一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑麴黴β‑葡萄糖苷酶表達酶活的方法與流程
2023-05-03 19:41:36 3
本發明屬於基因工程領域,涉及一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑麴黴β-葡萄糖苷酶表達酶活的方法。
背景技術:
纖維素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱,它不是單體酶,而是起協同作用的多組分酶系,是一種複合酶,主要由外切β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成。
在纖維素酶降解纖維素的時候,外切酶先把纖維素酶解為短鏈可溶的片段,內切酶把短鏈的片段酶解為纖維二糖,纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下酶解為葡萄糖。纖維素酶酶解纖維素是一個協同降解的過程,某一種酶活性過高或者過低都會降低纖維素酶解效率。
黑麴黴是一種食品安全菌,產生的纖維素酶具有廣闊的應用領域,比如汙水處理、垃圾利用、食品等。黑麴黴生產的纖維素酶中β-葡萄糖苷酶的酶活相對較高,三種酶的組成不利於最大化的發揮酶的催化效率。降低β-葡萄糖苷酶的活性是優化纖維素酶酶系組成的一個重要措施。已有的降低某種酶的表達效率的措施主要為基因敲除,也取得了一些效果。
技術實現要素:
本發明的目的在於克服現有技術存在的缺點與不足,提供一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑麴黴β-葡萄糖苷酶表達酶活的方法。本發明的目的還在於提供一種磷酸鹽誘導β-葡萄糖苷酶活性降低的黑麴黴菌株。
本發明的目的通過下述技術方案實現:
一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑麴黴β-葡萄糖苷酶表達酶活的方法,包括如下步驟:
(1)將由磷酸鹽誘導啟動子或含磷酸鹽誘導啟動子的DNA序列、表達與β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA的DNA序列和終止子序列組成的DNA片段構建到表達載體上;
(2)將步驟(1)所構建的重組載體轉化到黑麴黴中;
(3)往培養基中加入磷酸鹽後對轉化有重組載體的黑麴黴菌株進行培養。
步驟(1)中所述的含磷酸鹽誘導啟動子的DNA序列優選如SEQ ID NO.1所示。
步驟(1)中所述的表達與β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA的DNA序列優選如SEQ ID NO.2所示。
步驟(1)中所述的終止子序列優選如SEQ ID NO.3所示。
步驟(1)中所述的表達載體優選為pMW1載體。
步驟(1)優選為:將序列如SEQ ID NO.4所示的DNA片段通過限制性內切酶EcoI、KpnI及DNA連接酶構建到pMW1載體上,得到重組載體。
步驟(2)中所述的黑麴黴優選為黑麴黴ATCC16404。
步驟(2)優選通過農桿菌將所構建的重組載體轉化到黑麴黴中。
步驟(3)中所述的培養基的配方優選為:麩皮10g,蛋白腖1g,牛肉膏1g,水1L。
步驟(3)中所述的磷酸鹽優選為磷酸鈉。
一種磷酸鹽誘導β-葡萄糖苷酶活性降低的黑麴黴菌株,為上述方法中構建的轉化有重組載體的黑麴黴菌株。
本發明具有如下優點和有益效果:本發明利用磷酸鹽誘導啟動子調控β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA轉錄,有效降低了β-葡萄糖苷酶的翻譯量和表達的活性,從而優化了黑麴黴表達的纖維素酶系組合,以最大化發揮纖維素酶系降解纖維素的效率。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述,但本發明的實施方式不限於此。
實施例1
1. 材料
黑麴黴(Aspergillus niger)ATCC16404,大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α,根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1,pMW1質粒(BioVector質粒載體菌種細胞基因保藏中心)。
人工合成的DNA序列1(SEQ ID NO.4所示),該序列由含磷酸鹽誘導啟動子的DNA序列、表達與β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA的DNA序列、終止子序列及兩端的酶切位點序列組成。
2. 方法
(1)質粒pMW1的提取
含有質粒pMW1的大腸桿菌DH5α在含有30μg/mL氨苄黴素的LB培養基中培養18h。質粒提取按照上海生工的一步法質粒DNA抽提試劑盒(產品編號B518188)的操作流程提取。具體如下:取0.5mL菌液,10000r/m離心3min收集菌體,倒盡或吸乾培養基。在菌體沉澱中加入700μL Lysis Buffer UF,吸打或振蕩至徹底懸浮菌體,室溫放置3min。將裂解液全部小心移入吸附柱,室溫放置1min,8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一個收集管中,向吸附柱中加入500μL Prewash Solution,8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一個收集管中,向吸附柱中加入500μL Wash Solution,8000rpm離心1min。倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一個收集管中,再次向吸附柱中加入500μL Wash Solution,8000rpm離心1min。倒掉收集管中的液體,將吸附柱放入同一個收集管中,將空吸附柱和收集管放入離心機,8000rpm離心2min。將吸附柱放入乾淨的1.5mL離心管中,在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer,室溫靜置2min,8000r/m離心2 min。將所得到的質粒DNA溶液置於-20℃保存或用於後續試驗。
(2)重組質粒的構建
1)pMW1質粒、合成的DNA序列1的酶切、回收
往20μL提取的pMW1質粒或用雙蒸水稀釋10倍的DNA序列1中加入EcoI和KpnI(Takara)各2μL、酶切緩衝液2.5μL,37℃水浴3h後,加入2μL Loading Buffer,終止反應。
酶切的質粒或DNA序列1通過瓊脂糖凝膠電泳後用上海生工的SanPrep核酸純化套件(膠回收)試劑盒(B515103-0100)回收,得pMW1質粒酶切回收液、DNA序列1酶切回收液。
2)連接和轉化
連接體系為:pMW1質粒酶切回收液17.5μL,DNA序列1酶切回收液2μL,DNA連接酶(Takara)2.5μL,連接酶緩衝液2.5μL。16℃連接24h,連接產物備用。
將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,挑取轉化子培養,提質粒進行酶切、測序鑑定,鑑定正確的重組質粒命名為pMW1-01。
(3)黑麴黴孢子原生質體製備及重組質粒的轉化
1)斜面活化
在無菌操作臺中,將保藏的黑麴黴ATCC16404菌種接入已滅菌的斜面培養基中,置於30℃恆溫培養箱中培養3天,斜面長出孢子。
所用斜面培養基為PDA培養基,其配製方法為:取新鮮馬鈴薯60g,去皮切成細絲狀,加入適量蒸餾水,置於蒸煮鍋內煮沸並不斷用玻璃棒攪拌至快成糊狀,用八層紗布過濾取濾液,依次加入用天平稱取的葡萄糖2g、瓊脂2g,攪勻,最後用蒸餾水定容至100mL,加熱溶解。分裝於試管中,約至試管的三分之一,然後加塞包紮滅菌,滅菌溫度為121℃,壓強為0.1Mpa,滅菌20min。滅菌結束後擺斜面冷卻待用。
2)孢子懸浮液的製備
將已活化的黑麴黴孢子從試管中刮到裝有生理鹽水的三角瓶中,置於30℃搖床上,150r/m震蕩10min。取出用4層擦鏡紙過濾,將濾液用3000r/m離心,棄上清液,用生理鹽水洗滌1-2次。然後對懸浮液進行鏡檢和計數,調整孢子濃度約為5×108個/mL,50℃熱激1min,30℃培養8h,得到孢子萌發懸浮液。
3)原生質體懸液的製備
採用高滲溶液即0.8mol/L NaCl溶液配製0.5%蝸牛酶和1%纖維素酶的混合酶液10mL,加入10mL孢子萌發懸浮液,30℃水浴4h,用微孔濾膜過濾,再用0.8mol/L NaCl溶液反覆衝洗濾膜上的孢子,最後濾膜上的孢子溶解到10mL 0.8mol/L NaCl溶液中,得到原生質體懸液。
4)根癌農桿菌感受態的製備
挑取根癌農桿菌AGL1接種於3mL LB液體培養基中,28℃、180r/min培養過夜。取2mL 培養液接種於100mL LB液體培養基中繼續培養,至OD600為0.5左右。將培養液置冰浴中40min後4℃、5000r/min 離心10min,棄去上清液。用10mL 4℃預冷的無菌水離心洗滌1次,棄去上清液。再用10mL 4℃預冷的10%甘油懸浮菌體,4℃、5000r/min離心5min,棄去上清液。最後用1mL 4℃預冷的10%甘油懸浮,分裝成每管70μL,-70 ℃保存。
5)根癌農桿菌的轉化和培養
取1μL重組質粒pMW1-01,加到70μL根癌農桿菌AGL1感受態細胞中,混勻,吸取並加到間距0.2cm電轉杯中,擦拭乾淨,調節電擊電壓為2.5kV,電擊5ms。將電轉化後的根癌農桿菌塗布於LB平板(含100μg/mL氨苄黴素)上進行篩選。篩選得到的陽性克隆子在LB平板(含100μg/mL氨苄黴素)上劃線,28℃培養2d。挑取單菌落接種於5mL LB液體培養基(含100μg/mL氨苄黴素)中,28℃、180r/min培養16~20h。取1mL根癌農桿菌菌液接種於含有相應抗性的100mL LB液體培養基中,28℃、180r/min培養至OD600為0.8左右時備用。
6)誘導培養和轉化
根癌農桿菌的誘導培養:取4mL(OD600=0.8)的根癌農桿菌菌液5000r/min離心5min收集菌體,用6mL含有400μmol/L乙醯丁香酮的IM培養基懸浮菌體,28℃懸浮培養5h。IM培養基:KH2PO4 1.45g,K2HPO4 2.05g,NH4NO3 0.5g,CaCl2 0.01g,MgSO4·7H2O 0.6g,NaCl 0.3g,葡萄糖2g,甘油5g,1000mL水,鹽酸調節pH 5.4。
轉化:黑麴黴原生質懸液250μL,調節誘導後的根癌農桿菌菌液的濃度,按黑麴黴孢子與根癌農桿菌1:100的數量比例等體積混合均勻,塗布在轉化媒介醋酸硝酸混合膜的IM固體培養基上。
7)轉化子的篩選
塗布在轉化媒介醋酸硝酸混合膜的IM固體培養基上的黑麴黴24℃避光培養48h,然後將原生質體長處的菌絲用無菌水稀釋後塗到含有150μg/mL潮黴素B的IM固體培養基上進行初篩,培養4d,隨後轉接至含有200μg/mL潮黴素B的IM培養基上進行復篩,獲得轉化成功的轉化子。
(4)誘導啟動降低β-葡萄糖苷酶的表達活性
1)產酶培養
產酶培養基配製:麩皮10g,蛋白腖1g,牛肉膏1g,自來水1L,115℃滅菌30min。在250mL三角瓶中裝入150mL液體產酶培養基。
在無菌操作臺中,將黑麴黴菌種或篩選的轉化子接入已滅菌的斜面PDA培養基中,置於30℃恆溫培養箱中培養3d,得到斜面孢子。得到的斜面孢子接入到產酶培養基中,接種量為 1×105孢子/mL,150r/m、30℃培養36h,培養液用濾紙過濾,測定濾液β-葡萄糖苷酶的酶活。出發菌株的酶活為22U/mL,所篩選轉化子的酶活為21.0U/mL。
β-葡萄糖苷酶酶活測定按照文獻(張莉,王婧,楊婷。產β-葡萄糖苷酶釀酒酵母菌株紫外誘變選育及酶學性質分析。《食品工業科技》, 2015。)中的方法。
2)磷酸鹽誘導產酶培養
往產酶培養基中加入磷酸鈉,磷酸鈉的終濃度為2g/L。在無菌操作臺中,將黑麴黴菌種或篩選的轉化子接入已滅菌的斜面PDA培養基中,置於30℃恆溫培養箱中培養3d,得到斜面孢子。黑麴黴菌種或篩選的轉化子接入到誘導培養基中,接種量為 1×105 孢子/mL,150r/m、30℃培養培養36h,濾紙過濾,測定濾液β-葡萄糖苷酶的酶活。出發菌株的酶活為25U/mL,所篩選轉化子的酶活為7.8U/mL。這說明啟動子在磷酸鹽誘導下,啟動β-葡萄糖苷酶反義mRNA的轉錄,降低了β-葡萄糖苷酶的翻譯量,從而降低了其表達量。
上述實施例為本發明較佳的實施方式,但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式,都包含在本發明的保護範圍之內。
SEQUENCE LISTING
湖北工業大學
一種磷酸鹽誘導啟動子降低黑麴黴β-葡萄糖苷酶表達酶活的方法
1
4
PatentIn version 3.3
1
1346
DNA
Artificial
含磷酸鹽誘導啟動子的DNA序列
1
agctgcaatc attcgaatcg actggtcctt tatcggtcat acgcaccaaa gttggccggg 60
agtcagtcag aagggcgcac gcgtgtgacc agcccggctg cagatcccgg caacaggttc 120
gtcgggccaa tcggtaaaag gatgagagta tatatatata tataacgcat attggttttt 180
tattggtttg cttacccaca ggagttcaag ggaactgaca tatattatga ttgtaatgcc 240
tgatatataa tgctttattg tcccgatcaa agcgatctgt ggtctttatg atatctgatg 300
acttgaaaag gcggatgggc gggggacgga aggctagaca aggatgatgt ttgcatatag 360
tactagtaca gcttggggag gtaataatat aactatcttg atgctggttg gccttttgtg 420
acatggctgc ggggagtcgt ggtccgcttc catttgtacg aggcccggag cataaccaga 480
acggtgccca ggccccggga gcattcaggg gaatgacagc cccttcatac tccagactta 540
cagaaacaac tcaaatagtc tacttactcc gtgctagtca attcagcttt catccctgag 600
aatcaacccg aggatgattg gtccacgtgc ccacccgcaa agtcccggag cgggaaatgc 660
tcataaccgg gctgtggcgg tgcagaaatt ggaagtagtt gggaagttca acttgcagtt 720
gctgtacccg caaccgggaa gttcggcccg ccctgcgttt ttctcggttg cagggcacgg 780
aatgactaat gtgtggcgac gctcgaagtt acagtgtaag gacatagtaa ctcgtagtca 840
ctcgtaagta actctggtgt ctttgtgttc gtctcagcca cagcctgctc gctggccgtc 900
atagccgtag atctcggcaa acctcaactt gttccgttcc tcccaaggcc catcttgctc 960
tcccatctcc ttctccattc ttctcctcat acttacgagg ttctcctcta tattcccacc 1020
ctctcctctc tcccccccac tactttgatc aaagagagtg cttttgctct ctgatgagtc 1080
ccgttttgtt acaggtgcta cggcaatctt agtcgacacc tgtgtttttt ctcgctcccc 1140
tacaaaccgt gcgtgttcct ttcatccgcc tcgagaaaaa tcccgcagct ttaacaaccg 1200
gtccccgtca aactaacccg cgatttctgt ctgccagagt tctcgagata attcgccgtg 1260
tcgtatatct cgtttgcctt tccatcgttg agctcatagc atattaaatt tcagctcgca 1320
ttacgccata gaaaaattgc cgcgat 1346
2
110
DNA
Artificial
表達與β-葡萄糖苷酶mRNA互補的反義mRNA的DNA序列
2
acagacacaa agaccggtaa agttgaggcg cgggatctcg gcaatgaagc cggagcagcc 60
agtcttcgag ctcactccag ccgtgagatt gaccttttcg tcgtccgtca 110
3
214
DNA
Artificial
終止子序列
3
cgacaagctc gacctcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa 60
ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat 120
ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta 180
ctaaaatcca gatcccccga attaattcgg cgtt 214
4
1686
DNA
Artificial
DNA序列1
4
ggggtaccag ctgcaatcat tcgaatcgac tggtccttta tcggtcatac gcaccaaagt 60
tggccgggag tcagtcagaa gggcgcacgc gtgtgaccag cccggctgca gatcccggca 120
acaggttcgt cgggccaatc ggtaaaagga tgagagtata tatatatata taacgcatat 180
tggtttttta ttggtttgct tacccacagg agttcaaggg aactgacata tattatgatt 240
gtaatgcctg atatataatg ctttattgtc ccgatcaaag cgatctgtgg tctttatgat 300
atctgatgac ttgaaaaggc ggatgggcgg gggacggaag gctagacaag gatgatgttt 360
gcatatagta ctagtacagc ttggggaggt aataatataa ctatcttgat gctggttggc 420
cttttgtgac atggctgcgg ggagtcgtgg tccgcttcca tttgtacgag gcccggagca 480
taaccagaac ggtgcccagg ccccgggagc attcagggga atgacagccc cttcatactc 540
cagacttaca gaaacaactc aaatagtcta cttactccgt gctagtcaat tcagctttca 600
tccctgagaa tcaacccgag gatgattggt ccacgtgccc acccgcaaag tcccggagcg 660
ggaaatgctc ataaccgggc tgtggcggtg cagaaattgg aagtagttgg gaagttcaac 720
ttgcagttgc tgtacccgca accgggaagt tcggcccgcc ctgcgttttt ctcggttgca 780
gggcacggaa tgactaatgt gtggcgacgc tcgaagttac agtgtaagga catagtaact 840
cgtagtcact cgtaagtaac tctggtgtct ttgtgttcgt ctcagccaca gcctgctcgc 900
tggccgtcat agccgtagat ctcggcaaac ctcaacttgt tccgttcctc ccaaggccca 960
tcttgctctc ccatctcctt ctccattctt ctcctcatac ttacgaggtt ctcctctata 1020
ttcccaccct ctcctctctc ccccccacta ctttgatcaa agagagtgct tttgctctct 1080
gatgagtccc gttttgttac aggtgctacg gcaatcttag tcgacacctg tgttttttct 1140
cgctccccta caaaccgtgc gtgttccttt catccgcctc gagaaaaatc ccgcagcttt 1200
aacaaccggt ccccgtcaaa ctaacccgcg atttctgtct gccagagttc tcgagataat 1260
tcgccgtgtc gtatatctcg tttgcctttc catcgttgag ctcatagcat attaaatttc 1320
agctcgcatt acgccataga aaaattgccg cgatacagac acaaagaccg gtaaagttga 1380
ggcgcgggat ctcggcaatg aagccggagc agccagtctt cgagctcact ccagccgtga 1440
gattgacctt ttcgtcgtcc gtcacgacaa gctcgacctc gagtttctcc ataataatgt 1500
gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg ttcctatagg gtttcgctca tgtgttgagc 1560
atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct 1620
aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa tccagatccc ccgaattaat tcggcgttga 1680
attcgg 1686