的土壤修復成相對良性的土壤。經檢測：處理後的土壤cd(鎘)含量為0.11pmm，國家標準為cd(鎘)含量不大於0.20ppm。

本發明適用於富水、溫潤地域或窪地,尤其適用於水稻種植區域。

對比例1：

將本發明菌群1中的各種菌按照實施例1中相同方法進行馴化，然後按照實施例1相同的方法進行富集培養，最後得到的菌劑按照實施例1相同的方法進行土壤鎘的處理，發現鎘的去除率僅為12.8％。

對比例2：

將本發明菌群2中的各種菌按照實施例1中相同方法進行馴化，然後按照實施例1相同的方法進行富集培養，最後得到的菌劑按照實施例1相同的方法進行土壤鎘的處理，發現鎘的去除率僅為33.4％。

對所公開的實施例的上述說明,僅為了使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的。因此,本發明將不會被限制於本文所示的這些實施例,而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的範圍。