特異性免疫核糖核酸的製備及應用的製作方法
2023-05-09 21:47:51 2
專利名稱：特異性免疫核糖核酸的製備及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於治療、預防禽類疾病的特異性免疫核糖核酸的製備及應用，屬生物醫藥技術領域。
背景技術：
畜牧業是我國國民經濟的重要組成部分。目前畜牧業產值佔全國農業總產值的三分之一，已成為我國農業經濟中的支柱產業，在國民經濟中發揮著越來越重要的作用。而禽類傳染病作為影響畜牧業健康發展的重要因素，歷來受到世界各國的重視。禽類疫病一旦爆發流行，如得不到有效控制和撲滅，就會造成重大的經濟損失和公共衛生安全事故，影響社會穩定。
我國家禽養殖業受疾病因素的影響每年造成的經濟損失佔總收入的30%以上，嚴重製約了養殖業的可持續性發展。我國家禽養殖業主要受到三種疾病形式的威脅①過去已被控制的重大動物傳染病，至今又捲土重來並大面積流行；②由於病原體逃避機體的免疫監視而發生變異，使過去已被基本控制的重大動物傳染病至今又以新的流行特點、新的發病症狀在我國流行(如禽流感、雞傳染性支氣管炎等)；③新出現一些過去在我國從未流行的傳染病(如雞傳染性貧血病等)。這種不同疾病的流行形式，使我們顧此失彼和防不勝防。毫無疑問，隨著今後大規模集約化飼養家禽的發展，家禽傳染病的發生和流行的周期會越來越短，對養殖業所造成的經濟損失也會越來越大。因此如何及時控制家禽傳染病的流行，保證我國養殖業重上新臺階，給動物預防部門和獸醫科研人員提出了新的挑戰，但同時又為我們進行生物技術產品的開發提供了難得的機遇。
另一方面，由於抗生素、激素飼料的大量使用，我國禽肉、蛋產品藥物殘留嚴重，食品安全亮起紅燈。目前，我國養殖企業和養殖戶急需有一類能夠替代抗生素施治且能夠滿足食品安全要求、藥效強力而無害無殘留的藥物。採用生物技術途徑生產生物製劑不失為上策。因為生物產品療效高，且採用純物理方法製備，使這種製劑不含任何潛在的汙染成分和藥物殘留問題。
特異性免疫核糖核酸(immune RNA, iRNA)是動物經某種病原體的抗原免疫後，從免疫動物的免疫活性細胞(存在於動物脾臟、肝臟、淋巴等臟器)中提取出來的核糖核酸 (RNA)，具有對病原高度的特異性和針對性；它具有傳遞相應抗原特異性免疫信息的能力， 因而注入體內後，可發揮對該抗原的殺滅、抑制、中和等免疫清除作用。
iRNA可使末致敏感的淋巴細胞轉異性，且不受動物種屬的影響。iRNA的作用發生迅速，維持時間也較長，可達數月至一年以上。iRNA具有免疫特異性，能特異地轉移供體的遲髮型超敏反應，這種免疫轉移無種屬特異性，能在種間交叉轉移。由於iRNA是小分子成份(分子量在13500道爾頓左右)，無抗原性，長期應用，機體也不產生抗體。
免疫核糖核酸製劑已經在治療人類疾病方面得到過應用，如B肝、腫瘤、狂犬病等 (楊琳等，抗狂犬病免疫核糖核酸的分離純化，中華微生物學和免疫學，2010年第30卷第2 期)。經檢索，未見現有技術中有關治療禽類疾病的特異性免疫核糖核酸相關的文獻報導。發明內容
根據現有技術狀況，本發明目的在於提供一種無毒副作用、原料易得、成本低廉且適合於工業化生產的能夠用於治療、預防禽類疾病的特異性免疫核糖核酸的製備；另一目的在於提供一種原料易得、成本低廉、適用於工業化生產的特異性免疫核糖核酸的應用技術。
本發明的技術實施方案如下
1、免疫原(疫苗)的製備用國家標準病原體毒株接種易感雞胚胎，收穫感染胚液，經提純、濃縮、滅活，加MAC進口佐劑乳化而成製得免疫原(疫苗)，然後按程序單一或聯合免疫健康禽類。
2、禽類免疫根據不同抗原、不同禽類採用不同的免疫途徑，加強免疫後抽血檢測抗體效價。此處的禽類除來源廣泛的雞、鴨外，還包括鵝、鴿、鵪鶉、火雞、雉雞、鴕鳥、孔雀等野生或飼養的禽鳥類。
現以養殖量和屠宰量最大的雞為例。
用製備的上述雞傳染性新城疫(副粘病毒)疫苗免疫健康雞群，皮下多點注射，每雞1 5ml ；在首次免疫後的第7 20天進行強化免疫，肌肉注射每雞1. 5 3ml ；在強化免疫後的第7 20天進行再強化免疫，肌肉注射每雞1. 5 :3ml。
3、特異性免疫核糖核酸的製備免疫動物屠宰後，取脾臟、肝臟等，然後由臟器中製備特異性免疫核糖核酸。
1)粗提脾臟、肝臟、胰臟或淋巴結等臟器去掉結締組織及被膜，用生理鹽水洗淨、切碎，洗去血液並擠幹。每200g組織加100 300ml鹽水，置高速組織搗碎機中製成勻漿；向上述勻漿中加入苯酚溶液及0. SDS，混勻，置30 70°C水浴振蕩30min並置冰浴冷卻，離心，取上清液置冰浴中。
2)精製在上清中加入一半量的苯酚溶液，室溫下劇烈振蕩，離心，取水相；加2 3倍體積90% 95 %酒精，置冰箱8h，離心，棄上清，沉澱物即為要製備的特異性免疫核糖核酸。
4、檢測取上述沉澱，進行理化、活性檢測。
1)ρΗ值取沉澱溶於IOml蒸餾水中，其pH值應為6. 8 8. 0。
2)吸收度用紫外分光光度計檢測，其0擬60/0D280應不小於2. 0。
3)DNA含量測定用標準DNA作對照，以紫外法測定，DNA含量不大於5%。
4)RNA含量測定按《中國藥典》二部附錄法測定，含量應在0.95mg以上。
5)分子量測定以核糖核酸酶A(相對分子質量13700)、胰島素(5808)、胸腺肽 al (3108)、生長激素釋放因子(1521)作相對分子質量標準，製作標準曲線，採用高效液相色譜法測定。
6)異常毒性以注射用生理鹽水製成0. 5mg/ml溶液，家兔可靜脈注射，應無異常反應。
7)無菌檢查溶於6ml無菌水中，分別接種於普通培養基，厭氧培養基及黴菌培養基，培養1周，應無菌生長。
8)活性測定採用白細胞粘附抑制試驗。其原理為正常白細胞在體外培養時，可粘附於玻璃表面，而用iRNA處理過的白細胞，其粘附於玻璃表面的能力則被抑制，測知該粘附抑制率，即知iRNA活性。方法為取綿羊抗凝血，分離白細胞，將白細胞調節為在血細胞計數板上每大格內含40 80個細胞的濃度。取細胞懸液，加等體積iRNA溶液，37°C水浴後，移入血細胞計數板，置37°C溫育後，用生理鹽水衝洗、計數。同時作正常白細胞(不加 iRNA)對照。計算白細胞粘附抑制率，如大於20%為合格。
將採用本發明製得的特異性免疫核糖核酸進行臨床試驗，方法及結果如下
以雞傳染性新城疫病為例。
已被確診患新城疫病的817肉食雞，以死亡、體重減輕、檢出病毒或檢出抗體為判定標準，將其分為治癒、有效、無效三個等級進行統計，用製備的抗新城疫的特異性免疫核糖核酸進行緊急預防與治療實驗，預防用量為每雞肌注0. 5ml，治療肌注1ml。結果如下表
表1緊急預防與治療效果統計
權利要求
1.特異性免疫核糖核酸的製備及應用，其特徵在於(1)、免疫原(疫苗)的製備用國家標準病原體毒株接種易感雞胚胎，收穫感染胚液，經提純、濃縮、滅活，加MAC進口佐劑乳化而成製得免疫原(疫苗)，然後按程序單一或聯合免疫健康禽類；用雞傳染性新城疫(副粘病毒)疫苗免疫健康雞群，皮下多點注射，每雞1 5ml ；在首次免疫後的第7 20天進行強化免疫，肌肉注射每雞1. 5 3ml ；在強化免疫後的第7 20天進行再強化免疫，肌肉注射每雞1. 5 3ml ； (2)、特異性免疫核糖核酸的製備將上述經免疫的雞養7 10天後屠宰，取脾臟、肝臟、胰臟或淋巴結等臟器去掉結締組織及被膜，用生理鹽水洗淨、切碎，洗去血液並擠幹；每200g組織加100 300ml鹽水，置高速組織搗碎機中製成勻漿；向上述勻漿中加入苯酚溶液及0. SDS，混勻，置30 70°C水浴振蕩30min並置冰浴冷卻，離心，取上清液置冰浴中；在上清中加入一半量的苯酚溶液，室溫下劇烈振蕩，離心，取水相； 加2 3倍體積90% 95%酒精，置冰箱8小時，離心，棄上清，沉澱物即為要製備的特異性免疫核糖核酸。
2.根據權利要求1所述的特異性免疫核糖核酸，其特徵在於採用權利要求1所述的方法製備而得。
3.根據權利要求1所述的特異性免疫核糖核酸的應用，其特徵在於由於特異性免疫核糖核酸無種屬特異性，因而製備時可以使用成本低廉、飼養量和屠宰量較大的肉食雞作為特異性免疫核糖核酸的來源，而用於治療雞本身及鴨、鵝、鴿、鵪鶉、火雞、雉雞、鴕鳥、孔雀等野生或飼養的禽鳥類的各種疾病。
全文摘要
本發明公開了一種特異性免疫核糖核酸(iRNA)的製備及應用，屬生物醫藥技術領域。該方法用國家標準病原體毒株接種易感雞胚胎而製得免疫原(疫苗)，然後按程序單一或聯合免疫健康禽類，收集其健康的脾臟、肝臟等臟器，經過粗提、精製，即由臟器中獲取針對禽類各種疾病的特異性免疫核糖核酸。本發明製備的特異性免疫核糖核酸使用後具有療效顯著、作用迅速、無毒副作用的特點，容易保存，便於運輸，生產工藝簡單，適合於工業化生產。
文檔編號C12N15/11GK102477425SQ20101055712
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月24日 優先權日2010年11月24日
發明者曹吉祥 申請人:曹吉祥