酶轉化生產l—鳥氨酸的方法
2023-05-09 21:51:21
專利名稱：酶轉化生產l—鳥氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及L-鳥氨酸的製備方法。
背景技術：
目前，國內外對於酶法轉化生產L-鳥氨酸的文獻尚未見報導。L-鳥氨酸的製備方法主要有化學法和發酵法，其中化學法是以精氨酸為原料，經鹼法水解或利用精氨酸酶水解得到L-鳥氨酸；而發酵法是利用微生物發酵生產L-鳥氨酸，常用於發酵生產L-鳥氨酸的微生物有穀氨酸棒桿菌、乳酸發酵短桿菌、大腸桿菌、解烴棒桿菌、潔白鏈黴菌等。由於化學法生產L-鳥氨酸條件苛刻，大量使用有機溶劑，給環境帶來嚴重汙染；而發酵法生產L-鳥氨酸產量低(一般只有10g/L)，周期長，產物雜質多，分離困難；採用上述方法製備L-鳥氨酸產率不高，所以生產的L-鳥氨酸成本很高，給實際推廣應用帶來了很大困難。
發明內容
本發明的目的在於提供一種L-鳥氨酸的製備方法，該製備方法通過對糞腸球菌進行篩選、誘變獲得一株L-鳥氨酸產率很高、專一性強的菌株糞腸球菌CGMCC NO.1786，選用合適的培養基在最適培養條件下培養一定時間，加入精氨酸，在最佳轉化條件下酶轉化生產L-鳥氨酸，轉化液通過離子交換樹脂柱的分離、純化後，可得到高純度的L-鳥氨酸。該方法具有生產條件溫和、生產周期短、產品純度高、產量高、生產成本低等優點。
本發明的整體技術構思是發酵法生產L-鳥氨酸，該方法由下列工藝步驟組成(1)將糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養基製成斜面菌種；(2)將斜面菌株擴大培養作為種子液；(3)將種子液接入發酵罐中進行發酵；(4)加入精氨酸作為底物進行轉化；(5)L-鳥氨酸的分離純化。
本發明的具體工藝步驟及工藝條件是
步驟(1)中斜面培養基由下列重量份組分組成葡萄糖5-10份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15-20份和水1000份；製備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.0-8.0、溫度25-35℃、培養時間為24-48小時。
步驟(2)中種子液和步驟(3)中發酵液由下列重量份組分組成葡萄糖40-60份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份，硫酸鎂0.5-1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；發酵的工藝條件為發酵液接種量為10-15％，pH值為6.0-7.5，培養溫度為25-35℃，通風量為0.5-1.0vvm，攪拌轉速為120-160轉/分鐘，發酵時間為24-36小時。
步驟(4)中轉化條件為底物精氨酸質量濃度為120-150g/l，轉化溫度為30-55℃，轉化時間為36-72小時，攪拌轉速為80-120轉/分鐘。在此轉化條件下，精氨酸轉化為L-鳥氨酸的轉化率達95-99.5％，每升發酵液中含L-鳥氨酸90-112g。
步驟(5)中α-熊果苷的分離純化包括以下四個步驟a、將發酵完成後的發酵液在4000轉/分鐘條件下離心20分鐘；b、把經過a步驟後的發酵液通過弱酸性陽離子交換樹脂柱除去陽離子雜質，弱酸性陽離子交換樹脂柱為724型樹脂柱；c、把經過b步驟的發酵液通過磺酸型陽離子交換樹脂柱進一步進行分離純化，磺酸型陽離子交換樹脂柱為D001樹脂柱；d、把經過c步驟的發酵液真空濃縮、結晶，即可得到純度為99％以上的L-鳥氨酸，真空乾燥真空度為0.1Mpa，溫度為60度，乾燥後的成品為白色粉末狀。
本發明所用的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786已經在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為糞腸球菌CGMCC NO.1786，保藏時間為2006年8月28日。
糞腸球菌CGMCC NO.1786的篩選，由下列工藝步驟組成(1)將安培管糞腸球菌菌種接種斜面製得斜面菌種；(2)將復壯後菌種塗布平板；(3)將平板菌落接種搖瓶發酵培養，進行初篩和復篩；(4)將復篩後的菌株進行複合誘變。
步驟(1)中斜面培養基和步驟(2)中的平板培養基由下列重量份組分組成葡萄糖5-10份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15-20份和水1000份；製備斜面菌種和平板的工藝條件為pH值為7.0-8.0、溫度25-35℃、培養時間為24-48小時。
步驟(3)中發酵液由下列重量份組分組成葡萄糖40-60份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份，硫酸鎂0.5-1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；發酵的工藝條件為pH值為7.0-7.5，培養溫度為25-35℃，攪拌轉速為120-160轉/分鐘，發酵時間為24-36小時。
步驟(4)中誘變依次包括種子菌懸液的製備，誘變劑的加入量，紫外照射時。
將斜面菌種接種到含5ml生理鹽水試管中，往試管中加入體積百分比為0.5％-2.0％的硫酸二乙酯誘變劑，在漩渦振蕩器上振蕩1-2min，取0.5ml該菌懸液塗布平板，把平板放在紫外燈照射20-60s，然後把平板暗培養。培養條件為培養溫度25-35℃、培養時間為48-72小時。
最後，得到糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786。
本發明所取得的技術進步在於本發明是糞腸球菌CGMCC NO.1786酶法生產L-鳥氨酸，具有生產成本低，生產條件溫和，轉化體系中雜質較少，工藝步驟簡單，生產操作安全等優點。採用本發明生產L-鳥氨酸產量高，每升發酵液中含有90-112g L-鳥氨酸，精氨酸轉化率可達99.5％。通過離子交換樹脂分離純化，純度可達到99.5％以上，具有重大工業化意義。
實施例以下結合實施例對本發明做進一步描述。
實施例1(1)菌種斜面培養將糞腸球菌CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養基製成斜面菌種；其中菌種斜面培養基由下列重量份組分組成葡萄糖5份、尿素20份、玉米漿3.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15份和水1000份；製備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.5、溫度30℃、培養時間為24小時。
(2)接種發酵將斜面菌株擴大培養作為種子液；將種子液按10％的接種量接入發酵罐中進行發酵；其中種子液和發酵液由下列重量份組分組成葡萄糖60份、尿素15份、玉米漿3.0份，硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；發酵的工藝條件為發酵液接種量為10％，pH值為6.0，培養溫度為30℃，通風量為0.8vvm，攪拌轉速為160轉/分鐘，發酵時間為36小時。
(3)生產L-鳥氨酸加入底物質量濃度為150g/l；其中轉化條件為轉化溫度為35℃，轉化時間為48小時，攪拌轉速為100轉/分鐘。在此轉化條件下，精氨酸轉化為L-鳥氨酸的轉化率達99.5％，每升發酵液中含L-鳥氨酸112g。
(4)L-鳥氨酸的分離純化，包括以下四個步驟a、將發酵完成後的發酵液在4000轉/分鐘條件下離心20分鐘；b、步把經過a步驟後的發酵液通過724型弱酸性陽離子交換樹脂柱除去NH4+、K+、Mg2+等陽離子雜質；c、把經過b步驟的發酵液通過D001磺酸型陽離子交換樹脂柱進一步進行分離純化；d、步驟中的真空乾燥真空度為0.1Mpa，溫度為60℃，乾燥後的成品為白色粉末狀，純度達99.5％。
實施例2(1)菌種斜面培養將糞腸球菌CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養基製成斜面菌種；其中菌種斜面培養基由下列重量份組分組成葡萄糖8份、尿素15份、玉米漿3.0份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15份和水1000份；製備斜面菌種的工藝條件為pH值為8.0、溫度40℃、培養時間為36小時。
(2)接種發酵將斜面菌株擴大培養作為種子液；
將種子液按10％的接種量接入發酵罐中進行發酵；其中種子液和發酵液由下列重量份組分組成葡萄糖50份、尿素20份、玉米漿3.5份，硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；發酵的工藝條件為發酵液接種量為10％，pH值為6.5，培養溫度為37℃，通風量為1.0vvm，攪拌轉速為140轉/分鐘，發酵時間為36小時。
(3)生產L-鳥氨酸加入底物質量濃度為135g/l；其中轉化條件為轉化溫度為44℃，反應時間為48小時，攪拌轉速為100轉/分鐘。在此轉化條件下，精氨酸轉化為L-鳥氨酸的轉化率達95.0％，每升發酵液中含L-鳥氨酸96.2g。
(4)L-鳥氨酸的分離純化，包括以下四個步驟a、將發酵完成後的發酵液在4000轉/分鐘條件下離心20分鐘；b、步把經過a步驟後的發酵液通過724型弱酸性陽離子交換樹脂柱除去NH4+、K+、Mg2+等陽離子雜質；c、把經過b步驟的發酵液通過D001磺酸型陽離子交換樹脂柱進一步進行分離純化；d、步驟中的真空乾燥真空度為0.1Mpa，溫度為60℃，乾燥後的成品為白色粉末狀，純度達99.5％。
實施例3(1)菌種斜面培養將糞腸球菌CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養基製成斜面菌種；其中菌種斜面培養基由下列重量份組分組成葡萄糖10份、尿素10份、玉米漿2.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15份和水1000份；製備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.0、溫度30℃、培養時間為48小時。
(2)接種發酵將斜面菌株擴大培養作為種子液；將種子液按15％的接種量接入發酵罐中進行發酵；其中種子液和發酵液由下列重量份組分組成葡萄糖45份、尿素20份、玉米漿3.0份，硫酸鎂0.5份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份；
發酵的工藝條件為發酵液接種量為10％，pH值為6.0，培養溫度為30℃，通風量為0.8vvm，攪拌轉速為160轉/分鐘，發酵時間為36小時。
(3)生產L-鳥氨酸加入底物質量濃度為125g/l；其中轉化條件為轉化溫度為50℃，反應時間為48小時，攪拌轉速為100轉/分鐘。在此轉化條件下，精氨酸轉化為L-鳥氨酸的轉化率達98.5％，每升發酵液中含L-鳥氨酸92.4g。
(4)L-鳥氨酸的分離純化，包括以下四個步驟a、將發酵完成後的發酵液在4000轉/分鐘條件下離心20分鐘；b、步把經過a步驟後的發酵液通過724型弱酸性陽離子交換樹脂柱除去NH4+、K+、Mg2+等陽離子雜質；c、把經過b步驟的發酵液通過D001磺酸型陽離子交換樹脂柱進一步進行分離純化；d、步驟中的真空乾燥真空度為0.1Mpa，溫度為60℃，乾燥後的成品為白色粉末狀，純度達99.5％。
權利要求
1.酶轉化生產L-鳥氨酸的方法，其特徵在於所述的糞腸球菌酶轉化生產L-鳥氨酸，生產過程由下列工藝步驟組成(1)將糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786菌種接種到試管中的斜面培養基製成斜面菌種；(2)將斜面菌種擴大培養作為種子液；(3)將種子液接入發酵罐中進行發酵，其發酵條件為發酵液接種量為10-15％，pH值為6.0-7.5，培養溫度為25-35℃，通風量為0.5-1.0vvm，攪拌轉速為120-160轉/分鐘，發酵時間為24-36小時；(4)加入精氨酸作為底物進行轉化，其轉化條件為底物精氨酸質量濃度為120-150g/l，轉化溫度為30-55℃，轉化時間為36-72小時，攪拌轉速為80-120轉/分鐘。在此轉化條件下，精氨酸轉化為L-鳥氨酸的轉化率達95-99.5％，每升發酵液中含L-鳥氨酸90-112g；(5)L-鳥氨酸的分離純化。
2.根據權利要求1所述的酶轉化生產L-鳥氨酸的方法，其特徵在於所述的(1)步驟中的斜面培養基由下列重量份組分組成葡萄糖5-10份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份、硫酸鎂1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份，瓊脂15-20份和水1000份。
3.根據權利要求1或2所述的酶轉化生產L-鳥氨酸的方法，其特徵在於製備斜面菌種的工藝條件為pH值為7.0-8.0、溫度25-35℃、培養時間為24-48小時。
4.根據權利要求1所述的酶轉化生產L-鳥氨酸的方法，其特徵在於所述的(2)步驟中的種子液和(3)步驟中發酵液由下列重量份組分組成葡萄糖40-60份、尿素10-20份、玉米漿2.0-3.5份，硫酸鎂0.5-1.0份、磷酸氫二鉀1.0份、氯化鈉5.0份、碳酸鈣2.0份、硫酸鐵0.02份、硫酸錳0.02份和水1000份。
5.根據權利要求1所述的酶轉化生產L-鳥氨酸的方法，其特徵在於所述的(5)步驟中的L-鳥氨酸的分離純化包括以下四個步驟a、將發酵完成後的發酵液離心除去菌體；b、把經過a步驟後的發酵液通過弱酸性陽離子交換樹脂柱除去陽離子雜質；c、把經過b步驟的發酵液通過磺酸型陽離子交換樹脂柱進一步進行分離純化；d、把經過c步驟的發酵液真空濃縮、結晶，即可得到純度為99.5％以上的L-鳥氨酸。
6.根據權利要求5所述的酶轉化生產L-鳥氨酸的方法，其特徵在於所述的a步驟發酵液在4000轉/分鐘條件下離心20分鐘；b步驟中的弱酸性陽離子交換樹脂柱為724型樹脂柱；c步驟中的磺酸型陽離子交換樹脂柱為D001樹脂柱；d步驟中的真空乾燥真空度為0.1Mpa，溫度為60度，乾燥後的成品純度達99.5％以上。
7.糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786。
全文摘要
本發明涉及L－鳥氨酸的製備方法，它包括斜面種子的製備，培養基的選擇，轉化條件的優化和產物的提取等工藝步驟。本發明通過糞腸球菌酶轉化生產L－鳥氨酸，具有生產成本低，生產條件溫和，轉化體系中雜質較少，工藝步驟簡單，生產操作安全等優點。採用本發明生產L－鳥氨酸產量高，每升發酵液中含有90－112g L－鳥氨酸，精氨酸轉化率可達99.5％。L－鳥氨酸是細胞中重要的代謝化合物，對於生物體內氨態氮的排出有重要調節作用；此外，L－鳥氨酸還是重要的醫藥工業基礎原料。
文檔編號C12R1/01GK1908177SQ20061011203
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月29日 優先權日2006年8月29日
發明者張鵬, 張淑榮, 劉春巧, 楊育紅 申請人:張鵬, 張淑榮, 劉春巧