抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒及其製備方法與流程
2023-05-09 19:23:21 1
本發明涉及體外檢測領域,尤其涉及一種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒及其製備方法。
背景技術:
環瓜氨酸多肽(cyclic cirullinated peptide antibodies,CCP)抗體,是環狀聚絲蛋白的多肽片段,是以IgG型為主的抗體,對類風溼性關節炎(RA)具有很好的敏感性和特異性,且抗CCP抗體陽性的RA病人骨破壞較抗CCP抗體陰性者嚴重。
類風溼關節炎(RA)是一種常見的系統性自身免疫性疾病,以關節滑膜炎症以及對稱性、破壞性的關節病變為主要臨床特徵,其病程長,易反覆,給患者造成很大痛苦。該病在我國的發病率約為0.4%,全球為0.5~1.0%,患者發病年齡多在20~50歲,女性多於男性,男女之比為1:3。
研究表明,在RA患者的血清中可以檢測到抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗體(AKA),其抗原位點是環瓜氨酸多肽(CCP)。該肽段是在肽基精氨酸脫亞胺酶的催化下,由蛋白中的精氨酸轉化而成。由於CCP可以通過人工合成,對RA的診斷具有較高的敏感性和特異性,而且抗環瓜氨酸多肽抗體的檢測較APF和AKA檢測具有一定的優越性,因此抗環瓜氨酸多肽抗體的檢測對與RA的診斷具有重要意義。
傳統的抗環瓜氨酸多肽抗體的檢測方法包括酶聯免疫吸附法和化學發光法,然而,傳統的抗環瓜氨酸多肽抗體的檢測方法檢測靈敏度較差。
技術實現要素:
基於此,有必要提供一種檢測靈敏度較高的抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒及其製備方法。
一種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒,包括:鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒和鼠抗人IgG標記的化學發光標記物。
在一個實施例中,所述鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒中,所述鏈黴親和素與所述羧基化的磁微粒的比例為1:25~35。
在一個實施例中,所述鼠抗人IgG標記的化學發光標記物中,所述鼠抗人IgG與所述化學發光標記物的比例為50:1~10。
在一個實施例中,所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。
在一個實施例中,所述化學發光標記物為魯米諾、異魯米諾、三聯吡啶釕或吖啶酯。
在一個實施例中,還包括化學發光底物液,所述化學發光底物液包括A液和B液。
在一個實施例中,所述A液為H2O2溶液,所述B液為NaOH溶液。
在一個實施例中,還包括抗環瓜氨酸多肽抗體定標品。
在一個實施例中,所述抗環瓜氨酸多肽抗體定標品為濃度分別為0U/mL、5U/mL和100U/mL的抗環瓜氨酸多肽抗體的溶液。
一種上述的抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的製備方法,包括如下步驟:
取羧基化的磁微粒的懸浮液,磁分離去上清後用MES緩衝液重懸,接著加入EDC水溶液,活化羧基化的磁微粒的表面羧基,接著加入鏈黴親和素,室溫下混懸2h~10h,磁分離去除上清後用Tris緩衝液重懸,得到鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒;以及取鼠抗人IgG,加入碳酸鹽緩衝液後混勻,然後加入化學發光標記物後混勻,室溫下避光反應1h~2h後除雜,得到鼠抗人IgG標記的化學發光標記物。
這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發光免疫分析儀為檢測工具,完成抗環瓜氨酸多肽抗體的檢測這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒,經過實驗,其檢測靈敏度達到0.5U/mL,相對於傳統的抗環瓜氨酸多肽抗體的檢測方法靈敏度至少提高了10倍,這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。
附圖說明
圖1為一實施方式的抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的製備方法的流程圖;
圖2為實施例3得到的抗環瓜氨酸多肽抗體標準曲線圖。
具體實施方式
為使本發明的上述目的、特徵和優點能夠更加明顯易懂,下面結合附圖和具體實施例對本發明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便於充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同於在此描述的其它方式來實施,本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進,因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。
一實施方式的抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒,包括:鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒和鼠抗人IgG標記的化學發光標記物。
優選的,鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒中,鏈黴親和素與羧基化的磁微粒的比例為1:25~35。
優選的,鼠抗人IgG標記的化學發光標記物中,鼠抗人IgG與化學發光標記物的比例為50:1~10。
優選的,羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。
化學發光標記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯吡啶釕或吖啶酯。其中,化學發光標記物優選為吖啶酯。
在其他的實施例中,上述抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒還包括化學發光底物液。
化學發光底物液包括A液和B液。A液可以為H2O2溶液,B液可以為NaOH溶液。
本實施例中,A液為濃度為0.1mol/L的H2O2溶液,B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。
在其他的實施例中,上述抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒還包括抗環瓜氨酸多肽抗體定標品。
抗環瓜氨酸多肽抗體定標品為濃度分別為0U/mL、5U/mL和100U/mL的抗環瓜氨酸多肽抗體的溶液。
具體的,抗環瓜氨酸多肽抗體定標品可以採用標準品緩衝液將抗環瓜氨酸多肽抗體配製成濃度分別為0U/mL、5U/mL和100U/mL的抗環瓜氨酸多肽抗體的溶液。
這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒用於抗環瓜氨酸多肽抗體檢測時,利用全自動化學發光免疫分析儀對抗環瓜氨酸多肽抗體定標品進行檢測,繪製標準曲線,內置於電腦軟體;接著測試實際樣本,根據樣本發光值計算樣本濃度;最後對抗環瓜氨酸多肽抗體全自動化學發光免疫分析系統進行性能(靈敏度、線性、精密度、幹擾性)的評價。
這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發光免疫分析儀為檢測工具,完成抗環瓜氨酸多肽抗體的檢測這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒,經過實驗,其檢測靈敏度達到0.5U/mL,相對於傳統的抗環瓜氨酸多肽抗體的檢測方法靈敏度至少提高了10倍,這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。
此外,這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒還具有以下優點:
1、選擇吖啶酯作為標記材料,並應用於化學發光免疫分析系統,該發光體系為直接化學發光,與傳統的酶促化學發光相比,該反應不需要酶的參與,更加節約成本;
2、選用吖啶酯的化學發光免疫分析系統線性範圍寬,能達到1U/mL~ 100U/mL,而傳統的抗環瓜氨酸多肽抗體的檢測方法的檢線性範圍為2U/mL~ 50U/mL;
3、吖啶酯化學發光免疫分析系統重複性高,批內及批間差均在5%以內,這是其它化學發光免疫分析系統難以達到的;
4、化學發光免疫分析系統已實現樣本的定量,通過內置標準曲線到測試軟體,只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值;
5、化學發光免疫分析系統可以實現全自動化,試劑及樣本的添加全有儀器完成,操作更加簡便,減少了人為的誤差。
如圖1所示的上述抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的製備方法,包括如下步驟:
取羧基化的磁微粒的懸浮液,磁分離去上清後用MES緩衝液重懸,接著加入EDC水溶液,活化羧基化的磁微粒的表面羧基,接著加入鏈黴親和素,室溫下混懸2h~10h,磁分離去除上清後用Tris緩衝液重懸,得到鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒。
MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)緩衝液的濃度為0.02M,pH為5.5。
Tris緩衝液的濃度為0.1M並且含有2%BSA,pH為8.0。
EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)水溶液的濃度為10mg/mL~20mg/mL,EDC與羧基化的磁微粒的比例為0.05:0.1~1。
優選的,鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒中,鏈黴親和素與羧基化的磁微粒的比例為1:25~35。
優選的,羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。
取鼠抗人IgG,加入碳酸鹽緩衝液後混勻,然後加入化學發光標記物後混勻,室溫下避光反應1h~2h後除雜,得到鼠抗人IgG標記的化學發光標記物。
碳酸鹽緩衝液濃度為0.1M,pH為9.0~9.5,
除雜的操作為離心脫鹽柱脫鹽,具體操作為:先分別用純淨水及TBS緩衝液(40 mM Tris-HCl,0.5% BSA,1% NaCl,pH 8.0)處理離心脫鹽柱,最後加入得到的鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒的溶液,最後收集離心管中的液體。
優選的,鼠抗人IgG標記的化學發光標記物中,鼠抗人IgG與化學發光標記物的比例為50:1~10。
化學發光標記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯吡啶釕或吖啶酯。其中,化學發光標記物優選為吖啶酯。
得到的鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒和鼠抗人IgG標記的化學發光標記物組合即可得到上述抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒。
這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒在使用時,還需要化學發光底物液和抗環瓜氨酸多肽抗體定標品。
化學發光底物液和抗環瓜氨酸多肽抗體定標品可以自行配製得到。
化學發光底物液包括A液和B液。A液可以為H2O2溶液,B液可以為NaOH溶液。
本實施例中,A液為濃度為0.1mol/L的H2O2溶液,B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。
具體的,抗環瓜氨酸多肽抗體定標品可以採用標準品緩衝液將抗環瓜氨酸多肽抗體配製成濃度分別為0U/mL、5U/mL和100U/mL的抗環瓜氨酸多肽抗體的溶液。
這種抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的製備方法簡單方便,製得的抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的檢測靈敏度較高,具有良好的應用前景。
以下為具體實施例。
實施例1:抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的製備
(1)鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒的製備:
取含有50mg粒徑為0.05μm~1μm的羧基化的磁微粒(MagnaBind21353)懸浮液,磁分離去上清,用0.02 M,pH為5.5 MES緩衝液重懸,加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液,活化磁珠表面羧基,加入4mg鏈黴親和素(biorbyt,貨號orb48780),室溫下混懸6h,磁分離,去除上清,用含2%BSA的0.1M,pH為8.0的Tris緩衝液重懸到1mg/mL,得到鏈黴親和素包被的羧基化的磁微粒,每瓶5mL分裝保存於4℃備用。
(2)鼠抗人IgG標記的吖啶酯的製備:
取50μL濃度為25mg/mL的鼠抗人IgG,加入150μL濃度為0.1M、pH為9.0~9.5的碳酸鹽緩衝液,混勻,然後加入1.5μL濃度為5mg/mL的吖啶酯溶液混勻,室溫下避光反應,1.5h後取出,用2mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理,脫鹽過程中首先分別用純淨水及TBS緩衝液進行處理,最後加入得到的鼠抗人IgG標記的吖啶酯溶液,收集離心管中的液體至保存管得到鼠抗人IgG標記的吖啶酯,每瓶5mL分裝保存於4℃備用。
(3)抗環瓜氨酸多肽抗體定標品的製備:
用標準品緩衝液(40 mM Tris-HCl,0.5% BSA,1% NaCl,pH 7.4)將抗環瓜氨酸多肽抗體配置成濃度為0U/mL、5U /mL和100 U /mL,每瓶1 mL分裝,4 ℃保存備用。
實施例2:抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測方法
以全自動化學發光免疫分析儀(YHLO,貨號iFlash3000)為檢測工具,方法學模式為兩步間接免疫測試法,即儀器依次加入5 μL的樣品、100 μL的抗環瓜氨酸多肽抗體樣本稀釋液、50μL的生物素標記的環瓜氨酸多肽抗原以及50 μL的鏈黴親和素包被的磁微粒,反應10 min後,再加100 μL的鼠抗人IgG標記的吖啶酯,反應10 min後,進行磁分離,儀器將反應混合物送入暗室,依次加入發光底物A液(H2O2)及B液(NaOH)進行發光反應,最後記錄發光值。
實施例3:抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒性能評價
採用實施例2中的方法對抗環瓜氨酸多肽抗體定標品進行檢測,得到繪製標準曲線如圖2所示。
接著對接著測試實際樣本,根據樣本發光值計算樣本濃度。
靈敏度的檢測:
參照CLSI EP17-A 文件推薦實驗方案,計算抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的靈敏度,求得的靈敏度為0.5U /mL。
線性的檢測:
對濃度為1 U/mL、5U/mL、20 U/mL、50 U/mL、100 U/mL 標準品做線性分析,計算線性相關係數,r=0.9996,另外,該試劑盒對抗環瓜氨酸多肽抗體樣品檢測的線性範圍為1U/ml ~100U/mL。
精密度測定:
取濃度為20U/mL及100U/mL兩個抗環瓜氨酸多肽抗體樣品,每個樣本每個濃度各做3個平行,用三批試劑盒進行檢測,計算試劑盒批內及批間差,結果表明該試劑盒批內及批間差均小於5%。
幹擾性實驗:
取混合血清分別添加幹擾物包括:結合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯,添加比例按照 1:20進行,分別測定混合血清及添加了各種幹擾物後混合血清的測值,計算二者之間的偏差,以 ±10%為可接受範圍。結果表明,幹擾性均達到 NCCLS 的文件標準,可用於臨床實驗室抗環瓜氨酸多肽抗體 狀況的準確評估。
實施例4、抗環瓜氨酸多肽抗體化學發光免疫檢測試劑盒的對比實驗
分別用化學發光檢測方法和傳統的酶聯免疫吸附法對濃度為1 U/mL、5U/mL、20 U/mL、50 U/mL、100 U/mL的抗環瓜氨酸多肽抗體樣品做檢測,兩種方法檢測靈敏度相比,數據如下表所示:
由上表可以看出,化學發光檢測方法的靈敏度較酶聯免疫吸附法提高了約20倍。
以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式,其描述較為具體和詳細,但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是,對於本領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明構思的前提下,還可以做出若干變形和改進,這些都屬於本發明的保護範圍。因此,本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。