固定化細胞酶法製備l－鳥氨酸的方法
2023-05-09 22:00:51
專利名稱：固定化細胞酶法製備l－鳥氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及利用固定化微生物細胞製備L-鳥氨酸的方法，更具體的說本發明涉及將含精氨酸脫亞氨酶和鳥氨酸氨甲醯轉移酶的細胞固定化，通過上述固定化細胞內酶的作用將底物L-精氨酸轉化為L-鳥氨酸。屬酶工程技術領域。
二、技術背景人體中蛋白質的主要代謝產物是尿素。肝臟中含有精氨酸酶，可以水解L-精氨酸產生L-鳥氨酸與尿素。L-鳥氨酸也是生物合成L-精氨酸的前體，L-精氨酸能參與蛋白質的組成。L-鳥氨酸在人體中起著非同尋常的作用，尿素的形成必須有L-鳥氨酸的參與。L-鳥氨酸的缺乏可能會給生命帶來危險。L-鳥氨酸可用於肝中毒的治療(GB1020492，1966)。L-鳥氨酸作為解毒劑通過鳥氨酸循環將血氨排出體外。將L-鳥氨酸與ATP結合後其解氨毒的能力會得到極大的提高(GB1083911，1967)。加入適量L-鳥氨酸的蛇麻草可用於美容、豐胸，也可用於防治良性的囊腫和惡性腫瘤(CA2404275，2001)。如果定期服用按一定比例配製的L-精氨酸與L-鳥氨酸混合物，會有良好的減肥效果(GB2199243，1988)。L-鳥氨酸衍生物還可以用於抑鬱症、乏力和神經緊張等疾病的治療(GB1385562，1975)。α-二氟甲基-L-鳥氨酸治療牛皮癬、前列腺肥大和腫瘤的療效也非常好(JP2188558，1990)。
根據現有的文獻報導，L-鳥氨酸生產工藝主要有以下三種1化學法目前工業上最常用的生產方法是採用化學法鹼水解L-精氨酸製備L-鳥氨酸，1966年Shell Int.Rearsch採用丙烯酸和氰化鈉作為主要原料化學合成DL-鳥氨酸。(GB1020492，1966)。
2發酵法用腸桿菌中的某些菌如Escherichia coli，Aerobacter aerogenes，Proteus rettgeri和Proteus mirabili的突變菌株，進行發酵生產L-鳥氨酸，發酵液中L-鳥氨酸最高為15mg/mL(GB1098348，1968；US3668072，1972)，Nakazawa等採用Corynebacterium屬的某些種如C.glutamicum AJ11589、C.glutamicum ATCC13032和C.acetoacidophilum ATCC13870發酵生產L-鳥氨酸(JP57016696，1982)。Shibuya等利用Arthrobacter citreus 23-2A的突變株發酵生產L-鳥氨酸，發酵72h產率為35.2g/L。Shigezo等用Micrococcusglutamicus ATCC No.13232發酵生產L-鳥氨酸，發酵72h單位產量為26.2g/L，實得L-鳥氨酸鹽酸鹽結晶18g/L(US2988489，1961)。Brevibacteriumlactofermentum AJ-11678(Yoshimura，et al.，JP57166988，1982)也可用於L-鳥氨酸的發酵生產。1999年陳寧等報導利用穀氨酸棒桿菌突變株發酵生產L-鳥氨酸，產量為9.85g/L(天津輕工業學院學報，2000，320-24)。
3酶法1981年，沈淑英等用糞鏈球菌ATCC8043，糞產鹼桿菌ATCC21400，糞鏈球菌S-43游離細胞轉化底物L-精氨酸製備L-鳥氨酸，轉化率為95-100％，提取收率為85-90％(天津微生物，1981，328-38)。1995年，M Kyriakos等利用從動物肝臟中提取的精氨酸酶水解L-精氨酸用於多種L-鳥氨酸鹽的製備(US5405761，1995)。
上述L-鳥氨酸酶法生產過程都是利用游離細胞轉化底物L-精氨酸，所以轉化液中會含有少量菌體蛋白和其它雜質，不利於產物的分離純化；且轉化後要去除菌體，降低產物得率，導致生產成本增加。游離細胞轉化且不利於工業化連續生產，所以酶的利用率也不高。
到目前為止，有關固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法未見報導。
發明內容
1.發明目的本發明的目的在於提供一種固定化微生物細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法。
2.技術方案(1)菌種在本發明中，用於L-鳥氨酸生產的菌種有糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)、中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)、棲息微球菌(Micrococcus sedentarius)、格氏沙雷氏菌(Serratiagrimesii)和阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)等。
(2)培養基及培養條件
①種子培養種子培養基(1000mL)葡萄糖10-30g，牛肉膏5-10g，蛋白腖10-20g，磷酸二氫鉀1-5g，硫酸鎂0.2-1.0g，西紅柿汁10-100mL，pH6.5-7.5，121℃滅菌20min。
種子培養時裝液量為50-100mL/250mL三角瓶，接種量為一根長滿的試管斜面，培養溫度為30-37℃，搖床轉速為100-200r/min。
②發酵培養發酵培養基(1000mL)酵母膏5-20g，葡萄糖10-20g，蛋白腖5-20g，玉米漿5-10g，磷酸二氫鉀1.0-2.0g，硫酸鎂0.5-1.0g，pH7.0-7.5。121℃滅菌20min。
發酵培養時裝液量為50-150mL/250mL三角瓶，接種量為2％-10％，培養溫度為25-37℃，搖床轉速為100-200rpm。
(3)一種固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵步驟如下①菌種活化取經冷凍乾燥保藏的菌種用適量的無菌液體種子培養基溶解，然後接入液體種子培養基中恆溫培養，然後取上述種子接入新鮮的種子培養基繼續活化；②菌種發酵和菌體細胞收集將上述菌種接到發酵培養基中，培養在通氣條件下進行，可以在發酵過程中通過加酸對發酵液進行pH調節，以利於菌體生長，提高菌體產量；將適齡的發酵液離心收集菌體；③細胞固定化將所收集的菌體細胞和一定量的包埋劑混合均勻，加入成型劑中固化成型，還可加強化劑進行強化處理，即得固定化細胞；④L-精氨酸的轉化將上述固定化處理後的含菌體細胞膠體裝柱，將L-精氨酸溶液流經凝膠柱進行生物轉化，收集流出的轉化液，轉化液可重複上柱，直到底物L-精氨酸被完全轉化成L-鳥氨酸；⑤L-鳥氨酸的分離純化將上述轉化液用活性炭脫色去除雜質後，濃縮至合適濃度，結晶，母液可以與下一次轉化液合併濃縮，再結晶，多次重複後母液中L-鳥氨酸可以用陽離子交換柱分離得到，結晶粗品可以通過重結晶進行精製，通過離子交換柱製得的L-鳥氨酸同樣需要進一步精製。精製的方法可以為重結晶，或用乙醇沉澱等。
上述步驟①中所述的菌種包括糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)、中間氣單胞菌(Aeromonas media)、棲息微球菌(Micrococcus sedentarius)、格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)和阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)等。
上述步驟③中所述的包埋劑包括海藻酸鈉、卡拉膠、聚乙烯醇、明膠和甲殼素等；成型劑包括氯化鈣、氯化鉀、硼酸溶液和磷酸鈉溶液等；強化劑包括戊二醛等。
上述步驟③中所述的包埋劑海藻酸鈉和卡拉膠的濃度均為1-5％，菌體細胞的量為1-20％，成型劑氯化鈣或氯化鉀的濃度為1-5％，固化時間為1-3h，固化溫度為20-40℃；用包埋劑聚乙烯醇濃度為5-20％和卡拉膠濃度為0.3-1.2％的混合液，菌體細胞的量為1-20％，成型劑為pH5-8的氯化鉀-硼酸飽和溶液，固化溫度為10-50℃，固化時間為20-50h；用包埋劑明膠的濃度為5-20％，菌體細胞的量為1-20％，固化溫度為4-10℃。膠體強化劑戊二醛的濃度為0.5-3％，強化處理時間為5-120min；用包埋劑甲殼素的濃度為1-10％，菌體細胞的量為1-20％，成型劑磷酸鈉緩衝溶液的pH為4-9，固化溫度為10-50℃，固化時間為12-48h，。
上述步驟④中所述的L-精氨酸濃度為0.1-20％，流經酶轉化柱的速度為10-1000mL/h，轉化溫度為25-45℃。
3.有益效果採用固定化細胞的方法，可以簡便的收集轉化液進行產物製備，簡化了工藝過程，提高了酶的利用率，底物L-精氨酸轉化率在95％以上，產品得率高於80％，且有利於工業化生產過程中的自動控制。
具體實施例方式
實施例1 種子培養和發酵培養一種種子培養基葡萄糖15g，牛肉膏7.5g，蛋白腖15g，磷酸二氫鉀3.5g，硫酸鎂0.5g，西紅柿汁100mL，水900mL，pH7.5，121℃滅菌20分鐘。
一種發酵培養基如下葡萄糖2.0g，酵母膏0.5g，蛋白腖0.7g，玉米漿0.8g，磷酸二氫鉀0.1g，硫酸鎂0.06g，L-精氨酸0.3g，水100mL，pH7.2。
用適量的滅菌過的種子培養基將凍幹的中間氣單胞菌菌種溶化，然後接入裝有50mL液體種子培養基的250mL三角瓶中，於37℃恆溫培養，搖床轉速為200r/min。24hrs後取上述種子10mL接入新鮮的種子培養基繼續活化。
取4mL上述活化好的菌種接入100mL發酵培養基中，200rpm下37℃恆溫培養24h。
實施例2 固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法如實施例1所述發酵培養1000mL中間氣單胞菌，6000rpm離心20min收集菌體，得溼菌體12.5g。洗入1200mL固定劑(3％海藻酸鈉溶液)中，混勻。然後用注射器將含有菌體的海藻酸鈉溶液快速滴入3000mL成型劑(2％CaCl2溶液)中，固化1hr後除去成型劑，並用5000mL生理鹽水洗滌3次。將所得的膠粒裝入直徑5cm，高50cm的玻璃柱中。1000mL 5％L-精氨酸溶液以20mL/h流經膠柱，轉化完全後，收集流出液並減壓濃縮至200mL，用2g活性炭脫色處理。脫色液繼續減壓濃縮至100mL，加入200mL 95％乙醇攪拌均勻，冷卻結晶，真空過濾得晶體乾重35.5g。[α]D20＝+11.0(C＝5.5，H2O)。結晶母液收集與下次轉化液合併處理。
實施例3 固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法如例1的所示的培養方法發酵培養糞腸球菌1000mL，離心收集菌體，離心機轉速為6000rpm，20min。稱菌體溼重10.2g，懸浮在50mL生理鹽水中，37℃水浴保溫。取10g聚乙烯醇(PVA)，加入50mL蒸餾水浸泡1d，加入0.5g卡拉膠，混勻後置高壓鍋中於110℃保溫20min，使PVA充分溶化，取出置45℃水浴保溫。然後將細胞懸浮液與等量的PVA-卡拉膠混合液混合，用針管滴入pH6.4的KCl-飽和硼酸溶液中，4℃下靜置30h，製得糞腸球菌的固定化細胞膠粒。將所得膠粒裝入直徑5cm，高50cm的玻璃柱中。1000mL 5％L-精氨酸溶液以15mL/h流經膠柱，轉化完全後，收集流出液並減壓濃縮至200mL，用2g活性炭脫色處理。脫色液繼續減壓濃縮至100mL，加入200mL 95％乙醇攪拌均勻，冷卻結晶，真空過濾得晶體乾重32.5g。[α]D20＝+11.0(C＝5.5，H2O)。
實施例4 固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法如實施例1所示方法發酵培養解蛋白弧菌100mL，得溼菌體1.2g，洗入120mL固定劑(3％卡拉膠溶液)中，混勻。然後用注射器將含有菌體的卡拉膠溶液快速滴入300mL成型劑(2％KCl溶液)中，固化2hr後除去成型劑，並用500mL生理鹽水洗滌3次。將所得的膠粒裝入直徑3cm，高20cm的玻璃柱中。1000mL的5％L-精氨酸溶液以10mL/h流經膠柱，轉化完全後，收集流出液並減壓濃縮至200mL，用2g活性炭脫色處理。脫色液繼續減壓濃縮至100mL，加入200mL 95％乙醇攪拌均勻，冷卻結晶，真空過濾得晶體乾重34.2g。[α]D20＝+11.2(C＝5.5，H2O)。
實施例5 固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法如實施例1所述發酵培養1000mL棲息微球菌，6000rpm離心20min收集菌體，得溼菌體12g。洗入1000mL的2％固定劑甲殼素溶液中，混勻。然後滴入1000mL的pH7.0的磷酸鈉緩衝溶液中固化24h。將所得的膠粒裝入直徑5cm，高50cm的玻璃柱中。1000mL 5％L-精氨酸溶液以20mL/h流經膠柱，轉化完全後，收集流出液並減壓濃縮至200mL，用2g活性炭脫色處理。脫色液繼續減壓濃縮至100mL，加入200mL 95％乙醇攪拌均勻，冷卻結晶，真空過濾得晶體乾重35.5g。[α]D20＝+11.0(C＝5.5，H2O)。結晶母液收集與下次轉化液合併處理。
實施例6 固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法如實施例1所述發酵培養1000mL格氏沙雷氏菌，6000rpm離心20min收集菌體，得溼菌體10.5g。洗入1000mL固定劑(3％明膠溶液)中，混勻。然後置於4℃低溫凝固，固化2hr後將膠塊切成5mm*5mm的膠粒，並用5000mL的1％的戊二醛強化1hr。將所得的膠粒裝入直徑5cm，高50cm的玻璃柱中。1000mL的5％L-精氨酸溶液以20mL/h流經膠柱，轉化完全後，收集流出液並減壓濃縮至200mL，用2g活性炭脫色處理。脫色液繼續減壓濃縮至100mL，加入200mL 95％乙醇攪拌均勻，冷卻結晶，真空過濾得晶體乾重37.5g。[α]D20＝+10.8(C＝5.5，H2O)。結晶母液收集與下次轉化液合併處理。
權利要求
1.一種用固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其製備步驟如下①菌種活化；取經冷凍乾燥保藏的菌種用無菌液體種子培養基溶解，然後接入液體種子培養基中，恆溫培養，然後取上述種子接入新鮮的種子培養基繼續活化；②菌種發酵和菌體細胞收集；將上述菌種接到發酵培養基中，在通氣條件下培養，然後將適齡的發酵液離心收集菌體；③細胞固定化；將所收集的菌體細胞和包埋劑混合均勻，加入成型劑中固化成型，還可加入強化劑進行強化處理，即得固定化細胞；④L-精氨酸轉化；將上述固定化處理後含菌體細胞的膠體裝柱，將L-精氨酸溶液流經凝膠柱進行生物轉化，收集流出的轉化液，轉化液可重複上柱，直到底物L-精氨酸被完全轉化成L-鳥氨酸；⑤L-鳥氨酸分離純化；將上述轉化液用活性炭脫色去除雜質後，濃縮至結晶，母液中L-鳥氨酸採用陽離子交換柱分離；粗品通過重結晶進行精製。
2.根據權利要求1所述的固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵在於在步驟①中所述的菌種包括糞腸球菌、解蛋白弧菌、中間氣單胞菌、棲息微球菌、格氏沙雷氏菌和阪崎腸桿菌。
3.根據權利要求1所述的固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵在於在步驟③中所述的包埋劑包括海藻酸鈉、卡拉膠、聚乙烯醇、明膠和甲殼素。
4.根據權利要求1所述的固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵在於在步驟③中所述的成型劑包括氯化鈣、氯化鉀、硼酸溶液和磷酸鈉溶液。
5.根據權利要求1所述的固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵在於在步驟③中所述的強化劑為戊二醛。
6.根據權利要求1所述的固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵在於在步驟③中所述的包埋劑海藻酸鈉和卡拉膠的濃度均為1-5％，菌體細胞的量為1-20％，成型劑氯化鈣或氯化鉀的濃度為1-5％，固化時間為1-3h，固化溫度為20-40℃。
7.根據權利要求1所述的固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵在於在步驟③中所述的包埋劑聚乙烯醇濃度為5-20％和卡拉膠濃度為0.3-1.2％的混合液，菌體細胞的量為1-20％，成型劑為pH5-8的氯化鉀-硼酸飽和溶液，固化溫度為10-50℃，固化時間為20-50h。
8.根據權利要求1所述的固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵在於步驟③中所述的包埋劑明膠濃度為5-20％，菌體細胞的量為1-20％，固化溫度為4-10℃，膠體強化劑戊二醛的濃度為0.5-3％，強化處理時間為5-120min。
9.根據權利要求1所述的固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵在於步驟③中所述的包埋劑甲殼素濃度為1-10％，菌體細胞量為1-20％，成型劑磷酸鈉緩衝溶液pH為4-9，固化溫度為10-50℃，固化時間為12-48h，。
10.根據權利要求1所述的固定化細胞酶法製備L-鳥氨酸的方法，其特徵在於步驟④中所述的中所述的L-精氨酸的濃度為0.1-20％流經酶轉化柱的速度為10-1000mL/h，轉化溫度為25-45℃。
全文摘要
本發明是以L－精氨酸為原料的固定化細胞酶法製備L－鳥氨酸的方法。將發酵得到的微生物細胞用不同固定化載體包埋裝柱，讓底物L－精氨酸溶液以一定速度流經固定化細胞填充柱，收集流出液，濃縮結晶或用陽離子交換柱分離純化得L－鳥氨酸。本發明可提高微生物細胞利用率，底物轉化率95％以上，產品得率高於80％。
文檔編號C12P13/00GK1661026SQ20041006604
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月15日 優先權日2004年12月15日
發明者焦慶才, 李加友, 曹瑜, 劉毅, 錢紹松, 陳群 申請人:南京大學