一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法

2023-05-10 11:48:46 1

一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法
【專利摘要】一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法，包括以下步驟：將黃龍病感病的芸香科柑橘亞科植物葉片表皮夾在受體室和供體室之間，用矽膠密封固定；在受體室中加入含有待檢測滲透劑的硼酸緩衝液；在供體室中加入含有標記物檸檬酸緩衝液；將該裝置放置暗處並在搖床上進行滲透；分別在放置後的0min、15min、30min、45min和60min，測定受體室中標記物的含量，並根據公式P＝F/cA計算出滲透參數P的值。本發明的檢測方法利用了黃龍病感病的芸香科柑橘亞科植物葉片表皮的特性，步驟簡單，可靠性高，可以快速從眾多滲透劑中篩選出一種高效滲透劑，有助於提高藥物的透皮運輸效率，提高柑橘黃龍病的防治效果。
【專利說明】一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法，屬於農業技術領 域。

【背景技術】
[0002] 柑橘黃龍病是世界柑橘生產上的毀滅性病害，是由一種限於韌皮部內寄生的革蘭 氏陰性細菌（Ca. Liberibacter)引起,能夠侵染包括柑橘屬、積屬、金柑屬和九裡香等多種 芸香科植物。柑橘感染黃龍病後形成均勻黃化型或者斑駁型黃稍，後期則呈現缺鋅花葉等 一系列典型病症，表現為經濟壽命短、產量低、果實品質劣，造成巨大的經濟損失。
[0003] 自20世紀初在我國華南地區首次報導以來，在世界各大柑橘產區相繼發生，特別 對世界主要的兩大柑橘主產區美國佛羅裡達州和巴西聖保羅州的柑橘產業造成重大經濟 損失。目前，該病主要分布在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50個國家和地區，中 國19個柑橘生產省（市、自治區）中已有11個受到該病危害，其面積佔柑橘總栽培面積的 80%以上、產量佔總產量的85%左右，嚴重製約柑橘產業的健康發展。
[0004] 化學治療被認為是一種防治柑橘黃龍病的有效手段，通過葉面噴施藥物防治作物 病害已經得到廣泛的應用。但是由於柑橘黃龍病病原菌寄生於柑橘韌皮部內，有效藥物必 須透過柑橘葉片表皮，才能進入柑橘韌皮部內。柑橘葉片表皮主要由蠟質層、幾丁質層和果 膠層組成，其中表皮蠟質是覆蓋在葉片表面的一層疏水屏障，阻礙外界物質透過葉片表皮 進入柑橘體內。滲透劑能夠改變表皮蠟層的結構和性質、增加葉片表面張力，從而提高其表 皮的滲透能力。因此，使用滲透劑作為輔劑，改變柑橘表皮蠟質的性質，能有效提高藥物透 過表皮運輸到柑橘韌皮部的效率。
[0005] 目前未見有適用於黃龍病感病植株葉片表皮滲透劑應用的相關文獻報導。本領域 技術人員長期希望找到一種檢測防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的方法和指標，用於快 速、準確、有效地篩選出具有強大黃龍病感病植株葉片表皮滲透能力的滲透劑，應用於有效 藥物的透皮轉運，以達到防治黃龍病的最終目的。


【發明內容】

[0006] 本發明針對現有技術的不足，提供一種檢測防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的 方法和指標，用於快速、準確、有效地篩選出具有強大黃龍病感病植株葉片表皮滲透能力的 滲透劑，應用於有效藥物的透皮轉運，達到防治黃龍病的最終目的。
[0007] 為了實現上述目的，本發明採用了以下技術方案：
[0008] -種滲透劑滲透效能的檢測方法，包括以下步驟：
[0009] (1)用黃龍病感病的芸香科柑橘亞科植物葉片表皮將一個容器隔離成兩個互相獨 立的腔室，用矽膠密封固定葉片表皮與容器連接處，兩個互相獨立的腔室一個作為供體室， 另一個作為受體室；
[0010] (2)在受體室中加入含有滲透劑的硼酸緩衝液；
[0011] (3)在供體室中加入含有標記物的檸檬酸緩衝液；
[0012] (4)將該裝置放置暗處，並在搖床上進行滲透；
[0013] (5)分別在放置後的Omin、15min、30min、45min和60min,利用分光光度計測定受 體室中標記物的含量，並根據公式（a)計算出滲透參數P的值，
[0014] P = F/cA (a)
[0015] 其中，P為滲透參數；F為標記物透皮運輸的線性斜率；c表示供體室中標記物的濃 度，單位為mol · cnT3 ;A為分離表皮在滲透系統中的實際面積，單位為cm2 ;
[0016] (6)滲透參數P的值用於評價滲透劑的滲透效能，P值越大，則滲透劑滲透效能越 好。
[0017] 所述柑橘葉片表皮通過如下方法分離：
[0018] 選取黃龍病感病的芸香科柑橘亞科植物葉片，將該葉片完全浸沒在50mM、pH值為 4. 0的檸檬酸緩衝液中培養，直到表皮完全從葉片分離，再用50mM、pH值為4. 0的檸檬酸緩 衝液將離體表皮漂洗乾淨，並晾乾。
[0019] 所述檸檬酸緩衝液含有2%的果膠酶和0. 2%的纖維素酶。
[0020] 所述硼酸緩衝液的濃度為50?100mM，硼酸緩衝液的pH值為8. 0?10. 0。
[0021] 所述檸檬酸緩衝液的濃度為10?20mM，檸檬酸緩衝液的pH值為2. 0?4. 0。
[0022] 所述標記物為4-硝基酚。
[0023] 利用分光光度計測定受體室中4-硝基酚的含量時，選擇波長為399nm。
[0024] 與現有技術相比較，本發明具備的有益效果：
[0025] 針對黃龍病感病的芸香科柑橘亞科植物葉片表皮的特性，提供一種檢測防治柑橘 黃龍病的滲透劑滲透效能的方法，該方法步驟簡單，試劑易於配製，滲透效能指標的可靠性 高，可以快速從眾多滲透劑中篩選出一種高效滲透劑，有助於提高藥物的透皮運輸效率，提 高柑橘黃龍病的防治效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發明所述檢測方法使用的一個滲透裝置。

【具體實施方式】
[0027] 下面通過實施例，結合說明書附圖對本發明的技術方案作進一步闡述。
[0028] 實施例1
[0029] 1.葉片表皮的分離
[0030] 採取黃龍病感病的檸檬葉片，利用直徑為7mm的打孔器，獲得直徑為7mm的葉圓 片，將該葉圓片完全浸沒在50mM、pH值為4. 0的含有2%果膠酶和0. 2%纖維素酶的檸檬酸 緩衝液培養。待表皮完全從葉片分離後，用pH值為4. 0的檸檬酸緩衝液將表皮漂洗乾淨， 並晾乾。
[0031] 2.滲透劑滲透效能的檢測
[0032] (1)將由步驟1獲得的黃龍病感病的檸檬葉圓片表皮放置在滲透裝置隔板上的通 孔3上，將該滲透裝置隔離出兩個互相獨立的腔室，用矽膠密封固定葉片表皮與容器連接 處，兩個互相獨立的腔室一個作為供體室1，另一個作為受體室2 ;
[0033] (2)在受體室2中加入2ml含0. 1 %滲透劑的lOOmM、pH值為9. 0的硼酸緩衝液。 滲透劑分別為Brij35, Brij58, Brij98,二甲基亞碸，N-甲基吡咯烷酮，尿素，氮酮和油酸。
[0034] (3)在供體室1中加入200 μ 1含15mM的4-硝基酚的10mM檸檬酸緩衝液，上述檸 檬酸緩衝液的pH值為3. 0 ;
[0035] (4)然後將該滲透裝置放置暗處，並在轉速為60rpm的搖床上進行滲透，
[0036] (5)分別在放置後0、15、30、45和60min，利用分光光度計（DU640)于波長399處 測定受體室2中4-硝基酚的含量，並根據公式（a)計算出滲透參數P的值，P值用於評價 滲透劑的滲透效能，P值越大，則滲透劑滲透效能越好。
[0037] P = F/cA (a)
[0038] 其中，P為滲透參數；F為4-硝基酚透皮運輸的線性斜率；c表示供體室1中標記 物的濃度，單位為mol κπΓ2 ;A為分離表皮在滲透裝置中的實際有效面積，即為通孔的面積， 單位為cm2。
[0039] 利用上述方法對不同滲透劑進行了檢測，獲得的滲透參數如表1所示，從表1可以 看出，滲透劑Brij35的P值為1. 841，與空白對照相比，增加3. 34倍，其P值和增加的倍數 在所有滲透劑中最高，因此，檢測表明Brij35是一種高效的理想滲透劑。
[0040] 表1 :不同滲透劑的滲透參數P值比較
[0041]
[0042]

【權利要求】
1. 一種防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 用黃龍病感病的芸香科柑橘亞科植物葉片表皮將一個容器隔離成兩個互相獨立的 腔室，用矽膠密封固定葉片表皮與容器連接處，兩個互相獨立的腔室一個作為供體室，另一 個作為受體室； (2) 在受體室中加入含有待檢測滲透劑的硼酸緩衝液； (3) 在供體室中加入含有標記物的檸檬酸緩衝液； (4) 將該滲透裝置放置暗處，並在搖床上進行滲透； (5) 分別在放置後的0min、15min、30min、45min和60min,利用分光光度計測定受體室 中標記物的含量，並根據公式（a)計算出滲透參數P的值： P = F/cA (a) 其中，P為滲透參數；F為標記物透皮運輸的線性斜率；c表示供體室中標記物的濃度， 單位為mol · cnT2 ;A為分離表皮在滲透系統中的實際面積，單位為cm2 ; (6) 滲透參數P值用於評價滲透劑的滲透效能，P值越大，則滲透劑滲透效能越好。
2. 根據權利要求1所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法，其特徵在 於，所述芸香科柑橘亞科植物葉片表皮通過如下方法分離：選取黃龍病感病的芸香科柑橘 亞科植物葉片，將該葉片完全浸沒在50mM、pH值為4. 0的檸檬酸緩衝液中培養，直到表皮完 全從葉片分離，再用50mM、pH值為4. 0的檸檬酸緩衝液將離體表皮漂洗乾淨，並晾乾。
3. 根據權利要求1或2所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法，其特徵 在於，所述檸檬酸緩衝液含有2%的果膠酶和0. 2%的纖維素酶。
4. 根據權利要求1所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法，其特徵在 於，所述硼酸緩衝液的濃度為50?100mM，硼酸緩衝液的pH值為8. 0?10. 0。
5. 根據權利要求1所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法，其特徵在 於，所述檸檬酸緩衝液的濃度為10?20mM，檸檬酸緩衝液的pH值為2. 0?4. 0。
6. 根據權利要求1所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法，其特徵在 於，所述標記物為4-硝基酚。
7. 根據權利要求6所述的防治柑橘黃龍病的滲透劑滲透效能的檢測方法，其特徵在 於，利用分光光度計測定受體室中4-硝基酚的含量時，選擇波長為399nm。
【文檔編號】G01N21/31GK104266980SQ201410414436
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月21日 優先權日:2014年8月21日
【發明者】張木清, 楊川毓 申請人:廣西大學