別藻藍蛋白、晶體生產工藝及製品的製作方法

2023-05-10 11:22:01 2

專利名稱：別藻藍蛋白、晶體生產工藝及製品的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白、晶體製造工藝及製品，尤其涉及的是在一般條件下從藻類中提取的能發射強烈螢光的別藻藍蛋白並將其轉化為晶體形態，及其在科研、醫療、檢測、信電等領域的應用。
背景技術：
早在上個世紀初，國外就曾報導在藍藻和紅藻中存在具強烈螢光性的紅色、紫羅蘭色和藍色蛋白質。1910年，Kylin首次將這些色素蛋白定名為「藻色蛋白」(Phycochromo-proteins)。這種大量出現於紅藻、藍綠藻和隱藻中的捕光色素蛋白，就是目前亟待開發的藻膽蛋白(Phycobiliproteins，PBP)，它主要包括藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)，藻藍蛋白(Phycocyanin，PC)，藻紅藍蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)和別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)四種。藻膽蛋白把捕獲的光能高效的傳遞給葉綠素，從而使海藻的光合作用得以發生。
與化學合成的螢光染料相比，別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)純天然來源，資源豐富，物理性質穩定，水溶性好，不與蛋白質、核酸、細胞等發生非特異性吸附，安全且無毒性，對生態環境無汙染。另外別藻藍蛋白摩爾吸光係數大，螢光量子產率高，螢光發射波長大於550nm，強烈吸收光譜帶很寬，有利於選擇激發光源，克服了傳統螢光標記物螢光背景大、易淬滅等缺點，大大提高了螢光檢測的敏感性。
現代研究表明別藻藍蛋白的功能單位是「鬆散的六聚體」，而不是傳統上普遍認為的三聚體，但是由於現在的別藻藍蛋白大多是以凍乾粉或沉澱形式的存在，別藻藍蛋白的功能基團很容易失活，當受到某些物理因素如熱、紫外線照射，高壓和表面張力等或化學因素等影響時，常常會出現生物活性的喪失，一些側鏈基團的暴露，一些物理化學性質的改變和生物化學性質的改變導致蛋白質功能的喪失，不能長期保存。

發明內容
本發明的一個目的在於提供製備別藻藍蛋白溶液的方法，該方法與現有技術相比；只需通過兩種填充介質的柱層析就能製備出不同純度級別的別藻藍蛋白溶液。
本發明的另一個目的在於提供別藻藍蛋白晶體的製備方法，該方法與現有技術相比；在普通的實驗條件下就可以完成，簡單易行。
本發明還針對現有技術的蛋白質處在凍乾粉或沉澱狀態，生物活性容易喪失，不能長期利用，側鏈基團容易暴露，物理化學性質和生物化學性質容易改變，螢光活性低的缺點；提供一種能長期保存，所需的保藏條件要求小，螢光活性高的別藻藍蛋白晶體。
本發明的上述技術問題主要是通過下述技術方案得以解決的一種別藻藍蛋白溶液的製備方法，其特徵在於，將藻細胞破碎後，通過過濾和0-4℃下，6000-10000轉/分鐘(rpm)高速冷凍離心分離，去除沉澱，收集上清，分級鹽析後收集別藻藍蛋白沉澱，沉澱溶解於磷酸鹽緩衝液後依次經過羥基磷灰石、葡聚糖凝膠SephadexG-100、羥基磷灰石柱層析，羥基磷灰石柱層析時使用濃度範圍為0.005-0.4摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩衝液洗脫，控制流速在0.5-2.5毫升/分鐘，最後收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5、A650/A280＞5.0一種或多種不同純度要求的別藻藍蛋白溶液，製成不同純度級別的別藻藍蛋白溶液。
作為優選，所述製備別藻藍蛋白溶液的方法，其特徵在於，所述別藻藍白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用0.005-0.05摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩衝液洗脫。
作為優選，所述製備別藻藍蛋白溶液的方法，其特徵在於，所述別藻藍蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用線性梯度磷酸鹽緩衝液洗脫，洗脫流速控制在0.8-1.6毫升/分鐘。
現有技術製備別藻藍蛋白溶液的方法為將藻膽蛋白粗品上樣於磷酸緩衝液(10mmol/L，pH值7.0，0.1mol/L NaCL)平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(2.6cm×20cm)，用含0.1～1mol/L NaCL的磷酸鹽緩衝液進行梯度洗脫。收集的樣品透析後上樣於上述同樣緩衝平衡的羥基磷灰石柱(1.6cm×10cm)，10～300mmol/L磷酸鹽緩衝(pH值7.0，0.1mol/L NaCL)梯度洗脫。收集的樣品用固體硫酸銨沉澱透析後，上樣SephacrylS-200柱(1.6cm×80cm)，洗脫液為10mmol/L，pH值7.0的磷酸鹽緩衝液(含0.2mol/LNaCL)；對比技術中分離得到的別藻藍蛋白純度為5.0；與之相比，本發明別藻藍蛋白的純化是將細胞破碎抽提液經過一次HA柱再過Sephadex G-100，然後在過一次HA柱，同時可以得到A565/A280＞4.0、A565/A280＞4.5、A565/A280＞5.0一種或多種不同純度要求的別藻藍蛋白溶液，製成不同純度級別的別藻藍蛋白溶液製品。目前影響分離純化成本的主要因素就是使用的層析介質昂貴，而本發明分離純化過程中所用的填充介質僅需HA和Sephadex G-100兩種，有效的降低了生產成本。
一種別藻藍蛋白製備成晶體的方法，其特徵在於，將一定純度的別藻藍蛋白放在閉光封閉的環境中，加入0.05-0.2％氯化鎂和2-4％氯化鈉，調節pH值使其在晶體的成長過程中始終穩定在pH5.8～7.4的範圍內，併線性梯度地加入硫酸銨並輕微攪動，使其轉變成粗晶體，通過重結晶，再結晶，即得最後的晶體產品；晶體產品極大提高了別藻藍蛋白的穩定性，更大限度地提高產品純度和保持產品的高生物活性。
作為優選，所述的別藻藍蛋白製備成晶體的方法，其特徵在於，所述的在晶體的成長過程中始終穩定在pH6.8～7.2的範圍內。
一種別藻藍蛋白晶體，分子結構由脫輔基蛋白通過一個硫醚鍵共價連接藻藍素(PCB)，連接位點包括半胱氨酸殘基α-84(α亞基第84位胺基酸)和β-84(β亞基第84位胺基酸)，α和β亞基構成(αβ)異二聚體由異二聚體在聚合成(αβ)3三聚體的結構，特徵吸收峰為630～660nm，螢光發射峰為656～660nm，等電點為4.5～4.7。其特徵在於所述的別藻藍蛋白為晶體結構，所述的晶體結構屬於P6322空間群。
作為優選，所述的P6322空間群中三聚體沿著C軸的方向相互連接面對面的形成六聚體。
作為優選，所述的別藻藍蛋白晶體的晶胞參數為a＝b＝101.9，c＝130.6A，α＝β＝90°，γ＝120°所述的晶胞內包含不對稱單位。
作為優選，所述的晶胞內的不對稱單位中含有一個單體，所述的單體為αβ單體；所述的α和β亞基只含有一個藻藍素(PCB)，所述的藻藍素(PCB)基團有半環狀和伸展狀兩種構象組成，所述的藻藍素(PCB)通過硫醚鍵連在多肽上。
作為優選，所述的別藻藍蛋白晶體的特徵光譜吸收峰為650nm，螢光發射峰為658nm，等電點為4.6。
本發明別藻藍蛋白晶體具有能夠長期保存，所需的保藏條件要求小，螢光活性高的的特點，其製作方法在普通的實驗條件下就可以完成，簡單易行。並在科研、醫療、檢測、信電等領域得到廣泛的應用。


圖1為構成別藻藍蛋白晶體的一種藻藍素(Cys-PCB)的結構式具體實施方式
以下通過試驗例和實施例來進一步闡述本發明所述別藻藍蛋白晶體的有益效果。
試驗例1別藻藍蛋白晶體在螢光檢測方面的應用1.別藻藍蛋白晶體與親和素的交聯製成螢光探針試驗材料選本發明的別藻藍蛋白晶體，分子量約104000道爾頓；pH值7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩衝液(PBS)，其中含0.1摩爾/升氯化鈉(NaCl)；3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)，分子量312道爾頓；二硫代蘇糖醇(DTT)，分子量154道爾頓。
試驗方法1)別藻藍蛋白的衍生化取2.08毫克別藻藍蛋白晶體溶於1.0毫升磷酸鹽緩衝液(PBS)中，加入15微升3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)無水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)與別藻藍蛋白摩爾比約為10，常溫反應120分鐘，經葡聚糖(Sephadex G-50)凝膠層析柱(Φ1×17釐米)脫鹽，磷酸鹽緩衝液(磷酸鹽緩衝液)平衡和洗脫，收集別藻藍蛋白溶液峰。
2)親和素的巰基化1毫升親和素(約2毫克/毫升，溶解於含有0.1摩爾/升氯化鈉、pH7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩衝液中)，加入25微升上述3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)無水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)與親和素摩爾比約為10，常溫反應60分鐘，加入二硫蘇糖醇(DTT)使得其終濃度為25微摩爾/升，常溫反應90分鐘，同上過葡聚糖凝膠層析(SephadexG-50)，收集蛋白峰。
3)別藻藍蛋白與親和素的交聯取衍生化的別藻藍蛋白與巰基化的親和素混合，搖床低速(＜20轉/分鐘)振蕩，4℃反應過夜。
4)停止反應第3)步反應溶液中加入100微升的50毫摩爾/升碘乙酸鈉封閉殘餘巰基，常溫反應30分鐘。
5)產物的純化第4)步產物經丙烯葡聚糖(Sephacryl S-300HR)凝膠柱層析，收集第一個蛋白峰即為螢光別藻藍蛋白標記製品。
6)保存別藻藍蛋白標記製品，最後溶於磷酸鹽緩衝液(含有0.1摩爾/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩爾/升碘乙醯胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％疊氮化鈉(NaN3))，0～5℃保存。
2.別藻藍蛋白標記蛋白A試驗材料別藻藍蛋白晶體，分子量約104000道爾頓；pH值7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩衝液(PBS)，其中含0.1摩爾/升氯化鈉(NaCl)；3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)無水甲醇液；二硫蘇糖醇(DTT)pH7.4緩衝液；蛋白A；乙二胺四乙酸(DETA)；碘乙醯胺。
試驗方法1)、別藻藍蛋白的衍生化取2.08毫克別藻藍蛋白晶體溶於1.0毫升磷酸鹽緩衝液(PBS)中，加入15微升3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)無水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)與別藻藍蛋白摩爾比約為10，常溫反應60分鐘，經葡聚糖(Sephadex G-50)凝膠層析脫鹽(Φ1×17釐米)，磷酸鹽緩衝液(磷酸鹽緩衝液)平衡和洗脫，收集別藻藍蛋白溶液峰。
2)、蛋白A的巰基化0.5毫升蛋白A(約2毫克/毫升)100mmol/L磷酸鹽緩衝液(PBS，含有100mmol/L氯化鈉)pH7.4，加入上述3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)無水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(SPDP)與蛋白摩爾比約為10，常溫反應40分鐘，加入二硫蘇糖醇(DTT)使得其終濃度為25微摩爾/升，常溫反應25分鐘，同上過葡聚糖凝膠層析(Sephadex G-50)，收集蛋白峰。
3)、別藻藍蛋白與蛋白A的交聯取0.6毫克/毫升衍生化的螢光別藻藍蛋白與0.2毫克/毫升巰基化的蛋白A等量混合，搖床低速(＜20轉/分鐘)振蕩，4℃反應過夜。
別藻藍蛋白標記製品，最後溶於磷酸鹽緩衝液(含有0.1摩爾/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩爾/升碘乙醯胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％疊氮化鈉(NaN3))，0～5℃保存。
使用別藻藍蛋白晶體標記親和素和蛋白A的標記率均在60％以上，而使用別藻藍蛋白凍乾粉或沉澱標記親和素的標記率一般為40％-50％，結果表明，使用別藻藍蛋白晶體進行分子標記的效果明顯優於別藻藍蛋白凍乾粉或沉澱的標記。
試驗例2別藻藍蛋白晶體在免疫分析方面的應用。
別藻藍蛋白與抗體的交聯試驗材料選本發明的別藻藍蛋白晶體分子量約104000道爾頓；PD-10柱(葡聚糖凝膠層析柱Sephadex G-25M)，安瑪西亞Amersham公司產品，產品目錄號No.17-0851-01；NAP5柱(葡聚糖凝膠層析柱Sephadex G-25DNA grade)，安瑪西亞Amersham公司產品，產品目錄號No 17-0853-02；琥珀醯亞胺-4-(N-甲基馬來醯亞胺)環己烷-1-碳酸酯)(SMCC)，Pierce公司，產品目錄號No.22360；N-乙基馬來醯胺(NEM)，Sigma公司，產品目錄號E-1271；二甲基亞碸(DMSO)，Aldrich公司，產品目錄號No.27,685-5；pH值7.4的0.1摩爾/升磷酸鹽緩衝液(PBS)，其中含0.1摩爾/升氯化鈉(NaCl)。
試驗方法1)、別藻藍蛋白晶體的預處理將別藻藍蛋白晶體溶於1.0毫升磷酸鹽緩衝液(PBS)中，於透析緩衝液中透析除鹽。透析後的別藻藍蛋白濃度調整到5-10毫克/毫升為宜。
2)、別藻藍蛋白的衍生化將琥珀醯亞胺-4-(N-甲基馬來醯亞胺)環己烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解於無水二甲基亞碸(DMSO)配製成10毫克/毫升的母液，每毫克的別藻藍蛋白晶體添加11微升的琥珀醯亞胺-4-(N-甲基馬來醯亞胺)環己烷-1-碳酸酯)(SMCC)，鋁箔封好後於室溫旋轉反應60分鐘，使別藻藍蛋白分子上的氨基與琥珀醯胺反應生成衍生化的別藻藍蛋白。
交換緩衝液預先平衡凝膠柱，將衍生化的別藻藍蛋白過柱。
3)、抗體的處理二硫蘇糖醇(DTT)溶解於蒸餾水中，配製成1摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)母液，調整抗體的濃度，使其濃度至少為4毫克/毫升。
每毫升抗體溶液中加入20微升的二硫蘇糖醇(DTT)母液，室溫靜置反應30分鐘，將抗體的二硫鍵打開形成巰基。
交換緩衝液預先平衡凝膠柱，將反應液過柱，收集抗體部分。
4)、別藻藍蛋白和抗體的共價交聯每毫克抗體加入4毫克的琥珀醯亞胺-4-(N-甲基馬來醯亞胺)環己烷-1-碳酸酯(SMCC)衍生化的別藻藍蛋白，鋁箔封好後於室溫旋轉反應60分鐘，使別藻藍蛋白分子上的馬來醯亞胺基和抗體上的巰基實現共價交聯。
10毫克的N-乙基馬來醯胺(NEM)溶解於1.0毫升的無水二甲基亞碸(DMSO)中製成N-乙基馬來醯胺(NEM)母液(現配現用)。
每毫克抗體中加入3.4微升N-乙基馬來醯胺(NEM)母液，鋁箔封好後於室溫旋轉反應60分鐘，反應後，使抗體上的巰基封閉。
5)、交聯物的存儲將交聯物於存儲緩衝液中透析後保存於冰箱。
結果表明，當使用別藻藍蛋白的沉澱產品來實現該用途時，由於沉澱產品只是蛋白的硫酸銨沉澱物，在使用中存在一定的局限性和缺點，不能保證在實施螢光檢測及免疫分析標記前別藻藍蛋白的同一性，故對分析結果的精準性產生一定影響。用別藻藍蛋白的晶體來實現該用途，更好地解決了別藻藍蛋白在此領域的缺陷，使標記和分析更加精準。將別藻藍蛋白的晶體用於螢光檢測及免疫分析，或與其他物質如抗體、生物素、親合素、免疫蛋白等結合，製成螢光探針或螢光標記用於螢光檢測及分析。通過檢測其發出的螢光，可以用於螢光顯微檢測、螢光免疫測定、雙色或多色螢光分析、癌細胞表面抗原檢測、疾病檢測診斷、蛋白質和核酸等生物大分子的分析。
試驗例3別藻藍蛋白晶體用於疾病的治療與預防。
試驗材料選本發明的別藻藍蛋白晶體分子量約104000道爾頓。
抑制腫瘤細胞生長運用半固體瓊脂培養法和溴化3-(4，5)-二甲基-2-噻唑基-2，5二苯基四氮唑(MTT)檢測法測定了別藻藍蛋白晶體對人血癌細胞株HL-60，K-562和U-937生長的影響。體外培養條件下用不同濃度的別藻藍蛋白晶體處理這3種腫瘤細胞，結果顯示別藻藍蛋白晶體對這三種腫瘤細胞均有不同程度的抑制作用，並存在濃度劑量效應，高濃度抑制作用強。
(1)在較高濃度(100微克/毫升)時對HL-60細胞的生長有顯著的抑制作用；(2)在濃度(100微克/毫升和30微克/毫升)時對K-562細胞的生長有顯著的抑制作用；(3)在濃度(100微克/毫升)時對U-937細胞的生長有顯著的抑制作用。
抗輻射作用從別藻藍蛋白晶體抗輻射作用的機理來看，造血幹細胞的損傷和恢復在造血型放射病中起著重要的作用，降低造血幹細胞的放射敏感性或防止照射動物體內存活幹細胞的繼續減少，促使其提前進入增殖期，對照射動物造血功能的恢復將起到有益的作用。預防性的給小鼠腹腔注射別藻藍蛋白，能顯著減輕輻射對小鼠外周血細胞和骨髓細胞的損傷，可促進小鼠外周白細胞的恢復，亦能促進骨髓有核細胞、粒單系祖細胞和多能造血幹細胞的恢復和增殖。
免疫功能給注射有肝腫瘤細胞的實驗小白鼠口服別藻藍蛋白晶體後，實驗組的小白鼠比對照組的小白鼠的成活率明顯提高；進一步的研究發現，實驗組的小白鼠的淋巴細胞活性明顯高於對照組以及正常小白鼠。因此，別藻藍蛋白晶體能提高免疫系統功能，以抵抗各種疾病。
表1不同劑量組的別藻藍蛋白晶體的治療效果

人類T淋巴細胞表面具有綿羊紅細胞(SRBC)的受體，因此，綿羊紅細胞能粘於T細胞的周圍，形成玫瑰花樣的細胞團，故名E玫瑰花形試驗，形成此種玫瑰花結的T細胞稱為紅細胞玫瑰花形成細胞。人體T淋巴細胞E花環實驗是鑑定與計數人外周血T淋巴細胞的功能和數量的常用方法，特別是活性細胞玫瑰花形成細胞(EaRFC)是一組對SRBC具有高度親和力的T細胞特殊亞組，是T細胞中具有免疫活性功能的效應細胞。別藻藍蛋白晶體能夠促進植物血球凝集素(PHA)刺激淋巴細胞轉化的作用，能恢復T細胞受環磷醯胺損傷後E玫瑰花環形成能力，特別是對活性E花環(Ea)的形成能力有較好的恢復作用。因此別藻藍蛋白晶體能提高免疫系統功能，以抵抗各種疾病。
消炎作用別藻藍蛋白晶體具有強抗氧化性，是一種活性氧自由基消除劑，在一定程度上具有消炎作用。
別藻藍蛋白晶體能消除葡萄糖氧化酶引起的炎症。
別藻藍蛋白晶體具有護肝功效能抑制Fe3+-抗壞血酸誘導的肝臟微粒體脂過氧化作用。口服50-300毫克/千克劑量的別藻藍蛋白晶體提取物即能產生明顯的消炎作用。其消炎活性不依賴於皮質類固醇的釋放。且對急、慢性炎症組織都有作用。
別藻藍蛋白晶體能抑制紅細胞的裂解，其作用方式與trolox(維生素E類似物)和抗壞血酸(維生素C)的作用方式相同，但抗氧化性較trolox強16倍，較維生素C強20倍。別藻藍蛋白能通過消除水相中的過氧化物自由基來防止其誘導的紅細胞裂解。
總之，炎症代謝產物，如白細胞三烯、氧自由基等能誘導白細胞遷移進入組織或黏附於血管內皮，而中性白細胞的黏附和浸潤是炎症反應的核心。在體內及體外實驗中，別藻藍蛋白晶體通過清除活性氧物質(ROS)，例如羥自由基(OH·)、烷氧自由基(RO·)和超氧化物自由基等，在一定程度上起到緩解炎症的作用。
別藻藍蛋白晶體抗癌的機理抗癌機制別藻藍蛋白能被腫瘤細胞選擇性吸收到細胞膜中。根據對K-562細胞的作用研究發現，別藻藍蛋白能引起原癌基因(c-myc)的含量的增高，而對BCL-2的表達量沒有影響。因此可見是原癌基因(c-myc)表達量的增高引起了細胞的凋亡，或存在另一種途徑抑制了K-562細胞的生長，從而達到抗癌的效果。別藻藍蛋白可作為一種DNA穩定因子起作用，通過影響合成DNA和RNA的機制，來抑制腫瘤細胞生長，或以誘導細胞內信息分子的改變來達到抗癌效果。
以上機理表明可以將別藻藍蛋白晶體作為一種功效成分製成藥物或食物，用於癌症、腫瘤疾病的治療與預防。
結果表明別藻藍蛋白晶體不僅可以製備抗癌抗腫瘤藥物，還可將別藻藍蛋白晶體作為一種功效成分或中間體，製備成藥物或食物用於癌症、腫瘤的預防與治療；又可將別藻藍蛋白晶體作為一種功效成分或中間體，製備成藥物或食物用於抗輻射、增強免疫力或消炎。
試驗例5三種不同的別藻藍蛋白狀態下的穩定性之間的比較試驗材料別藻藍蛋白沉澱、別藻藍蛋白凍乾粉、別藻藍蛋白晶體。
試驗方法目前，別藻藍蛋白沉澱的適宜保存方法為4℃條件下，懸浮於150mM磷酸鈉，60％硫酸銨，pH7.0，1mM EDTA，1mMNaN3溶液中；別藻藍蛋白凍乾粉的適宜保存方法為4℃條件下保存。
本發明別藻藍蛋白晶體的適宜保存方法為4℃條件下，懸浮於150mM磷酸鈉，60％硫酸銨，pH7.0，1mM EDTA，1mM NaN3溶液中。
將別藻藍蛋白沉澱、凍乾粉和晶體三種形態的產品於各自的適宜保存條件下保存，不同的保存時間取出，用0.005摩爾/升的磷酸鹽緩衝液(PBS)配成濃度為100ug/L的別藻藍蛋白溶液，測定650納米波長下的吸光光度值，計算出相對吸光值。
表5三種不同的別藻藍蛋白狀態下的穩定性之間的比較 別藻藍蛋白晶體在其適宜的條件下保存兩年後，相對吸光光度值的保持不變，而別藻藍蛋白以沉澱和凍乾粉的形態保存兩年後，相對吸光光度值的降低量分別為59％和26％，這表明別藻藍蛋白以晶體的形態保存明顯優於沉澱和凍乾粉形態。分析其原因，別藻藍蛋白以晶體形態存在時，別藻藍蛋白分子按照特定的規律排列於晶胞中，色素基團包被於別藻藍蛋白分子內而受到保護，不易被氧化和微生物降解；而別藻藍蛋白以沉澱和凍乾粉的形態保存時，別藻藍蛋白的分子為無序排列，色素蛋白大量暴露於分子外圍，容易被氧化或微生物降解而導致別藻藍蛋白的變性，導致別藻藍蛋白在650納米波長下的吸光光度值的降低。
實施例11、別藻藍蛋白的製備細胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值5.8、濃度0.005mol/L的磷酸緩衝液，攪拌均勻。於冰浴(0℃)中1800W超聲破碎30分鐘，將破碎好的藻液置於預冷的高速冷凍離心機中，8000轉/分鐘(rpm)0℃下離心60分鐘，去掉沉澱，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達到25％飽和度，0℃溫度條件下靜置10小時，6000轉/分鐘(rpm)、0℃冷凍離心60分鐘，棄去沉澱。上清液中繼續加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(0℃)靜置10小時，6000轉/分鐘(rpm)0℃冷凍離心60分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH5.8)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH5.8)中充分透析。
第一次羥基磷灰石柱層析將透析後的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為5ml，然後以0.005-0.4mol/L的線性梯度磷酸鹽緩衝液(pH5.8磷酸鹽緩衝液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為0.5ml/min，洗脫總體積為600ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將別藻藍蛋白含量和純度較高的收集液合併在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，於低溫(0℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱層析上述純化收集的別藻藍蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液緩衝液(pH值5.8)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數次鹽析濃縮後的別藻藍蛋白合併，以6000轉/分鐘(rpm)0℃冷凍離心60分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH5.8)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH5.8)中充分透析。將透析後的別藻藍加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.別藻藍蛋白晶體的製備將製備A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5或A650/A280＞5.0的別藻藍蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恆低溫條件(溫度控制在0℃)的超淨工作上。溶液中加入0.2％(質量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調控裝置調節液體的pH值始終穩定在pH5.8。
將固體硫酸銨溶解於0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH5.8)中製備成100％飽和度的硫酸銨溶液，並用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛別藻藍蛋白溶液中，並輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的別藻藍蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(0℃)預冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然後用65％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體3遍。
將所得到的別藻藍蛋白晶體溶解於0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH5.8)中，按照以上結晶的方法和步驟，實施重結晶，再結晶，即得最後的晶體產品。
將晶體產品存放於65％硫酸銨飽和的磷酸鹽緩衝液溶液中，加入微量防腐劑，於低溫(0℃)條件下長期保存。
3.別藻藍蛋白結構的確定別藻藍蛋白(APC)的結構是由脫輔基蛋白通過一個硫醚鍵共價連接藻藍素(PCB)——一種開鏈四吡咯發色團組成的，連接位點通常在半胱氨酸殘基α84(α亞基第84位胺基酸)和β84(β亞基第84位胺基酸)等保守位點上。等摩爾量的α和β亞基構成(αβ)異二聚體再到(αβ)3三聚體的結構，每個亞基只含有一個藻藍素PCB。藻藍素PCB可能呈半環狀和伸展狀兩種構象，通過硫醚鍵連到多肽上。
α和β亞基分別由160和161個胺基酸組成。儘管α和β亞基的序列一致性只有38％，但它們的結構和摺疊方式幾乎一致。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亞基中完全暴露於溶劑並且不與發色基團相聯繫，而在β亞基中則與相鄰單體的發色基團作用。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第二部分則顯示了幾乎一致的構相。作為一個顯著的特徵，α和β亞基BE環中都存在基序(motif)PGGNxY。別藻藍蛋白(APC)的等電點約為4.6。
4.別藻藍蛋白晶體結構的確定利用X-射線衍射的方法對本發明所製備的別藻藍蛋白晶體結構進行分析，其結果如下別藻藍蛋白的晶體結構屬於P6322空間群，晶胞參數為a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞內的不對稱單位中含有一個(αβ)單體。在P6322空間群中三聚體沿著c軸的方向相互連接，面對面的形成六聚體，但和PC，PE不同的是，在別藻藍蛋白(APC)中β亞基提供了連接表面，發生在FG環(β120，β123-127，β173)。而且這種連接非常鬆散。
實施例21.別藻藍蛋白的製備細胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值6.8、濃度0.005mol/L的磷酸緩衝液，攪拌均勻。於冰浴(0℃)中1800W超聲破碎40分鐘，將破碎好的藻液置於預冷的高速冷凍離心機中，8000轉/分鐘(rpm)2℃下離心45分鐘，去掉沉澱，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達到25％飽和度，2℃溫度條件下靜置12小時，8000轉/分鐘(rpm)2℃冷凍離心40分鐘，棄去沉澱。上清液中繼續加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(2℃)靜置10小時，8000轉/分鐘(rpm)2℃冷凍離心45分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH6.8)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH6.8)中充分透析。
第一次羥基磷灰石柱層析將透析後的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為15ml，然後以0.005-0.05mol/L的線性梯度磷酸鹽緩衝液(pH6.8磷酸鹽緩衝液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為0.8ml/min，洗脫總體積為600ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將別藻藍蛋白含量和純度較高的收集液合併在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，於低溫(2℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱層析上述純化收集的別藻藍蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液緩衝液(pH值6.8)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數次鹽析濃縮後的別藻藍蛋白合併，以8000轉/分鐘(rpm)2℃冷凍離心50分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH6.8)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH6.8)中充分透析。將透析後的別藻藍加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.別藻藍蛋白晶體的製備將製備A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的別藻藍蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恆低溫條件(溫度控制在5℃)的超淨工作上。溶液中加入0.2％(質量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調控裝置調節液體的pH值始終穩定在pH6.8。
將固體硫酸銨溶解於0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH6.8)中製備成100％飽和度的硫酸銨溶液，並用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛別藻藍蛋白溶液中，並輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的別藻藍蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(0℃)預冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然後用60％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體4遍。
將所得到的別藻藍蛋白晶體溶解於0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH6.8)中，按照以上結晶的方法和步驟，實施重結晶，再結晶，即得最後的晶體產品。
將晶體產品存放於65％硫酸銨飽和的磷酸鹽緩衝液溶液中，加入微量防腐劑，於低溫(5℃)條件下長期保存。
3.別藻藍蛋白結構的確定別藻藍蛋白(APC)的結構是由脫輔基蛋白通過一個硫醚鍵共價連接藻藍素(PCB)——一種開鏈四吡咯發色團組成的，連接位點通常在半胱氨酸殘基α84(α亞基第84位胺基酸)和β84(β亞基第84位胺基酸)等保守位點上。等摩爾量的α和β亞基構成(αβ)異二聚體再到(αβ)3三聚體的結構，每個亞基只含有一個藻藍素PCB。藻藍素PCB可能呈半環狀和伸展狀兩種構象，通過硫醚鍵連到多肽上。
α和β亞基分別由160和161個胺基酸組成。儘管α和β亞基的序列一致性只有38％，但它們的結構和摺疊方式幾乎一致。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亞基中完全暴露於溶劑並且不與發色基團相聯繫，而在β亞基中則與相鄰單體的發色基團作用。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第二部分則顯示了幾乎一致的構相。作為一個顯著的特徵，α和β亞基BE環中都存在基序(motif)PGGNxY。APC的等電點約為4.6。
4.別藻藍蛋白晶體結構的確定利用X-射線衍射的方法對本發明所製備的別藻藍蛋白晶體結構進行分析，其結果如下別藻藍蛋白的晶體結構屬於P6322空間群，晶胞參數為a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞內的不對稱單位中含有一個(αβ)單體。在P6322空間群中三聚體沿著c軸的方向相互連接，面對面的形成六聚體，但和PC，PE不同的是，在APC中β亞基提供了連接表面，發生在FG環(β120，β123-127，β173)。而且這種連接非常鬆散。
實施例31.別藻藍蛋白的製備細胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值7.1、濃度0.005mol/L的磷酸緩衝液，攪拌均勻。於冰浴(0℃)中1800W超聲破碎40分鐘，將破碎好的藻液置於預冷的高速冷凍離心機中，8000轉/分鐘(rpm)4℃下離心45分鐘，去掉沉澱，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達到30％飽和度，5℃溫度條件下靜置16小時，7000轉/分鐘(rpm)4℃冷凍離心40分鐘，棄去沉澱。上清液中繼續加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(5℃)靜置18小時，6000轉/分鐘(rpm)4℃冷凍離心40分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH7.1)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH7.1)中充分透析。
第一次羥基磷灰石柱層析將透析後的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為20ml，然後以0.005-0.05mol/L的線性梯度磷酸鹽緩衝液(pH7.1磷酸鹽緩衝液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為1.2ml/min，洗脫總體積為800ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將別藻藍蛋白含量和純度較高的收集液合併在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，於低溫(5℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱層析上述純化收集的別藻藍蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液緩衝液(pH值7.1)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數次鹽析濃縮後的別藻藍蛋白合併，以8000轉/分鐘(rpm)4℃冷凍離心50分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH7.1)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH7.1)中充分透析。將透析後的別藻藍加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.別藻藍蛋白晶體的製備將製備A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5或A650/A280＞5.0的別藻藍蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恆低溫條件(溫度控制在10℃)的超淨工作上。溶液中加入0.2％(質量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調控裝置調節液體的pH值始終穩定在pH7.1。
將固體硫酸銨溶解於0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH7.1)中製備成100％飽和度的硫酸銨溶液，並用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛別藻藍蛋白溶液中，並輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的別藻藍蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(5℃)預冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然後用60％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體5遍。
將所得到的別藻藍蛋白晶體溶解於0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH7.1)中，按照以上結晶的方法和步驟，實施重結晶，再結晶，即得最後的晶體產品。
將晶體產品存放於65％硫酸銨飽和的磷酸鹽緩衝液溶液中，加入微量防腐劑，於低溫(5℃)條件下長期保存。
3.別藻藍蛋白結構的確定別藻藍蛋白(APC)的結構是由脫輔基蛋白通過一個硫醚鍵共價連接藻藍素(PCB)——一種開鏈四吡咯發色團組成的，連接位點通常在半胱氨酸殘基α84(α亞基第84位胺基酸)和β84(β亞基第84位胺基酸)等保守位點上。等摩爾量的α和β亞基構成(αβ)異二聚體再到(αβ)3三聚體的結構，每個亞基只含有一個藻藍素PCB。藻藍素PCB可能呈半環狀和伸展狀兩種構象，通過硫醚鍵連到多肽上。
α和β亞基分別由160和161個胺基酸組成。儘管α和β亞基的序列一致性只有38％，但它們的結構和摺疊方式幾乎一致。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亞基中完全暴露於溶劑並且不與發色基團相聯繫，而在β亞基中則與相鄰單體的發色基團作用。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第二部分則顯示了幾乎一致的構相。作為一個顯著的特徵，α和β亞基BE環中都存在基序(motif)PGGNxY。APC的等電點約為4.6。
4.別藻藍蛋白晶體結構的確定利用X-射線衍射的方法對本發明所製備的別藻藍蛋白晶體結構進行分析，其結果如下別藻藍蛋白的晶體結構屬於P6322空間群，晶胞參數為a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞內的不對稱單位中含有一個(αβ)單體。在P6322空間群中三聚體沿著c軸的方向相互連接，面對面的形成六聚體，但和PC，PE不同的是，在APC中β亞基提供了連接表面，發生在FG環(β120，β123-127，β173)。而且這種連接非常鬆散。
實施例41.別藻藍蛋白的製備細胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值7.2、濃度0.005mol/L的磷酸緩衝液，攪拌均勻。於冰浴(0℃)中1800W超聲破碎60分鐘，將破碎好的藻液置於預冷的高速冷凍離心機中，10000轉/分鐘(rpm)10℃下離心40分鐘，去掉沉澱，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達到35％飽和度，10℃溫度條件下靜置8小時，10000轉/分鐘(rpm)、7℃冷凍離心35分鐘，棄去沉澱。上清液中繼續加入固體硫酸銨至80％飽和度，低溫(10℃)靜置8小時，10000轉/分鐘(rpm)7℃冷凍離心35分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH7.2)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH7.2)中充分透析。
第一次羥基磷灰石柱層析將透析後的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為30ml，然後以0.005-0.1mol/L的線性梯度磷酸鹽緩衝液(pH7.2磷酸鹽緩衝液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為1.6ml/min，洗脫總體積為900ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將別藻藍蛋白含量和純度較高的收集液合併在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，於低溫(10℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱層析上述純化收集的別藻藍蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液緩衝液(pH值7.2)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數次鹽析濃縮後的別藻藍蛋白合併，以10000轉/分鐘(rpm)7℃冷凍離心35分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH7.2)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH7.2)中充分透析。將透析後的別藻藍加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.別藻藍蛋白晶體的製備將製備A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5或A650/A280＞5.0的別藻藍蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恆低溫條件(溫度控制在10℃)的超淨工作上。溶液中加入0.2％(質量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調控裝置調節液體的pH值始終穩定在pH7.2。
將固體硫酸銨溶解0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH7.2)中製備成100％飽和度的硫酸銨溶液，並用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛別藻藍蛋白溶液中，並輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的別藻藍蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(5℃)預冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然後用60％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體5遍。
將所得到的別藻藍蛋白晶體溶解於0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH7.2)中，按照以上結晶的方法和步驟，實施重結晶，再結晶，即得最後的晶體產品。
將晶體產品存放於65％硫酸銨飽和的磷酸鹽緩衝液溶液中，加入微量防腐劑，於低溫(5℃)條件下長期保存。
3.別藻藍蛋白結構的確定別藻藍蛋白(APC)的結構是由脫輔基蛋白通過一個硫醚鍵共價連接藻藍素(PCB)——一種開鏈四吡咯發色團組成的，連接位點通常在半胱氨酸殘基α84(α亞基第84位胺基酸)和β84(β亞基第84位胺基酸)等保守位點上。等摩爾量的α和β亞基構成(αβ)異二聚體再到(αβ)3三聚體的結構，每個亞基只含有一個藻藍素PCB。藻藍素PCB可能呈半環狀和伸展狀兩種構象，通過硫醚鍵連到多肽上。
α和β亞基分別由160和161個胺基酸組成。儘管α和β亞基的序列一致性只有38％，但它們的結構和摺疊方式幾乎一致。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亞基中完全暴露於溶劑並且不與發色基團相聯繫，而在β亞基中則與相鄰單體的發色基團作用。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第二部分則顯示了幾乎一致的構相。作為一個顯著的特徵，α和β亞基BE環中都存在基序(motif)PGGNxY。APC的等電點約為4.6。
4.別藻藍蛋白晶體結構的確定利用X-射線衍射的方法對本發明所製備的別藻藍蛋白晶體結構進行分析，其結果如下別藻藍蛋白的晶體結構屬於P6322空間群，晶胞參數為a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞內的不對稱單位中含有一個(αβ)單體。在P6322空間群中三聚體沿著c軸的方向相互連接，面對面的形成六聚體，但和PC，PE不同的是，在APC中β亞基提供了連接表面，發生在FG環(β120，β123-127，β173)。而且這種連接非常鬆散。
實施例51.別藻藍蛋白的製備細胞破碎稱取鈍頂螺旋藻置入燒杯中，用蒸餾水清洗兩次，加入pH值7.4、濃度0.005mol/L的磷酸緩衝液，攪拌均勻。於冰浴(0℃)中1800W超聲破碎50分鐘，將破碎好的藻液置於預冷的高速冷凍離心機中，7000轉/分鐘(rpm)10℃下離心50分鐘，去掉沉澱，收集上清液；鹽析在上清液中加入固體硫酸銨使之達到35％飽和度，4℃溫度條件下靜置8小時，7000轉/分鐘(rpm)10℃冷凍離心50分鐘，4℃溫度條件下靜置12小時，7000轉/分鐘(rpm)10℃冷凍離心50分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH7.4)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中充分透析。
第一次羥基磷灰石柱層析將透析後的粗品液加到羥基磷灰石層析柱上，加樣量為30ml，然後以0.005-0.3mol/L的線性梯度磷酸鹽緩衝液(pH7.4磷酸鹽緩衝液，含0.1mol/L氯化鈉)洗脫，流速為2.5ml/min，洗脫總體積為600ml。用自動部分收集器收集洗脫液。將別藻藍蛋白含量和純度較高的收集液合併在一起，分別加入固體硫酸銨至80％飽和度，於低溫(5℃)條件下保存。
葡聚糖(Sephadex G-100)柱層析上述純化收集的別藻藍蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-100)分子篩柱上。用0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液緩衝液(pH值7.4)洗脫，控制流速在5ml/min，收集A650/A280＞4.0的蛋白溶液部分。
第二次羥基磷灰石柱層析將數次鹽析濃縮後的別藻藍蛋白合併，以7000轉/分鐘(rpm)10℃冷凍離心50分鐘，棄去上清液，沉澱用少量磷酸鹽緩衝液(pH7.4)溶解，在0.005mol/L磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中充分透析。將透析後的別藻藍加到羥基磷灰石層析柱上，洗脫方法與第一次羥基磷灰石柱層析時相同，洗脫體積為1000ml，收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5和A650/A280＞5.0的部分。
2.別藻藍蛋白晶體的製備將製備A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5或A650/A280＞5.0的別藻藍蛋白溶液收集在燒杯中，放入密閉、閉光、恆低溫條件(溫度控制在5℃)的超淨工作上。溶液中加入0.2％(質量/體積，M/V)的氯化鎂和4％(質量/體積，M/V)氯化鈉。
將pH傳感器浸入液面下，通過pH自動調控裝置調節液體的pH值始終穩定在pH7.4。
將固體硫酸銨溶解於0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中製備成100％飽和度的硫酸銨溶液，並用0.2μm的濾膜過濾除菌。
將飽和硫酸銨溶液緩慢滴加到所盛別藻藍蛋白溶液中，並輕微攪動，使溶液混合均勻，流速控制在1ml/6min，直到溶液中的別藻藍蛋白以晶體的形式基本析出完全為止。
將晶體混合溶液放入事先低溫(5℃)預冷的真空抽濾器中抽濾，抽除濾液，然後用60％飽和度的硫酸銨溶液洗滌晶體3遍。
將所得到的別藻藍蛋白晶體溶解於0.005mol/L的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中，按照以上結晶的方法和步驟，實施重結晶，再結晶，即得最後的晶體產品。
將晶體產品存放於65％硫酸銨飽和的磷酸鹽緩衝液溶液中，加入微量防腐劑，於低溫(5℃)條件下長期保存。
3.別藻藍蛋白結構的確定別藻藍蛋白(APC)的結構是由脫輔基蛋白通過一個硫醚鍵共價連接藻藍素(PCB)——一種開鏈四吡咯發色團組成的，連接位點通常在半胱氨酸殘基α84(α亞基第84位胺基酸)和β84(β亞基第84位胺基酸)等保守位點上。等摩爾量的α和β亞基構成(αβ)異二聚體再到(αβ)3三聚體的結構，每個亞基只含有一個藻藍素PCB。藻藍素PCB可能呈半環狀和伸展狀兩種構象，通過硫醚鍵連到多肽上。
α和β亞基分別由160和161個胺基酸組成。儘管α和β亞基的序列一致性只有38％，但它們的結構和摺疊方式幾乎一致。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第一部分在α亞基中完全暴露於溶劑並且不與發色基團相聯繫，而在β亞基中則與相鄰單體的發色基團作用。BE環(連接B螺旋和E螺旋)的第二部分則顯示了幾乎一致的構相。作為一個顯著的特徵，α和β亞基BE環中都存在基序(motif)PGGNxY。APC的等電點約為4.6。
4.別藻藍蛋白晶體結構的確定利用X-射線衍射的方法對本發明所製備的別藻藍蛋白晶體結構進行分析，其結果如下別藻藍蛋白的晶體結構屬於P6322空間群，晶胞參數為a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°，晶胞內的不對稱單位中含有一個(αβ)單體。在P6322空間群中三聚體沿著c軸的方向相互連接，面對面的形成六聚體，但和PC，PE不同的是，在APC中β亞基提供了連接表面，發生在FG環(β120，β123-127，β173)。而且這種連接非常鬆散。
權利要求
1.一種別藻藍蛋白溶液的製備方法，其特徵在於，將藻細胞破碎後，通過過濾和0-4℃下，6000-10000轉/分鐘(rpm)高速冷凍離心分離，去除沉澱，收集上清，分級鹽析後收集別藻藍蛋白沉澱，沉澱溶解於磷酸鹽緩衝液後依次經過羥基磷灰石、葡聚糖凝膠Sephadex G-100、羥基磷灰石柱層析，羥基磷灰石柱層析時使用濃度範圍為0.005-0.4摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩衝液洗脫，控制流速在0.5-2.5毫升/分鐘，最後收集A650/A280＞4.0、A650/A280＞4.5、A650/A280＞5.0一種或多種不同純度要求的別藻藍蛋白溶液，製成不同純度級別的別藻藍蛋白溶液。
2.根據權利要求1所述的別藻藍蛋白溶液的製備方法，其特徵在於，所述別藻藍蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用濃度範圍為0.005-0.05摩爾/升的線性梯度磷酸鹽緩衝液洗脫。
3.根據權利要求1所述的別藻藍蛋白溶液的製備方法，，其特徵在於，所述別藻藍蛋白溶液在羥基磷灰石柱層析過程中使用線性梯度磷酸鹽緩衝液洗脫，洗脫流速控制在0.8-1.6毫升/分鐘。
4.一種別藻藍蛋白製備成晶體的方法，其特徵在於，將一定純度的別藻藍蛋白放在閉光封閉的環境中，加入0.05-0.2％氯化鎂和2-4％氯化鈉，調節pH值使其在晶體的成長過程中始終穩定在pH5.8～7.4的範圍內，併線性梯度地加入硫酸氨並輕微攪動，使其轉變成粗晶體，通過重結晶，再結晶，即得最後的晶體產品。
5.根據權利要求4所述的一種別藻藍蛋白製備成晶體的方法，其特徵在於，所述的在晶體的成長過程中始終穩定在pH6.8～7.2的範圍內。
6.一種別藻藍蛋白晶體，分子結構由脫輔基蛋白通過一個硫醚鍵共價連接藻藍素(PCB)，連接位點包括半胱氨酸殘基α-84(α亞基第84位胺基酸)和β-84(β亞基第84位胺基酸)，α和β亞基構成(αβ)異二聚體由異二聚體在聚合成(αβ)3三聚體的結構，特徵吸收峰為630～660nm，螢光發射峰為656～660nm，等電點為4.5～4.7。其特徵在於所述的別藻藍蛋白為晶體結構，所述的晶體結構屬於P6322空間群。
7.根據權利要求6所述的一種別藻藍蛋白晶體，其特徵在於，所述的P6322空間群中三聚體沿著C軸的方向相互連接面對面的形成六聚體。
8.根據權利要求6或7所述的一種別藻藍蛋白晶體，其特徵在於，所述的別藻藍蛋白晶體的晶胞參數為a＝b＝101.9，c＝130.6，α＝β＝90°，γ＝120°所述的晶胞內包含不對稱單位。
9.根據權利要求8所述的一種別藻藍蛋白晶體，其特徵在於，所述的晶胞內的不對稱單位中含有一個單體，所述的單體為αβ單體，所述的α和β亞基只含有一個藻藍素(PCB)，所述的藻藍素(PCB)基本上有半環狀和伸展狀兩種構象組成，所述的藻藍素(PCB)通過硫醚鍵連在多肽上。
10.根據權利要求6或7所述的一種別藻藍蛋白晶體，其特徵在於，所述的別藻藍蛋白晶體的特徵光譜吸收峰為650nm，螢光發射峰為658nm，等電點為4.6。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白、晶體製造工藝及製品，尤其涉及的是在一般條件下從藻類中提取的能發射強烈螢光的別藻藍蛋白並將其轉化為晶體形態，本發明別藻藍蛋白晶體具有能夠長期保存，所需的保藏條件要求小，螢光活性高的特點，其製作方法在普通的實驗條件下就可以完成，簡單易行；並在科研、醫療、檢測、信電等領域得到廣泛的應用。
文檔編號C07K1/36GK1786025SQ200410089528
公開日2006年6月14日 申請日期2004年12月10日 優先權日2004年12月10日
發明者駱建華, 劉維國, 劉俊 申請人:劉維國