針對HCMVUL86基因的siRNA序列及應用的製作方法

2023-05-10 04:54:21 2

專利名稱：針對HCMV UL86基因的siRNA序列及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術，涉及分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及針 對人巨細胞病毒UL86基因的siRNA序列的設計、篩選及其在體內外抑制人巨 細胞病毒的應用。
技術背景人巨細胞病毒(HCMV)屬(3皰疹病毒亞科，在人群中感染廣泛，但大多 為無症狀的亞臨床感染。HCMV感染在免疫功能低下的人群(如AIDS、器官 移植患者等)中則可引起多系統的嚴重疾病，且可能與多種惡性腫瘤的發生有 關。同時，HCMV也是導致先天畸形和新生兒出生缺陷的最主要的感染性因素。 因此，防治HCMV感染一直是國內外醫學關注的熱點之一。目前，HCMV的 治療藥物主要包括更昔洛韋(ganciclovir, GCV)、膦甲酸鈉(fascarnet, FOS) 和西多福韋(cidofovir,CDV)，但是由於藥物毒副作用和HCMV耐藥株的出現， 急需探索新的治療途徑控制HCMV感染。HCMV的基因組表達具有一定時序性，可分為即刻早期(IE)、早期(E) 和晚期(L)三種時相蛋白。UL86編碼HCMV的一種重要晚期蛋白——主要 衣殼蛋白(major capsidprotein, MCP)。 MCP是構成HCMV病毒顆粒的重要結 構蛋白，同時也是感染過程中HCMV刺激宿主產生特異性抗體的主要抗原之 一，對研究HCMV與宿主免疫系統的相互作用具有重要意義。RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是序列特異的雙鏈RNA (dsRNA) 使細胞內同源mRNA降解，從而產生特異性基因表達沉默的過程。它是機體 的一種小分子RNA介導的序列特異性免疫保護機制，可以對抗侵入性遺傳因 子的作用。自1998年首次被報導以來，RNAi技術以其特有的優越性而被迅速 應用於抗病毒及其相關方面的研究中，目前已在HIV、 HBV、 HCV、流感病毒 等的抗病毒研究中取得重要進展。RNAi的作用主要由長約21~23nt的dsRNA介導，其中一類稱為小幹擾 RNA (small interfering RNA，siRNA)，它和目的mRNA序列具有嚴格的配對， 能引起相應mRNA降解。由於RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特異性降解，因此要產生有效RNAi的關鍵是選擇合適的siRNA作用耙點。目前RNAi 靶點的選擇原則可以概括為以下幾點①選擇GC含量在50%左右的mRNA 區域；②避免選擇啟動子起始部位下遊50~100nt以內或終止子上遊50~100nt 內的區域；③避免超過三個G或三個C的重疊，因為多聚G或多聚C能形成 類聚物而幹擾RNAi的沉默機制；④選擇以兩個AA開始的序列，這將使合成 siRNA更加容易；⑤保證靶序列與其他基因沒有同源性。目前，製備siRNA的方法主要有5種①化學合成法直接通過化學方法 合成兩條互補的21 23nt的RNA單鏈，然後退火形成雙鏈siRNA，缺點是價 格昂貴；②體外轉錄法以OligoDNA為模板，體外轉錄合成siRNA，此法效 率高，但不適用於大量研究；③長片段dsRNA經RNase III降解法將 200 1000bp的耙mRNA用體外轉錄法製備後，再用RNase III進行體外消化， 得到不同siRNA的混合物，該方法不適用於特定siRNA的研究，也有可能引 起非特異的基因沉默； siRNA表達載體法通過將含RNA聚合酶III啟動子 的質粒或病毒載體轉染到宿主細胞內，轉錄出短髮夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)， shRNA在胞內被Dicer酶剪切為siRNA而發揮作用，此方法具有可 大量擴增和長時間研究的優點；⑤PCR製備的siRNA表達框法通過PCR方 法得到一個包含RNA聚合酶m啟動子、編碼shRNA的DNA模板和RNA聚 合酶III終止位點的表達框架，然後導入細胞內轉錄成siRNA，其優點是簡單快 捷，但存在基因整合的潛在危險。 發明內容本發明的目的是提供針對HCMV UL86基因的有效siRNA的cDNA序列， 其核苷酸序列是5，-GCACGTCAGTTATCATCAACA-3，。本發明的另一個目的是提供該cDNA序列在製備治療人巨細胞病毒感染 藥物重的應用。本發明根據siRNA設計原則，構建針對HCMV UL86基因的siRNA真核 表達載體，轉化大腸桿菌後提取質粒，轉染AD293細胞，可有效抑制UL86 基因mRNA和蛋白表達水平，因此可應用於HCMV治療藥物的製備。本發明的有益之處是提供的siRNA序列針對HCMV的主要衣殼蛋白編 碼基因UL86，目前國內外尚無用siRNA表達載體法篩選HCMVUL86基因有 效siRNA序列的報導。以此序列為基礎的真核表達載體具有在細胞中持續、有 效抑制UL86基因mRNA和蛋白表達的優點，故可作為HCMV治療藥物開發 的一個新靶點。
具體實施方式
本發明結合實施例作進一步的說明。實施例一 siRNA真核表達載體體外抑制UL86-EGFP融合蛋白的表達1. siRNA的設計根據siRNA設計原則，從UL86 mRNA起始密碼子AUG 下遊lOOnt處搜索AA序列，其3'端相鄰21nt序列作為候選靶點，從中選擇 GC含量在40~55°/。的siRNA序列，並通過GenBank資料庫的Blast功能與人 類基因組序列進行比對，確保無同源性。最終選擇的siRNA其cDNA序列為 5，-GCACGTCAGTTATCATCAACA-3，， GC含量為42.9%，對應UL86 mRNA 中3161-3181核苷酸位點。2. 表達siRNA所需shDNA的合成與製備表達siRNA所需shDNA的正 義 鏈 序 列 為 0￡TTTTTA-3，，反 義 鏈 序 列 為TGACGTGCG-3，，委託生物公司合成後，將正、反義鏈退火形成雙鏈。3. siRNA真核表達載體的構建具有U6啟動子的真核表達質粒pSilencer 2.0-U6 (美國Ambion公司)用BamH I和Hind III雙酶切，與退火後的shDNA 雙鏈連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a， 37"C培養過夜，挑取克隆抽提質 粒送上海英駿公司進行DNA測序鑑定，選取測序結果正確的質粒擴增、保存。4. siRNA表達質粒體外抑制UL86-EGFP融合蛋白表達的實驗(1) 報告質粒pUL86-EGFP:為表達綠色螢光蛋白(EGFP)和UL86融合 蛋白的質粒，由UL86基因cDNA插入pEGFP-Nl(美國Clontech公司)的Hind III禾口 EcoRI位點構建而成，由於EGFP位於UL86的下遊，且共用一個啟動子， 故EGFP的表達情況可間接反映UL86的表達。(2) siRNA表達質粒與報告質粒共轉染AD293細胞人胚腎細胞AD293接 種12孔細胞培養板後，待細胞達到80%~90%融合率，用Invitrogen公司 Lipofectamine 2000試劑將siRNA表達質粒與報告質粒pUL86-EGFP共轉染細 胞，操作方法參照試劑說明書，同時設轉染空質粒pSilencer 2.0-U6的陰性對 照組和不轉染質粒的空白對照組，5小時後換培養液(含10%新生牛血清的 DMEM)繼續培養。(3) 螢光定量RT-PCR檢測AD293細胞中UL86mRNA的表達質粒轉染後48h，收集AD293細胞，Trizol法抽提細胞總RNA，採用TAKARA公司的 SYBR PrimeScript RT-RCP Kit檢測病毒UL86的mRNA，實驗方法參照試劑盒 說明書。UL86基因PCR引物序列為上遊弓I物序列5 ，-GACGCTGGCCGCCATGTTAT-3 ，，下遊引物序列5'-GCATTGCGCTCGGACATGCT-3 ，。內參照採用GAPDH， PCR弓I物序列為上遊引物序列5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ，，下遊引物序列5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，。結果顯示，與陰性對照組相比，siRNA表達質粒對UL86mRNA表達的抑 制率為56.6%。(4)流式細胞儀檢測AD293細胞中UL86蛋白表達情況質粒轉染後72h， 收集每孔內細胞，用PBS緩衝液洗滌2次後重懸於PBS中。用流式細胞儀在 488nm激發波長下檢測每孔細胞平均螢光強度(mean fluorescence intensity, MFI)及螢光陽性細胞比率a，計算每孔細胞的總螢光強度(total fluorescence intensity, TFI) = MFIx a 。結果顯示，與陰性對照組相比，siRNA表達質粒對 UL86蛋白表達的抑制率為74.2%。本發明繫結合最佳實施例進行描述，在閱讀了本發明的上述內容後，本領 域技術人員可以對本發明作各種修改，這些等價形式同樣落於本發明所附權利 要求書所限定的範圍內。本發明涉及的序列 1 21 DNA 人工序列 根據HCMV UL86基因設計的siRNA的cDNA序列 1GCACGTCAGT TATCATCAAC A 212 57 DNA 人工序列 製備UL86基因siRNA所需shDNA正義鏈的序列 23 57 DNA 人工序列 製備UL86基因siRNA所需shDNA反義鏈的序列 3574 20 DNA 人工序列 UL86基因PCR上遊引物序列 4GACGCTGGCC GCCATGTTAT 20 5 20DNA 人工序列 UL86基因PCR下遊引物序列 5GCATTGCGCT CGGACATGCT 206 19 DNA 人工序列 GAPDH基因PCR上遊引物序列 6GAAGGTGAAG GTCGGAGTC 19 7 20 DNA 人工序列 GAPDH基因PCR下遊引物序列 7GAAGATGGTG ATGGGATTTC 20
權利要求
1.一種針對人巨細胞病毒UL86基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5』-GCACGTCAGTTATCATCAACA-3』。
2. 權利要求1所述的cDNA序列在製備治療人巨細胞病毒感染的藥物中 的應用。
全文摘要
本發明提供一種針對人巨細胞病毒UL86基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5』-GCACGTCAGTTATCATCAACA-3』。本發明根據siRNA設計原則，選擇的siRNA其cDNA序列的GC含量為42.9％，對應UL86 mRNA中3161-3181核苷酸位點，構建針對HCMV UL86基因的siRNA真核表達載體，轉化大腸桿菌後提取質粒，轉染AD293細胞，可有效抑制UL86基因mRNA和蛋白表達水平，可在製備治療人巨細胞病毒感染的藥物中的應用。
文檔編號A61P31/00GK101333525SQ200810063308
公開日2008年12月31日 申請日期2008年8月1日 優先權日2008年8月1日
發明者尚世強, 段群軍, 胡妙鳳, 趙正言, 然 陶 申請人:浙江大學