Hcv感染患者中的冷球蛋白血症性血管炎和b細胞惡性腫瘤的預測標誌物的製作方法
2023-05-10 11:18:01
專利名稱：Hcv感染患者中的冷球蛋白血症性血管炎和b細胞惡性腫瘤的預測標誌物的製作方法
技術領域：
本發明總體上涉及用於與C型肝炎病毒感染相關的疾病的早期診斷和治療的方法。
背景技術：
C型肝炎病毒(HCV)感染的一種不常見的表現是與II型冷球蛋白血症(冷球蛋白血症性血管炎)有關的系統性血管炎，一種增殖性B細胞紊亂，其中5% -10%的患者轉化為B細胞惡性腫瘤。產生冷球蛋白血症性血管炎所需要的HCV感染的持續時間尚不明確，但似乎為10年或更長的時間。由於大多數感染者在冷球蛋白血症性血管炎症狀發作之前的這段延長的時間期間不表現出任何症狀，很少做出冷球蛋白血症性血管炎或相關的B細胞惡性腫瘤的早期診斷。由於C型肝炎患者在其有症狀前不太可能進行治療，本領域中對於發現有助於HCV感染患者中的冷球蛋白血症性血管炎和相關的B細胞惡性腫瘤的早期診斷的預後標誌物存在著需要。
發明內容
本發明包括通過採用檢測一種特異抗體上的交叉獨特型表位(cross-idiotypicepitope)來檢測在產生疾病的臨床症狀之前產生該抗體的細胞的用於與一種特異性抗體相關的疾病的早期診斷和治療的方法。具體而言，本發明提供了一種在這樣的患者產生該感染的這些併發症之前利用C型肝炎病毒(HCV)感染患者的B細胞克隆擴增(BCE)分析的用於與II型冷球蛋白血症相關的冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤的早期診斷的方法。在此還描述的是採用針對檢測到的交叉獨特型抗原的抗體進行治療的方法。本發明是基於以下令人驚奇的發現即，在無症狀HCV感染患者中檢測到的WAB細胞是產生冷球蛋白血症性血管炎和相關的B細胞惡性腫瘤的一個標誌物。在此描述的是用於鑑定具有產生與HCV相關的冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤的風險的受試者的方法。首先，提供了一種來自感染有HCV的受試者的樣品。適合的樣品是一種包括全血的生物流體。如果在樣品中檢測到WA交叉獨特型陽性(Xid+) B細胞，則該受試者被鑑定為具有產生與HCV相關的冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤的風險的人。一方面，該受試者是被早期鑑定的。優選地，該早期鑑定的受試者是在初次HCV感染之後、但在表現與冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤相關的症狀之前被鑑定的。一方面，這些WA Xid+B細胞是通過鑑定來自一個克隆擴增的B細胞群的一種免疫球蛋白核酸序列而檢測的，其中該免疫球蛋白核酸序列與WA Xid相關。該與WA Xid相關的免疫球蛋白核酸序列包含IgH V1-69、或IgHV V3-7或相關的種系基因、VK325或VK328、JH4或JH3、Jkl、以及一個D區共有序列，D區共有序列包括SEQ ID NO 1(共有序列I)或SEQ ID N0:2(共有序列 2)。可替代地，這些WA Xid+B細胞是用一種分離的抗WA Xid的抗體檢測的。任選地，該分離的抗WA Xid的抗體附著到一種標記上。一方面，該標記是一種異硫氰酸螢光素(FITC)標記或一種藻紅蛋白(PE)標記。這些WA Xid+B細胞是通過免疫染色或流式細胞分析進行檢測的。一方面，該方法進一步包括用一種抗CDllc抗體來檢測該樣品中的CDllC+的細胞。還提供了用於鑑定具有產生與HCV感染相關的冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤的風險的受試者的方法。首先，提供了來自一位HCV感染患者的克隆擴增的B細胞的一種核酸樣品來檢測與WA Xid相關的免疫球蛋白核酸序列，其中所述免疫球蛋白核酸序列包括IgH V1-69或IgHV3-7或有關的種系基因、VK325或VK328、JH4或JH3、以及Jkl。隨後，檢測該樣品中的包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的一個序列。如果SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2存在於含有與WA Xid相關的IgH和VK序列的源於HCV感染患者的核酸中， 則預測HCV感染相關性冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤的產生。一方面，該患者缺乏冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤的臨床症狀。本發明還提供了早期治療在受試者中的與HCV相關的冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤的方法。首先，獲得一種來自感染有HCV的受試者的樣品。適合的樣品是一種包括全血的生物流體。如果該樣品含有WA Xid+B細胞，則將一種抗WA的抗體給予該受試者，從而治療受試者中的與HCV相關的冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤。優選地，該早期治療是在初次HCV感染之後、但在表現出與冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤相關的症狀之前進行的。本發明還提供了一種用於早期檢測和治療具有產生B細胞惡性腫瘤(由WA B細胞引起的那些除外)風險的一位受試者的方法。首先，提供了一種來自感染有HCV的受試者的樣品。任選地，該特異性非WAXid+B細胞是用一種分離的抗非WA Xid抗體檢測的。一方面，該受試者是早期被鑑定的。優選地，該早期被鑑定的受試者是在初次HCV感染之後、但在表現出與冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤相關的症狀之前被鑑定的。本發明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包含一套第一引物和第二引物，以及用於基於與WA Xid相關的免疫球蛋白核酸序列的檢測來預測與HCV感染相關的冷球蛋白血症血管炎和B細胞惡性腫瘤的說明書，這些免疫球蛋白核酸序列包括IgH V1-69或VIgH V3-7或相關的種系基因、VK325 或 VK328、JH4 或 JH3、Jkl、以及 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2。該套第一和第二引物包括位於互補決定區3(CDR3)序列的兩側的一種第一引物和一種第二引物、位於VH-D-JH序列的兩側的一種第一引物和一種第二引物、以及位於Ig編碼轉錄本中的VK-JK序列的兩側的一種第一引物和一種第二引物。根據本發明的以下優選實施方案的描述並且根據權利要求書，本發明的其他特徵和優點將是明顯的。除非另有規定，在此使用的所有科技術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。雖然與在此描述的那些相似或等同的方法和材料可以被用於本發明的實踐或試驗中，以下描述了適合的方法和材料。將所有出版物、專利申請、專利、Genbank/NCBI登錄號、以及其他在此提及的參考文獻以其全部內容通過引用進行結合。在發生衝突的情況下，將以本說明書(包括定義)為準。另外，材料、方法和實例僅僅是說明性的而不旨在進行限制。根據以下詳細描述和權利要求書，本發明的其他特徵和優點將是明顯的。
圖I是一個B細胞克隆擴增分析凝膠的化學發光圖(chemiIumigraph)。患者的核糖核酸(RNA)被擴增。患者27、45、71、72、80、84和88被考慮為陽性(白色箭頭表示BCE)並且患者17、50、83、85、86和87被考慮為陰性。通過凝膠圖像的光密度掃描證實了這些分類。圖2顯示了患者127的另外研究結果。圖2A是外周血瑞氏染色的顯微照片，顯示 了絨毛淋巴細胞。圖2B是一個流式細胞術直方圖，顯示了一個⑶llc+、WA+B細胞群。圖2C和2D是描繪了用異硫氰酸螢光素(FITC)標記的抗WA Xid(C)和藻紅蛋白(PE)標記的抗⑶I Ic (D)的⑶IIC分離的細胞的雙重染色的顯微照片。
具體實施例方式在美國，感染有C型肝炎病毒(HCV)的患者大約有四百萬，全世界的感染患者超過I. 7億。C型肝炎病毒是黃病毒科中的一種小的(大小為50-65nm)、具包膜的正義單鏈核糖核酸(RNA)病毒。C型肝炎病毒顆粒由遺傳物質核心(RNA)組成，其被一個二十面體的保護性蛋白質外殼包圍，並且進一步包裝在細胞來源的脂質(脂肪)包膜中。兩種病毒包膜糖蛋白，El和E2，鑲嵌在脂質包膜中。C型肝炎病毒的主要基因型有6個，用數字表示，例如，基因型1，基因型2，等等。HCV通過血液到血液接觸的方式傳播，例如，注射藥物使用(共用針頭)、受感染的血液產品和性傳播，並且在人體中表現為C型肝炎，一種影響肝臟的感染性疾病。大多數人在初次感染之後具有很少的症狀(如果有的話)，然而病毒在大約85%的那些感染者的肝臟中持續存在。慢性感染一旦建立，可能進展成肝臟瘢痕形成(纖維化)和晚期瘢痕形成(肝硬化)，後者通常在許多年之後才明顯。在一些情況下，肝硬化患者發展成肝衰竭或其他的肝硬化併發症，包括肝癌。發展成肝硬化或肝癌的患者可能需要肝移植；然而，C型肝炎病毒在移植之後一般會再出現。急性C型肝炎是指在HCV感染之後的第一個6個月。60%到70%的HCV感染者在急性期期間是無症狀的。少數人經歷急性期症狀，症狀通常是輕微的和非特異性的，並且很少導致C型肝炎的特異性診斷。急性C型肝炎感染的症狀包括食慾減退、疲勞、腹痛、黃疸、瘙癢和流感樣症狀。在感染之後的I至3周之內，通過聚合酶鏈式反應(PCR)在血液中通常可檢測到C型肝炎病毒，並且在感染之後的3至15周之內，通常可以檢測到針對該病毒的抗體。自發病毒清除率是高度可變的，並且 10%-60% (Caruntu FA和Benea L, 2006J GastrointestinLiver Dis, 15(3) =249-256)的感染有HCV的個體在急性期期間從其體內清除該病毒，這表現為肝臟酶的正常化(丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST))、以及血漿HCV-RNA清除(被稱為自發病毒清除)。然而，持續感染是常見的，並且大多數患者發展為慢性C型肝炎，即，持續6個月以上的感染(Villano等人，1999!fepat0l0gy (肝臟病學)，29(3)908-914)。慢性C型肝炎經常是無症狀的(沒有症狀)並且大多被偶然發現。慢性C型肝炎的自然病程從一個個體到另一個個體的變化相當大。雖然在肝臟活組織檢查時幾乎所有HCV感染者具有炎症跡象，肝臟瘢痕形成(纖維化)的進展速度在個體之間變化顯著。已經報告的影響HCV疾病進展速度的因素包括年齡(與疾病進展速度的增加相關)、性別(男性比女性具有更快的疾病進展)、飲酒(與疾病進展速度的增加相關)、HIV共感染(與疾病進展速度的顯著增加相關)、以及脂肪肝(肝細胞中的脂肪的存在與疾病進展速度的增加相關)。特異性地暗示肝臟疾病的症狀典型地是缺乏的，直至已經出現大量的肝臟瘢痕形成為止。然而，C型肝炎是一種全身性疾病，並且患者可能經歷寬範圍的臨床表現範圍從缺乏症狀到晚期肝病產生之前的更多的症狀性疾病。與慢性C型肝炎相關的全身體徵和症狀包括疲勞、流感樣症狀、關節痛、瘙癢、睡眠障礙、食慾改變、噁心和抑鬱。 一旦慢性C型肝炎進展到肝硬化，可能出現通常由肝功能減弱或肝循環壓力增加(一種被稱為門靜脈高壓的病症)引起的體徵和症狀。肝硬化的可能體徵和症狀包括腹水(在腹部中的液體累積)、青腫和出血傾向、靜脈曲張(尤其是在胃和食管中的擴大的靜脈)、黃疸以及被稱為肝性腦病的認知損害症候群，肝性腦病是由於通常經由健康肝臟清除的氨和其他物質的積累所致。持續HCV感染可用藥物進行治療，例如聚乙二醇幹擾素和利巴制林。由於大多數感染者在該疾病的急性期期間沒有經歷任何症狀，因此很少在急性期期間做出「C型肝炎」的診斷。確實經歷了急性期症狀的那些感染者很少病到尋求醫療救助的程度。慢性期C型肝炎的診斷同樣是挑戰性的，這是由於直到產生晚期肝病時為止缺乏症狀特異性，症狀特異性可能在初次感染之後幾十年後才會出現。雖然目前HCV疫苗在開發中，尚不存在針對HCV的疫苗。C型肝炎的診斷始於用來檢測針對HCV的抗體的血清學血液試驗。在暴露之後15個星期之內，在大約80%的患者體內能檢測到抗HCV抗體；在暴露之後5個月之內，在>90%的患者體內能檢測到抗HCV抗體；在暴露之後6個月之內，在> 97%的患者體內能檢測到HCV抗體。總的來說，對於暴露於C型肝炎病毒感染而言，HCV抗體試驗具有強的陽性預期值，但是可能遺漏那些尚未產生抗體的患者(血清轉化)，或具有不足以進行可靠檢測的抗體水平的患者。HCV感染的一種不常見的表現是 與II型冷球蛋白血症相關的系統性血管炎(冷球蛋白血症性血管炎)。冷球蛋白血症是一種由血中的被稱為冷球蛋白的異常蛋白引起的血液病症，該蛋白在血液變冷時沉澱或凝集成塊，在復溫時溶解。這些蛋白質可能沉積在小的和中等大小的血管中，可能導致流向關節、肌肉和器官血液受限。冷球蛋白血症的病因不完全清楚，但被認為是一種自身免疫疾病(由產生抗體的機體的免疫系統引起，這些抗體形成沉積在器官中並且引起炎症的複合物)。大多數冷球蛋白血症，先前因為病因不清楚而被命名為原發性混合型冷球蛋白血症，目前已知是由HCV感染引起的。有三種類型的由免疫球蛋白組成的冷球蛋白血症(I型、II型和III型)。I型由單克隆免疫球蛋白組成。II型和III型被稱為「混合性冷球蛋白」，因為它們由多克隆免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)組成。在II型中，該IgM是單克隆的，而在III型中，該IgM是多克隆的。在這兩種類型中，該IgM通常有類風溼因子(RF)活性。類風溼因子是一種在罹患類風溼性關節炎(一種慢性自身免疫疾病，其特徵為關節的炎症)的人的血液中發現的抗體。最常見的與冷球蛋白血症相關的症狀和紊亂包括血管炎、腎的(腎臟)疾病、關節痛和關節炎、瘙癢、疲勞、疼痛、淋巴結腫大、周圍神經病變、胃痛和/或出血障礙。治療取決於冷球蛋白的類型、基礎疾病以及症狀的嚴重性。與自身免疫疾病或原發性冷球蛋白血症相關的更廣泛的血管炎可能對潑尼松、環磷醯胺或兩者有反應。雖然與C型肝炎相關的冷球蛋白血症的最有效的治療尚未確定，短暫使用潑尼松繼之使用幹擾素α 6個月已經產生了臨床及肝功能試驗改善，但是當結束幹擾素α治療時，經常出現肝病和血管炎的復發。II型冷球蛋白血症由多克隆免疫球蛋白G(IgG)和單克隆IgM類風溼因子(mRF)組成，它們結合到一種抗體的Fe部分上，從而形成促成該疾病進展的免疫複合物。與II型冷球蛋白血症相關的系統性血管炎(冷球蛋白血症性血管炎)是一種在5%-10%的患者中轉化成B細胞惡性腫瘤的增殖性B細胞疾病。80%的mRF (Casato M等人，1997Blood (血液)，90 =3865-3873)是獨特的，因為它們是由種系基因編碼的(Kunkel HG等人，19 73J ExpMed, 37 =331-42)，並且具有一個稱之為「WA」的、限制於HCV感染患者的抗體結合位點交叉獨特型(Xid) (Agnello V 和 Barnes 幾，1986J Exp Med，164 :1809-14)。免疫球蛋白可變區含有被稱作「獨特型」的、能被血清學技術識別的抗原決定簇。(Mackworth-Young等人，1987J Clin Invest, 79 =572-581)該WA交叉獨特型(Xid)——在人單克隆類風溼因子(mRF)中的主要交叉獨特型，是一種構象抗原決定簇，包括位於在抗原結合位點中的H鏈和L 鏈(Kunkel HG 等人，1973J Exp Med, 137 :331 ；Agnello V 和 JL Barnes, 1986J Exp Med,164 1809)。帶有WA交叉獨特型(Xid)的單克隆類風溼因子是造成大多數在HCV感染患者中的冷球蛋白血症性血管炎的原因。HCV濃集在II型冷球蛋白中(Agnello V等人，1992NEngl J Med, 327 =1490-1495)，並且由該病毒驅動WAmRF的產生，正如抗病毒療法誘導冷球蛋白血症和產生WA mRF的WA B細胞的衰退，連同病毒血症的衰退。(Mazzaro C等人，1996Cancer (癌症)，77 :2604-13 ；Casato M等人，2002Blood (血液)，99 :2259-61 ；Hermine等人，2002N Engl JMed，347 :89-94)在歐洲南部和美國，冷球蛋白血症性血管炎的流行率估計為2% -5%並且分別小於 HCV 感染患者的 I % (Casato M 和 Agnello V, 2002Mixedcryoglobulinemiasyndrome secondary to hepatitis C virus infection (混合性冷球蛋白血症次於C型肝炎病毒感染)· In :N0RD Guide to Rare Disorders (罕見疾病NORD指南)，第3版。National Organization for Rare Disorders (美國罕見疾病組織)，編者；LippincottWilliams&Wilkins (利平科特威廉斯和威爾金斯)Philadelphia (費城)，PA :5)。II型冷球蛋白血症患者比總HCV感染群體有大得多的產生B細胞惡性腫瘤的風險。百分之五至百分之十的具有冷球蛋白血症性血管炎的患者產生B細胞惡性腫瘤(Invernizzi F等人，1983Acta haematol (血液病學學報)，70 :73-82)，而僅百分之O. 2至百分之O. 8的總HCV感染群體(Ohsawa M 等人，1999J Cancer, 80 :237-239 ；Giordano TP 等人，2007JAMA，297 :2011-17)產生B細胞惡性腫瘤。而且，大約50%的B細胞非霍奇金淋巴瘤似乎起源於WAB 細胞(Knight G 和 Agnello V, 2001Blood, 97 :3319-21 ；Knight GB. Gao L, Grangnani L,Elfahal M，De rosa FG, Gordon FD, Agnello V. Detectection of WA B cells in HCVinfection A potential prognostic marker forcryoglobulinemic vasculitits and Bcell malignancies (在HCV感染中的WA B細胞的檢測一種針對冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤的潛在的預測標誌物).Arth Rheum(關節炎風溼病學)2010 ；62 :2152)。百分之八十的HCV感染患者不會產生有症狀的疾病。因此，這些患者中僅有一小部分用抗病毒療法進行了治療。產生冷球蛋白血症性血管炎所需要的HCV感染的持續時間尚不明確，但似乎為至少10年(Monti G等人，1995QJM，88 :115-16)。因此，除非發現預測標誌物，這些患者在變得有症狀之前是不太可能被治療的。如下面詳細描述的，WAB細胞是II型冷球蛋白血症和/或B細胞淋巴瘤的一種標誌物，並且允許用於早期診斷。除了預防冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤的發病率和死亡率的增加之外，在症狀發作之前對這些患者進行早期檢測和治療可能是有益的，因為一旦血管炎發作患者會對治療產生更強的抵抗(Agnello V, 2000J Rheumatol (風溼病學雜誌)，27 :2065-7)。如下面詳細描述的，無症狀HCV感染患者中的WA B細胞是通過B細胞克隆擴 增(BCE)的分子分析進行檢測的。B細胞增殖的早期檢測是通過逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)來檢測血液中組成正常B細胞庫的Ig基因重排而確定的。以這種方式，檢測了擴增的B細胞克隆，例如，II型冷球蛋白血症或B細胞惡性腫瘤中的過度表達的B細胞克隆。WA B細胞克隆擴增(BCE)是利用已經建立的編碼WA mRF的Ig基因的廣泛標準通過BCE的序列分析而被鑑定的(Knight GB 等人，1993J Exp Med, 178 :1903-11)。實例I.在無症狀HCV感染患者中的WA B細胞是產牛冷球蛋白血症件血管炎和相關的B細胞惡件腫瘤的標誌物。簡要地說，對無症狀HCV感染患者、HCV陰性患者以及具有WA mRF陰性和陽性的冷球蛋白血症性血管炎的對照患者進行了檢查。分離BCE，進行測序，並且鑑定WA BCE。如下面詳細描述的，在具有冷球蛋白血症性血管炎的所有陽性對照患者中檢測到BCE;然而，僅僅HCV感染患者具有WA BCE。33例對照HCV陰性患者都沒有BCE。在55位具有無症狀HCV感染的患者中的4位(7.4%)體內檢測到WA BCE ;14位具有III型冷球蛋白血症以及37位具有血清RF的HCV感染患者分別是均沒有WABCE、5位有WABCE。I位具有WA BCE的患者患有無症狀脾淋巴瘤(具有絨毛淋巴細胞)，這些淋巴細胞是WA B細胞。對無症狀HCV感染者、HCV陰性患者以及具有對WA mRF陰性和陽性的冷球蛋白血症性血管炎的對照患者進行了檢查。在經過6個月的時期，從LaheyClinic(伯靈頓，MA)的Gastroenterology Clinic (胃腸病學診所)的已同意該研究的、具有和不具有HCV感染的連續的無症狀患者獲得用於B細胞克隆分析的血標本。HCV感染患者未曾接受任何抗病毒治療或化療。從Lahey Clinic的不同部門募集患有冷球蛋白血症性血管炎或III型冷球蛋白血症的患者。在一個兩年的隨訪研究中，從在Veterans Affairs Medical Center (退伍軍人服務部醫療中心)的!fepatitis Clinic (肝炎診所)(VAMC ;貝德福德，MA)獲得具有RF陽性的、但是沒有冷球蛋白血症的無症狀HCV感染患者的血樣。回顧醫療記錄以決定患者的人口學特徵、冷球蛋白血症性血管炎或其他肝外病疾病表現的存在、以及肝硬化的存在。為了診斷冷球蛋白血症性血管炎，需要存在以下各項之一可觸知的紫癜、周圍神經病變、腎臟病、或活組織檢查證實的中等大小血管的血管炎。腎臟病標準包括存在以下各項之一蛋白尿> 500mg/die、腎病症候群、腎小球腎炎、急性或慢性腎衰竭、血清肌酸酐>1.5mg/dl。排除其他疾病(例如，糖尿病或系統性紅斑狼瘡)引起的腎臟病。周圍神經病變由神經病學家進行診斷，具有或不具有經過電生理參數的證實。排除繼發於其他疾病(如糖尿病或酒精中毒)的周圍神經病變。如前所述，進行了 HCV抗體、HCV RNA檢測和定量、以及冷球蛋白分離、定量和分型(De Rosa FG和Agnello V，2009J Rheumatol (風溼病學雜誌)，36 1953)。反覆研究病因不明的具有HCV陰性冷球蛋白血症性血管炎的患者的血清和冷球蛋白HCV抗體以及HCV RNA檢測，以證實沒有HCV感染。在臨床實驗室中進行谷丙轉氨酶(ALT，正常範圍7-40IU/ml)和類風溼因子(RF，正常範圍< 20IU/ml)研究。通過常規的Ficoll密度梯度離心從肝素化血液中分離外周血單核細胞(PBMC)。對來自127號患者的樣品進行另外的分析。在臨床實驗室中進行血液學試驗和淋巴細胞的免疫分型。⑶Ilc+的淋巴細胞(絨毛淋巴細胞的表型標誌物(LiuX等人，2003JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 23 :236_8)按如下方法進行分離:用小鼠抗CDllc抗體(Beckman Coulter ;富勒頓，CA)在4°C孵育PBMC持續30分鐘，洗滌，用免疫磁珠(Dynabeads)山羊抗小鼠Ig磁珠(Invitrogen公司；卡爾斯巴德,CA)在4 孵育30分鐘。 通過磁鐵捕獲CDllc+的細胞，洗滌，在37°C孵育過夜以分離附著的磁珠。在孵育之後，用磁鐵將磁鐵將磁珠從細胞上移去。分離的細胞用異硫氰酸螢光素(FITC)標記的抗WAmRF和藻紅蛋白(PE)標記的抗CDllc進行染色，並且通過螢光顯微鏡和流式細胞儀進行檢查。BCE的檢測和分析在B細胞發育過程中，免疫球蛋白重鏈基因座重排，使組成重鏈可變部分的第三互補決定區(⑶R3)的VH、D和J區並置。在重排過程中，在Vh-D(N)和D-J(P)結點發生核苷酸添加和缺失。使用位於這個區域兩側的引物進行RT-PCR，評定mRNA中的⑶R3區重鏈基因的多樣性。將得到的產物解析在測序膠上，其在正常庫中代表片段長度的正常分布(大約CDR3的平均長度以3個核苷酸、或I個密碼子不同)。在特定B細胞克隆的單克隆擴增的情況下，正如出現在II型冷球蛋白血症中一樣，在測序膠上的一個條帶可能過度表達。從測序膠上切下觀察到的克隆擴增的條帶並且經受直接循環測序。序列與GenBank中已知的Ig序列進行比較。雖然可以使用Vh3(IGHV3-7)基因，WA mRF主要是IGKV3-20 (Kv325)輕鏈基因和包括16取1-69的VhI基因以及相關的種系基因的產物(Knight GB等人，1993J Exp Med, 178 1903-11) d區具有兩種類型的序列特徵。共有序列I (SEQ ID NO : I)，以穀氨酸開始、以脯氨酸結尾的、與IGHV1-69基因和通常地Jh4相關的9_11個胺基酸的區域，似乎來自IGHD4-17基因 l(Knight GB 等人，1993J Exp Med, 178 :1903-11)。共有序列 2(AEQ ID NO 2)最初發現於含有WA RF、M7 (Pinheiro G等人，1993年基因庫登錄號U03400和U03401)的VH3-7中，並且後來發現與結合有Jh3和IGKV3-15 (kv328)的其他VH3_7RF相關(Borretzen M等人，1995J Immunol (免疫學雜誌)，155 :3630-7)。用TRIzoIq(Life Technologies)或 Rneasy RNA 抽提試劑盒(QIAGEN)從外周血單核細胞(PBMC)分離總細胞RNA。如前所述進行RT-PCR(KnightGB等人，1993J Exp Med,178:1903-1911)。使用來自在FW3中的保守區和μ恆定區的引物進行初次指紋篩查以檢查CDR3多樣性。用恆定區引物，使用來自VH前導序列和FWl區域的上遊寡核苷酸獲得VH-D-JH PCR產物。使用來自VK前導序列的上遊寡核苷酸和來自K恆定區的下遊引物擴增VK-JK片段。在各自PCR中的一個引物用生物素標記，用於分離擴增子，或者用6-FAM標記，以便使用ABI377自動DNA測序儀和GeneScan 軟體快速篩選寡克隆帶。在6%測序膠上電泳分離PCR產物，通過毛細管轉移將其轉移到Tropilon-plus膜(Tropix)上，通過化學發光進行檢測。從測序膠上切除並純化在化學發光圖上所觀察到的克隆擴增的條帶。使用具有Big Dye終止子的ABI 377自動DNA測序儀或生物素化學發光儀(Phototope-star，新英格蘭生物實驗所)使單克隆擴增的Ig基因經受直接循環測序。使用在NCBI的BLAST伺服器，將獲得的Ig基因的推導胺基酸序列與GenBank資料庫中的Ig序列的比較進行分析。統計分析總結各組的人口學和臨床特徵並且表示為頻率(性別)和平均值以及標準偏差(連續變量)。將具有BCE和WA BCE的患者的數目列表，使用Fisher' s精確檢驗，將各擴增類型的流行率在感興趣的關鍵組之間進行比較。以< O. 05的P值用作閾值，推斷組之間的顯著不同的流行率。人口學和實驗室數據總結在以下表I中。採用來自十位具有冷球蛋白血症性血管 炎的患者的陽性和陰性對照樣本來檢驗BCE方法。陽性和陰性對照組分別由6個HCV感染患者(HCV+，II型)和4個HCV陰性患者(HCV-，II型)組成(表2)。正如對於具有冷球蛋白血症性血管炎的患者所預期的，在兩個組中的所有患者體內發現了 BCE。通過對檢測到的BCE的序列分析，鑑定了 WABCE(圖1，表3)。6位HCV+、II型組中的患者中的4位具有WA BCE ;這一發現與先前報導的具有冷球蛋白血症性血管炎的HCV感染患者中的WA mRF的流行率一致(Casato M 等人，1997Blood，90 :3865-3873)。HCV_、II 型組均無 WA BCE，這證實WA mRF限於HCV感染患者。表I關於患者的臨床和實驗室數據
患者性別女/男年齡$ 谷丙轉氨酶"C型肝炎病毒'
HCV+，II 型 1/554.8(10.2) 47.5 (22.9) 17.8 (38.4)x IO6
HCV-, II 型 3/164.0(14.0) 17.7 (2.0) NA
HCV+16/3943.0 (7.0) 98,0 (83,0)9.8 (16.0) x IO6
HCV-16/1742.3 (11.0) 36.0 (32.5)NA
HCV+，RF 0/3751.8 (6.6) 127.92.8 (4.6；) x Hf
(126.27)
HCV+, ΠΙ 型 5/949.6 (8.0) 114.8 (87.9)3.3 (4.3) χ 10"
平均值(I個標準偏差)表2在HCV感染患者和對照中的BCE的檢測患者數目BCEWABCE
HCV+, U 型 064
HCV-, II 型 44O
HCV+ 5594
HCV- 33OO
HCV+, Rr V75
HCV+, III 型 14IO
表3通過核酸測序分析鑑定WABCE
克隆DKVH4HVKJK
共有序列 1EG.......NP^eqid wo. I；
HCV 7EGGDSSDYYYiSEQiDiP 3)(GHV1-694IGKV3-201
27EQDSDSSAYY (seqipko； 4jIGHV1-894IGKV3-201
45EGGLTVTNP(seqid no 5j1GHV1-694IGKV3-201
HCV+, HS 1EGRANDYSNPCseqbi^o 6)IGHV1-69 4IGKV3-20 I
57EGRLTVTNP (sbqipko 7)fGHV1-694IGKV3-201
118EGRLTVTNP (seqidno.s)1GHV1-694IGKV3-202
HCVhRR 127EGRGYSGSDPtsEQXE NO s----
137EFSSDSSGYY sseq id κο ο)---- 146EGRGYSGSDP (seoidmo ii)*- — —< -·
148EFSSDSSGYY isEo it 丨 no: 12)..----
共有序列 2GDYYD-S-G-YIDA(seqjx<nc2)
HCV+ 80GDRYYYGYYG fSHQiDNo.u)IGHV1-694IGKV3-202
HCV+, Ι 18GHDTSDYYSPY (seq HeIGHV1-69 4IGKV3-20 1
HCV+. RF+ 141DYGEQREGYYY (seqibko---■·
其他(養S義)
HQV+ 4AGYDFWSGYYSLDYWY(s0 ro>Kiq|GHV1-89 4(GKV3-20 1
84AGEMATN RPQA (s^q id ho 171IGHV1-S9IGKV3-202
88GWGGAGTTTP iseq id lie. w,')IGHV1-694IGKV3-202
HCV+, 11 38DGGTGS (sbq IGHV1-694IGKV3-151
HCV-, Π 壁 11GSSDCSMSQLP fssoxr KoIGHV1-694IGKV3-202
113LHYGSGSYYSisepidno: 21)IGHV1-694IGKV3-201
HCVt HI# 97PXADSXDVAWT m『::腳ο. 22}1GHV1-6931GKV3-201
HOV+. RF+ 133GGYCSGGSYYis^iDNOA)—一--
138GKTRGNFDV eseqjx>no 24)--—~-為了確定WA BCE是否能在無症狀HCV感染患者中檢測到，對一組55位無症狀HCV感染患者(HCV+)和一組33位HCV陰性患者(HCV-)進行了檢查。在HCV+組中的9位患者體內(14% )檢測到BCE。在這個組中的4位患者(7.4% )具有WA BCE。這些患者的血清中既沒檢測到冷球蛋白，也沒檢測到RF。對醫療記錄的評論證實這些患者均不具有冷球蛋白血症性血管炎或其他的肝外症狀。在具有非WA BCE的5位患者中一位患者既不具有冷球蛋白也不具有RF ;—位患者具有RF陰性的、與冷球蛋白血症性血管炎不相關的II型冷球蛋白血症(De Rosa FG 和 Agnello V，2009J Rheumatol (風溼病學雜誌)，36 :1953);三位患者具有弱陽性血清RF (21. 7，23. 7，40. 9IU/ml)。在HCV陰性組中的患者均不具有BCE。具有WA BCE的患者均無症狀，但是在一位患者中(127號患者，表3)，在外周血中存在絨毛淋巴細胞，並且B淋巴細胞表型與脾淋巴瘤一致，雖然該患者沒有淋巴瘤的體徵或症狀。免疫分型顯示為 IgM+、K+、IgD-, CD19+、CD5-、CD10-、CD23-、CDllc+、WA+ 的一個單克隆B細胞群。絨毛淋巴細胞包括5%的外周淋巴細胞。由於絨毛淋巴細胞與⑶Ilc相關，從患者(127號患者)的外周血淋巴細胞中分離了⑶Ilc淋巴細胞。流式細胞和螢光顯 微鏡研究證明了一個單克隆的WA+、⑶llc+B細胞群，這些B細胞似乎是絨毛淋巴細胞(圖2)。這一發現提示一些絨毛淋巴細胞可能為WA B細胞。對27個BCE中的22個進行了核酸序列分析(表3)。五個BCE由於序列汙染，不能進行分析。22個BCE中的十三個具有WA序列。十個具有共有序列ID區，並且3個具有共有序列2。後者中的2個與IGHV1-69而不是IGHV3-7進行重組。一個BCE具有一個IGKV3-15輕鏈序列；其餘的具有在WA mRF中發現的最常見的輕鏈序列，IGKV3-20。存在著除了 WA之外的7個序列；除了 D區基因之外，所有7個序列具有與WA相似的Ig基因。與已知的RF或與抗HCV E2包膜蛋白E2(在HCV感染中鑑定的唯一的另一種單克隆蛋白)沒有同源性(Quinn ER等人,2001Blood, 98 :3745-49)。4個展示出與GenBank中任何已知的Ig序列沒有顯著的D區同源性，一個顯示出與記憶B細胞中發現的Ig具有微弱的同源性(Stein K等人，1999Blood，94 :2800-8),並且兩個顯示出與胎Ig具有顯著的同源性(Zemlin M等人，2001Blood，97 :1511-13)。假定隨著HCV感染持續時間的增加，mRF從多克隆RF到III型冷球蛋白(多克隆IgG和多克隆IgM RF)到II型冷球蛋白轉換(Lunel F等人，1994Gastroenterology (胃腸病學)，106 :1291-300 ；Schifferli JA等人，1995Adv NephrolNecker Hosp, 24 :107-29)而來。相比於既沒有RF、也沒有冷球蛋白血症的患者，這種「轉換」假設預測在具有RF的患者中以及在具有III型冷球蛋白血症患者中的WABCE流行率增加。為了確定在具有RF的HCV感染患者中的WA BCE的流行率是否增加，對在血中具有RF、但是沒有冷球蛋白血症的一組37位無症狀HCV感染患者(HCV+，RF)進行了檢查(表2)。這個組中的7位患者(18.9% )具有BCE，並且5位(13.5% )具有WA BCE。相比於在HCV+組中，在HCV+、RF組中的BCE和WA BCE的流行率沒有顯著增加(對於BCE和WA B,分別為 P = O. 78 和 ρ = O. 48)。為了確定BCE和WA BCE的流行率的增加是否存在於在具有III型冷球蛋白血症的HCV感染患者中(HCV+，III型)，對具有III型冷球蛋白的14位患者進行了檢查(表2)。僅一位具有BCE ;—種非WABCE。相比於HCV+組，在HCV+、III型組中的BCE和WA BCE的流行率沒有顯著增加(對於BCE和WA B細胞，分別為ρ = O. 67和ρ = O. 58)。無症狀HCV感染患者中WA BCE的檢測顯示WA B細胞是冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤發展的一種標記物。如上所述，為了支持這個觀點，具有與絨毛淋巴細胞脾淋巴瘤一致的單克隆B細胞群的127患者檢測到WA B細胞標記物。假定這位患者進展到臨床脾淋巴瘤，偶然找到這樣一位患者的機率大約為I千萬分之一，如果以下流行率是獨立的話在美國的HCV感染(大約1% )、HCV感染者中的WA BCE的流行率(7. 5% )、非霍奇金淋巴瘤(NHL)的流行率(O. 1% )、以及脾淋巴瘤的流行率(小於NHL的15% )。由於在血中的絨毛淋巴細胞是WA B細胞，這位患者也是信息性的。假定具有絨毛淋巴細胞的脾淋巴瘤與II型冷球蛋白血症和HCV感染是相關的(Saadoun D等人，2005Blood，105 :74-6)。以上呈現的結果表明在HCV感染患者體內的一些脾淋巴瘤中的絨毛淋巴細胞是WAB細胞。WA BCE解釋為在HCV感染患者中大約一半檢測到BCE。沒有鑑定非WA BCE序列。它們與RF無關，因為它們與任何已知的RF沒有顯著的D區同源性。同樣，它們與HCV感染者中鑑定的除了 WA mRF之外的唯一的單克隆蛋白(抗HCV包膜蛋白E2)無關(Quinn ER等人，2001Blood，98 :3745-49)。雖然沒有D區同源性，在非WA BCE中的所有其他Ig基因與WA基因相似。編碼WA mRF的Ig基因用於先天宿主防禦免疫球蛋白應答。這些基因還發現於胎和B細胞記憶Ig庫中(Klein U等人，1997Blood，89 :1288-98)，這可以解釋與在三個非WA BCE中發現的這些免疫球蛋白的同源性。在HCV感染者中的BCE的最可能的病因學的解釋是，在這次感染中產生了多種多樣的天生免疫球蛋白，這些免疫球蛋白被刺激並且隨著延長的感染持續時間而被擴增，這是該疾病的特徵。在一個先前的研究中，RF存在於所有具有BCE的HCV感染患者的血清中，這使得 作者推斷出產生RF的克隆(Franzin F等人，1995Br J Haematol，90 :548-52)。在這個研究中，在沒有RF的患者的血清中BCE的檢測以及在具有RF的患者中與RF沒有顯著同源性的BCE的檢測證明該推斷不成立。另外，在相同的研究中，在具有III型冷球蛋白的HCV感染患者中沒有被檢測到BCE。後面的研究結果，與這個研究的結果一起考慮，提供了反對人們廣泛認為的II型冷球蛋白起源於III型冷球蛋白的證據。當前，大約2%的HCV感染患者用抗病毒療法進行了治療(Volk ML等人，2009H印atol，50 :1750-55)。一位將產生冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤的患者接受抗病毒療法的機率分別小於五百分之一和五千分之一。自動高通量測序儀使得在此描述的方法的臨床應用變得可行。例如，HCV的常規基因分型是通過有成本效益的、高通量的序列分析來進行的。而且，使用一種抗WA Xid抗體檢測WA Xid的方法(如上對於患者127所描述的)可以提供一種更簡單的、臨床適用的方法學。在這個研究中，在HCV感染患者中檢測到的BCE的56%是WA BCE，這可能是WA B細胞惡性腫瘤在HCV感染患者中的流行率的一個合理估計。當前，僅僅在B細胞惡性腫瘤中鑑定了 WA Xid ;25%的與HCV感染相關的NHL是WA B細胞。可能的是，大多數的(如果不是所有的)Wallenstrom巨球蛋白血症以及與HCV感染相關的脾淋巴瘤來源於WA B細胞(Agnello V等人，1992NEngl J Med, 327 :1490-5 ；Casato M等人，2002Blood，99 :2259-61)。當進行更大人群的結果研究時，上述Xid的分析方法可以鑑定進展到B細胞惡性腫瘤的其他 BCE。在此描述的這些方法允許具有BCE的無症狀HCV患者的鑑定和治療。在此描述的方法還允許WA B細胞和其他B細胞增殖的早期檢測，這在預防和治療在HCV感染患者中的冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤中是有用的。在這些患者體內的B細胞惡性腫瘤中的Xid的鑑定也提供了一種可替代的治療方式。例如，單克隆mAb抗Xid抗體用作一種治療劑，例如抗WA mAb用來治療對抗病毒療法無反應的WA B細胞惡性腫瘤。其他實施方案雖然本發明已經結合其詳盡說明進行了描述，前述的說明旨在舉例說明而不是限制本發明的範圍，本發明的範圍是由所附的權利要求書的範圍限定的。其他方面、優點和修改是在以下權利要求書的範圍之內。在此參考的專利和科學文獻建立了所屬領域的技術人員可獲得的知識。所有出版的外國專利和在此引用的專利申請特此通過引用進行結合。在此以登錄號引用的Genbank和NCBI提交特此通過引用進行結合。所有在此引用的其他出版的參考文獻、文獻、手稿和科學文獻特此通過引用進行結合。雖然參考其優選的實施方案已經具體地展示和描述了本發明，本領域的技術人員 將會理解的是，在不脫離由所附權利要求書涵蓋的本發明的範圍的情況下，可以在其中做出不同的在形式和細節上的改變。
權利要求
1.一種鑑定具有產生與C型肝炎病毒(HCV)相關的冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤的風險的受試者的方法，該方法包括 提供一種來自感染有HCV的受試者的樣品； 檢測在所述樣品中的WA交叉獨特型(Xid)+B細胞； 從而鑑定具有產生與HCV相關的冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤的風險的受試者。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述WAXid+B細胞是通過鑑定來自一個克隆擴增的B細胞群的一種免疫球蛋白核酸序列而檢測的，其中該免疫球蛋白核酸序列與WA Xid相關。
3.如權利要求I所述的方法，其中所述WAXid+B細胞是用一種分離的抗WA Xid抗體檢測的。
4.如權利要求I所述的方法，其中所述受試者是早期被鑑定的。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述早期鑑定的受試者是在初次HCV感染之後、但在表現出與冷球蛋白血症性血管炎或B細胞淋巴瘤相關的症狀之前被鑑定的。
6.如權利要求I所述的方法，其中所述樣品是一種包括全血的生物流體。
7.如權利要求2所述的方法，其中與WAXid相關的所述免疫球蛋白核酸序列包含IgHV1-69或IgHV V3-7或有關的種系基因，VK325或VK328、JH4或JH3、Jkl、以及一種D區共有序列，該共有序列包括SEQ ID NO 1(共有序列I)或SEQ ID NO 2(共有序列2)。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述SEQID NO :1(共有序列I)包括胺基酸序列EG-------NP。
9.如權利要求7所述方法，其中所述SEQID N0:2(共有序列2)包括胺基酸序列⑶YYD-S-G-YIDA。
10.如權利要求3所述的方法，其中所述分離的抗WAXid抗體附著到一種標記上，該標記選自下組，該組由異硫氰酸螢光素(FITC)標記和藻紅蛋白(PE)標記組成。
11.如權利要求3所述的方法，其中所述WAXid+B細胞是通過流式細胞分析進行檢測的。
12.如權利要求3所述的方法，其中所述方法進一步包括用一種抗CDlIc抗體來檢測在所述樣品中的一種⑶IIC+細胞。
13.一種用於鑑定具有產生與C型肝炎病毒(HCV)感染相關的冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤的風險的受試者的方法，該方法包括 提供一種來自HCV感染患者的克隆擴增的B細胞的核酸樣品； 檢測在所述樣品中的序列，包括與WA Xid相關的免疫球蛋白核酸序列，其中所述序列包含IgH V1-69或IgHV V3-7或有關的種系基因，VK325或VK328、JH4或JH3、Jkl、以及一個D區共有序列，該序列包括SEQ ID NO : I (共有序列I)或SEQ ID NO:2(共有序列2);並且 如果所述WA Xid序列和所述SEQ ID NO 1(共有序列I)或SEQ ID NO 2 (共有序列2)存在於所述HCV感染患者來源的核酸中，則預測與HCV感染相關的冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤的產生。
14.一種治療與受試者體內的HCV相關的冷球蛋白血症性血管炎和B細胞惡性腫瘤的方法，該方法包括 提供一種來自感染有C型肝炎病毒(HCV)的受試者的樣品； 如果在所述樣品中檢測到WA Xid+B細胞,則向所述受試者施用一種抗WA抗體； 從而治療在所述受試者體內的所述冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述患者缺乏冷球蛋白血症性血管炎或B細胞惡性腫瘤的臨床症狀。
16.一種鑑定具有產生與C型肝炎病毒(HCV)相關的惡性腫瘤的風險的受試者的方法，該方法包括 提供一種來自感染有HCV的受試者的樣品； 檢測在所述樣品中的非WA交叉獨特型陽性(非WA Xid+) B細胞； 從而鑑定具有產生與C型肝炎病毒(HCV)相關的惡性腫瘤的風險的受試者。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述非WAXid+B細胞是通過鑑定來自一個克隆擴增的B細胞群的免疫球蛋白核酸序列而檢測的，其中所述免疫球蛋白核酸序列與特異性非WA Xid相關。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述特異性非WAXid+B細胞是用一種分離的抗非WA Xid抗體檢測的。
19.如權利要求16所述的方法，其中所述診斷是一種早期診斷。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述早期診斷是在初次HCV感染之後、但在表現出與B細胞惡性腫瘤相關的體徵或症狀之前。
21.如權利要求16所述的方法，其中所述樣品是一種包括全血的生物流體。
22.—種試劑盒，該試劑盒包含一套第一引物和第二引物，以及用於基於與WA Xid相關的免疫球蛋白核酸序列的檢測來預測與HCV感染相關的冷球蛋白血症血管炎和B細胞惡性腫瘤的說明書，這些免疫球蛋白核酸序列包括IgHVl-69或VIgH V3-7或有關的種系基因，VK325 或 VK328、JH4 或 JH3、Jkl、以及 SEQ ID NO : I (共有序列 I)或 SEQ ID NO:2(共有序列2)，其中所述套的第一和第二引物包括位於互補決定區3 (CDR3)序列的兩側的一種第一引物和一種第二引物、位於VH-D-JH序列的兩側的一種第一引物和一種第二引物、以及位於Ig編碼轉錄本中的VK-JK序列的兩側的一種第一引物和一種第二引物。
全文摘要
本發提供了通過採用檢測一種特異抗體上的交叉獨特型表位(cross-idiotypic epitope)來檢測在產生疾病的臨床症狀之前產生該抗體的細胞的用於與一種特異性抗體相關的疾病的早期診斷和治療的方法和組合物。
文檔編號A61P31/12GK102859360SQ201180020700
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月28日 優先權日2010年3月1日
發明者文森特·阿格內洛 申請人:文森特·阿格內洛