一株沙雷氏桿菌及其在製備地爾硫卓手性前體中的應用的製作方法

2023-05-10 10:33:36 2

專利名稱：一株沙雷氏桿菌及其在製備地爾硫卓手性前體中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株沙雷氏桿菌及其應用，具體地說，涉及一株產立體選擇性酯水解酶的沙雷氏桿菌及其在製備地爾硫卓手性前體中的應用方法。
背景技術：
地爾硫卓(diltiazem)是70年代合成的苯並噻平類鈣離子通道阻滯劑，由於該藥療效確切，毒副作用小，長期以來，被廣泛應用於心絞痛和高血壓的長期治療。採用化學-酶法合成地爾硫可以簡化合成路線、提高收率、降低成本。在化學-酶法生產工藝中，一般採用脂肪酶催化拆分(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，其中不需要的(+)-異構體被酶選擇性地水解，而有用的(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯被完整地保留下來，作為起始原料用於合成單一對映體(+)-地爾硫卓。已有一些文獻和專利涉及了這方面的技術，較為典型的有(1)歐洲專利EP 362 556(其同等優先專利為JP 221016/88)於1990年公開了採用數種微生物，如Achromobacter cycloclasters IAM 1013，Alcaligenes faecalis OUT 8030，以及Serratia marcescens ATCC 27117等，催化(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯立體選擇性水解的方法，但反應的底物濃度非常低，後處理較為複雜，收率也不高。
(2)美國專利USP 5,274,300(1989-2-10申請，1993-12-28授權)公開了一種在多相酶膜反應器系統中利用微生物來源的商品酶製劑(例如Lipase OF和Lipase MAP等)催化拆分(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯及其結構類似物的方法。其主要特徵在於將含有酶的水相與含有底物的有機溶劑相分別置於中空纖維膜的兩側進行反應，並利用亞硫酸氫鈉(NaHSO3)與醛的加成反應，消除水解產物(對甲氧苯基縮水甘油酸)脫羧後的副產物(對甲氧基苯乙醛)對酶可能造成的不利影響。該方法的主要缺點是所用商品酶的成本較高，產品光學純度不夠好，而且需要複雜的膜反應器設備。
(3)文獻J Ferment Bioeng 1994，7859-63報導了一種比較可行的微生物酶促拆分方法。該方法將微生物Serratia marcescens Sr41 8000發酵所產的胞外脂肪酶，固定在中空纖維膜上，用於催化(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯的水解拆分。該方法的不足之處是仍需先將酶進行提取後上載到膜反應器上，其技術和設備比較複雜，而且酶在反應器中並不十分穩定，22℃下的半衰期只有127小時，其生產效率隨反應器運行逐步降低。此外，該工藝需要使用特製的能耐受有機溶劑的中空纖維膜，而且由於反應過程中底物和產物的跨膜傳質阻力較大，因此在一定程度上限制了酶催化效率的發揮。

發明內容
本發明的目的在於，提供一株能產(+)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯立體專一性水解酶的微生物菌株Serratia sp.ECU1010及其相應的產酶培養基和培養條件，並公開一種酶促拆分法製備手性藥物地爾硫合成前體(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯的方法。
本發明通過如下方案實現(1)從土壤及本實驗室所保藏的菌株中篩選能高效拆分(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯的微生物，結果得到一株產(+)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯水解酶的微生物菌株Serratia sp.ECU1010。
(2)對菌株Serratia sp.ECU1010進行發酵產酶條件優化，用其游離酶或用載體如「優派吉C」(Eupergit C，德國Degussa公司的一種商品化環氧樹脂)進行固定化後的酶作為生物催化劑。
(3)將生物催化劑置於水-有機溶劑(如異丙醚或甲苯)兩相反應體系中，催化(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯的拆分反應，經過常規處理後，回收穫得地爾硫手性前體(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯。
(一)菌株從土壤及本實驗室所保藏的菌株中，經初篩、復篩及分離純化，獲得一株產(+)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯水解酶的菌株Serratia sp.ECU1010，水解(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯得到了(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯。因此，本發明選擇沙雷氏桿菌Serratia sp.ECU1010作為發酵產酶菌株，該菌株現保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京市海澱區中關村北一條13號)，保藏號為CGMCCNO.1219；保藏號日期2004年9月14日；分類命名沙雷氏桿菌(Serratia sp)。
(二)菌株特性(Serratia sp.ECU1010)1、大小形態為短桿菌，菌體長度約0.9～2.0μm，直經0.5～0.8μm，具有周鞭毛可幫助其運動；2、適合生長環境可在溫度10～40℃，pH5～9、NaCl濃度0～7％(w/v)環境中生存；3、培養特性一些沙雷氏菌會產生紅色色素，然而不產色素的菌株也很常見，大約有20％左右會產生紅色色素，通常在室溫或僅在室溫才可形成色素。Serratiasp.ECU1010能產紅色色素，但產色素能力與培養條件密切相關，所產色素不穩定，菌株在4℃保存一段時間後，其紅色會褪去。
(三)菌株的培養1、斜面培養蛋白腖0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.2wt％，NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，瓊脂2wt％，pH為6.5，將冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養基上，30℃恆溫培養2天；2、搖瓶培養吐溫-80 0.1～1.5wt％，糊精0～3.0wt％，蛋白腖0～4.5wt％，玉米漿0～3wt％，硫酸銨0～1.0wt％，K2HPO40.2wt％，NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0～0.01wt％，CaCl20～0.1wt％，pH為5～8，搖瓶裝液量10～30v/v％，接種量2～10v/v％，培養溫度20～40℃，搖床轉速100～200rpm，搖瓶培養1～3天；產酶可達到4000～10000U/L。
3、罐中發酵培養基與搖瓶培養相同。在5L發酵罐裝入培養基3L，121℃滅菌後，接入200ml種子培養液，然後於25～35℃，通氣量為1.5～6.0L/min(相當於0.5～2.0vvm)，攪拌轉速為200～400轉/分，發酵至12～36小時放罐，離心收集發酵液上清。
(四)酶催化拆分反應
1、培養後的發酵液經離心取上清液作為酶源，以(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯為底物，其加入量為10-200g/L(反應物總體積)，酶的加入量為10～100U/g底物，在甲苯、異丙醚、甲基叔丁基醚、環己烷或氯仿等有機溶劑，最好是異丙醚和Tris-HCl緩衝液組成的兩相體系中進行水解反應，油-水兩相的體積比為1/9-9/1(v/v)，最好在1/2-3/1範圍內，反應溫度為20～50℃，最好為25～40℃，控制反應轉化率在50～52％，反應時間為3～30小時。
2、將培養後的發酵液離心取上清液，不經任何預處理，直接加入高分子樹脂(如樹脂Eupergit C、矽膠、硅藻土等)進行固定化。省去了用中空纖維膜進行固定化時酶的提取步驟，簡化了操作，節約操作時間，同時減少了酶活損失。所製得的固定化酶作為生物催化劑，在上述條件下進行水解反應。固定化酶可重複多次使用進行水解反應。
(一)(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯的提取和精製收集反應的有機相，先用5％的NaHSO3溶液洗滌，再用5％的NaHCO3溶液洗滌，經無水硫酸鎂乾燥處理後，減壓蒸餾，在適當溶劑(如異丙醇)中結晶，即可得到高純度的晶體(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯(ee＞99％)。
採用本發明的方法，工藝過程簡單，反應條件溫和；所用酶的催化活性和立體選擇性較高；製備的固定化酶穩定性高，可連續反應5批以上。所獲得的(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯光學純度可達99％ee以上。該方法具有簡單實用、成本低廉的優點，可望在工業上推廣應用。
具體實施例方式
下面將通過實施例對本發明的技術內容作進一步的闡述，其目的是為更好理解本發明的內容。因此，所舉之例並不限制本發明的保護範圍。
實施例1斜面培養蛋白腖0.5wt％，酵母膏0.5wt％，K2HPO40.2wt％，NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，瓊脂2wt％，pH6.5。將冷凍保存的甘油懸液接種到斜面(平板)培養基上，30℃恆溫培養大約1.5天。產酶培養吐溫-80 1.0wt％，蛋白腖3.0wt％，K2HPO40.2wt％，NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，pH7.0，250ml搖瓶裝液量30ml，接種量2.5v/v％，培養溫度25℃，搖床轉速200rpm，在上述條件下搖瓶培養2天，產酶可達到4780U/L。
酶活單位(U)的定義為在25℃、pH7.0條件下，每分鐘水解對硝基苯酚乙酸酯(1.0mmol/L)，生成1μmol對硝基苯酚所需的酶量。
實施例2斜面培養與實施例1相同。在250ml搖瓶中裝入30ml培養基，其組成如下吐溫-80 1.0wt％，糊精2.0wt％，玉米漿3.0wt％，硫酸銨0.5wt％，K2HPO40.2wt％，NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0.001wt％，pH6.5。將在30℃、150rpm條件下預培養12小時的培養液作為種子，按5v/v％的接種量轉入4個裝有150ml相同培養基的1L搖瓶中，在培養溫度30℃，搖床轉速150rpm的條件下培養24小時，酶產量為9480U/L。
實施例3種子培養與實施例2相同。在5L發酵罐中裝入3L培養基，其組成如下糊精2wt％，玉米漿1.5wt％，硫酸銨0.5wt％，K2HPO40.2wt％，NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O0.05wt％，CaCl20.05wt％，pH6.5。培養基滅菌後，接入預培養12小時的種子液200ml，在30℃、400rpm和0.5vvm條件下通氣發酵，其間在5-11小時勻速流加吐溫-80共6g，若產生泡沫則滴加泡敵(1wt/v％水溶液)進行消泡。發酵15小時後放罐，測得酶產量為5600U/L。
實施例4取實施例1中的發酵液5ml，離心取上清，加入同等體積甲苯，再加入1.40g(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，於30℃和150rpm的搖床上保溫反應，保持反應pH恆定在8.5。當反應進行到6小時，轉化率接近50％，所得(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯的分析得率為46.2％，光學純度＞98％ee，對映選擇率(E值)超過100。
實施例5取實施例1中的發酵液10ml，離心取上清，加入2g環氧樹脂「優派吉C」(Eupergit C，德國Degussa公司產品)，於30℃和150rpm的搖床上保溫2小時後，過濾、洗滌固定化酶。將其懸浮在5ml pH8.0的Tris-HCl緩衝液中，加入5ml異丙醚，再加入0.104g(±)-對甲氧基苯基縮水甘油酸甲酯，於30℃和150rpm的搖床上保溫反應，保持反應pH恆定在8.0，反應時間為10-14小時。將反應結束後濾出的固定化酶加入新的反應底物繼續反應，如此重複利用5次後，活力沒有明顯的下降，所得(-)-對甲氧基苯基縮水甘油酸甲酯的光學純度均＞98％ee，E值超過100。
實施例6取實施例2中的發酵液100ml，離心取上清，加入30g環氧樹脂Eupergit C，於30℃和150rpm的搖床上保溫2小時後，過濾、洗滌固定化酶。將所得固定化酶顆粒懸浮在50ml pH8.0的Tris-HCl緩衝液中，加入50ml甲苯，再加入2.08g(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，於35℃和150rpm的搖床上保溫反應，保持反應pH恆定在8.5，反應時間為10-14小時。將反應結束後，收集有機相，濾出的固定化酶加入新的反應底物繼續反應，如此重複利用5次。收集5批反應的有機相，用5％的NaHSO3洗滌三次，再用5％的NaHCO3洗滌，無水硫酸鎂乾燥處理後，減壓蒸餾，結晶得到高純度的(-)-對甲氧基苯基縮水甘油酸甲酯晶體(ee＞99％)，收率為42％。
M.P.87-88℃；[α]D20-207.08(c＝1，甲醇)。
實施例7在帶有機械攪拌和恆溫水浴的三頸燒瓶中，加入(±)-對甲氧基苯基縮水甘油酸甲酯1.0mol(208g)和甲基叔丁基醚溶液2.0L，攪拌至全部溶解。然後取實施例3中的發酵液1.0L，將水浴溫度調至28℃，開動機械攪拌(200轉/分)，同時插入pH電極，用自動電位滴定儀滴加1.0N的NaOH溶液，控制pH在8.0±0.1範圍，並根據耗鹼量計算酶促水解的轉化率。結果，反應6小時後，轉化率為51％，停止反應，用分液漏鬥分出有機相，界面混濁部分倒入鋪有硅藻土的布氏漏鬥進行抽濾，合併水相和有機相，水相用甲基叔丁基醚萃取兩次(300ml×2)；有機相依次用少量5％NaHSO3、5％NaHCO3、去離子和飽和食鹽水洗滌，再加無水硫酸鎂乾燥後，旋轉蒸發回收有機溶劑，得到微黃色固體95.7g，收率為46％，在甲醇中重結晶後得到82.3g光學純(＞99.9％ee)的無色晶體。
根據本發明公開的技術方案和實施例，有關的工程技術人員可以方便地將本發明所說的微生物菌種及其培養與轉化工藝，舉一反三地應用於其它反應體系(如微乳液和離子液體)中其它結構類似的手性底物(例如3-芳基縮水甘油酸乙酯及其它短鏈脂肪醇酯)的催化動力學拆分。
權利要求
1.一種沙雷氏桿菌菌株Serratia sp.ECU1010，保藏號為CGMCC No.1219。
2.如權利要求1所說的菌株的應用，其特徵在於，所說的菌株可用於拆分(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯。
3.如權利要求2所說的應用，其特徵在於，其中所說的拆分(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯包括如下步驟(1)權利要求1所說的菌株ECU1010進行發酵培養，發酵液經分離後得游離脂肪酶；(2)將由步驟(1)所得的游離脂肪酶或其固定化物與消旋底物(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯在能溶解底物(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯而與水不互溶的有機溶劑中反應，油-水兩相的體積比為1/9～9/1，反應溫度為20～50℃，反應時間為3～30小時後收集有機相即得(-)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯；其中底物(±)-對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯加入量為10～200g/L，酶的加入量為10～100 U/g底物。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，其中步驟(1)中所說的發酵培養包括下列步驟(1)斜面培養蛋白腖0～0.5wt％，酵母膏0～0.5wt％，K2HPO40.2wt％，NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O 0.05wt％，FeSO4·7H2O 0～0.001wt％，瓊脂2wt％，pH為5～8，將冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養基上，20～40℃恆溫培養1～3天；(2)搖瓶培養吐溫-80 0.1～1.5wt％，糊精0～3.0wt％，蛋白腖0～4.5wt％，玉米漿0～3wt％，硫酸銨0～1.0wt％，K2HPO40.2wt％，NaCl 0.05wt％，MgSO4·7H2O0.05wt％，FeSO4·7H2O 0～0.01wt％，CaCl20～0.1wt％，pH為5～8，搖瓶裝液量10～30v/v％，接種量2～10v/v％，培養溫度20～40℃，搖床轉速100～200rpm，搖瓶培養1～3天；(3)罐中發酵培養基與搖瓶培養的相同，種子培養液接種量為2～10％，然後於25～35℃，通氣量為0.5～2.0vvm，攪拌轉速為200～400轉/分，發酵至12～36小時放罐。
5.如權利要求3所說的應用，其特徵在於，其中步驟(2)中所說的有機溶劑為環己烷、正庚烷、異辛烷、氯仿、甲苯、異丙醚或甲基叔丁基醚中的一種。
6.如權利要求3所說的應用，其特徵在於，其中步驟(2)中所說的游離脂肪酶固定化物，其載體為硅藻土或高分子樹脂。
7.如權利要求6所說的應用，其特徵在於，其中所說的載體是「優派吉C」。
全文摘要
本發明涉及一種產立體選擇性酯水解酶的沙雷氏菌菌株及其在製備地爾硫手性前體中的應用。本發明所說的菌株在進行發酵培養後所產的胞外脂肪酶可用於拆分消旋物(±)－對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，從而獲得生產心血管藥物地爾硫所需的關鍵手性前體——(－)－對甲氧苯基縮水甘油酸甲酯。實驗表明，所說的沙雷氏菌脂肪酶具有催化效率高、選擇性強、產品光學純度好且回收容易等優點。
文檔編號A01G7/00GK1644012SQ20041006704
公開日2005年7月27日 申請日期2004年10月11日 優先權日2004年10月11日
發明者許建和, 郜莉, 潘江, 龍章德 申請人:華東理工大學