一種原核表達載體pASK－75－EX的製作方法

2023-05-09 18:13:11

專利名稱：一種原核表達載體pASK－75－EX的製作方法
技術領域：
本發明涉及原核表達載體，具體地說是採用設計併合成的載體克隆表達區基因構建成一種新型原核表達載體pASK-75-EX。
背景技術：
載體pASK-75是一種在大腸桿菌中表達外源蛋白的高效表達載體，其嚴緊型控制的啟動子tetA保證了在誘導物缺失的情況下對外源基因的表達抑制，適合表達對宿主菌有細胞毒性的外源蛋白，微量的四環素即可充分誘導tetA啟動子的啟動，使其具有較高的表達效率。另外，tetA啟動子表達系統不受任何其它細胞調節機制的控制，因此對表達宿主菌的選擇沒有限制。但是pASK-75的多克隆位點缺乏常見的高活力的限制性內切酶位點，且其下遊融合的Strep-tag純化標籤需要極高的純化成本，限制了pASK-75的應用。

發明內容
本發明的目的在於提供一種應用方便、廉價的原核表達載體pASK-75-EX。
為實現上述目的，本發明對pASK-75載體進行改造，保留了tetA啟動子序列和OmpA信號肽序列，新添加了含常用限制性內切酶的多克隆位點，並以His-tag標籤取代Strep-tag，構建成新型表達載體pASK-75-EX。與原載體相比，pASK-75-EX使外源基因的克隆和外源蛋白的純化檢測更方便廉價；本發明設計併合成載體克隆表達區基因，包括StuI、NcoI、ShpI、EcoRI、NotI、BglII、XhoI和PstI限制性內切酶位點，His-tag純化鑑定標籤，其具有序列表SEQ ID NO1中鹼基序列；設計併合成的載體克隆表達區基因鹼基序列如下CCTGGCCCAG CCGGCCCATG GCATGCGAAT TCGCGGCCGC 40AGATCTGCTC GAGCTGCAGC ATCATCATCA TCATCATA78利用限制性核酸內切酶StuI和Hind III的酶切連接技術，將合成的載體克隆表達區基因整合入表達載體pASK-75克隆表達區(替代原pASK-75表達載體201位至292位的鹼基序列)，構建成新型表達載體pASK-75-EX。
本發明具有如下優點1.本發明構建的新型表達載體pASK-75-EX具有含多種常用限制性內切酶組成的多克隆位點，大大方便了外源基因的克隆。
2.本發明構建的新型表達載體pASK-75-EX以His-tag純化鑑定標籤替換原載體的Strep-tag純化鑑定標籤，簡化了對表達的外源蛋白純化和鑑定的操作，並顯著降低了純化和鑑定的成本。
3.本發明保留了原載體的tetA啟動子序列和OmpA信號肽序列，保持了新構建的表達載體pASK-75-EX對外源基因的嚴緊型表達控制。
4.應用實施例製備的新型表達載體，方便廉價的實現了對單鏈抗體蛋白(scFv-ML)和融合免疫毒素蛋白(B-L-SEC2)的表達、純化和生物學鑑定。


圖1為pASK-75-EX多克隆位點的單酶切驗證以1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析結果圖，其中1.未經酶切的原始pASK75質粒，2.未經酶切的pASK75-EX質粒，3-7.分別經SphI，EcoRI，BglII，XhoI，PstI單酶切後的pASK75-EX質粒，4.DL2000DNA分子量標準圖2為利用引入的His-tag將表達的單鏈抗體ML蛋白經Ni親和層析柱純化後的結果。
圖3為利用引入的His-tag將表達的融合免疫毒素B-L-SEC2蛋白經Ni親和層析柱純化後的結果。
圖4為利用引入的His-tag將表達的單鏈抗體ML蛋白經蛋白免疫印記法鑑定的結果。
圖5為利用引入的His-tag將表達的融合免疫毒素B-L-SEC2蛋白經蛋白免疫印記法鑑定的結果。
具體實施例方式
實施例1載體克隆表達區基因的製備，其具有序列表SEQ ID NO1中所示的鹼基序列ACCATCGAATGGCCAGATGATTAATTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATCATTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAATGAATAGTTCGACAAAAATCTAGATAACGAGGGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTGGCCCAGCCGGCCCATGGCATGCGAATTCGCGGCCGCAGATCTGCTCGAGCTGCAGCATCATCATCATCATCATAAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTTTTGTCTGCCGTTTACCGCTACTGCGTCACGGATCTCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACG
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(1)SEQ ID NO.1的信息(參見序列表)(a)序列特徵*長度3252鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型DNA
(c)假設否(d)反義否(e)最初來源載體pASK-75(2)載體克隆表達區基因的製備1)載體克隆表達區基因的設計合成根據構建新型表達載體的預期目的，設計併合成兩條寡聚核苷酸鏈正向鏈p-F5』-CC TGG CCC AGC CGG CCC ATG GCA TGC GAATTC GCG GCC GCA GAT CTG CTC GAG CTG CAG CAT CAT CAT CATCAT CATA-3』；反向鏈p-R5』-A GCT ATG ATG ATG ATG ATG ATG GTC CAG CTCGAG CAG ATC TGC GGC CGC GAA TTC GCA TGC CAT GGG CCG GCTGGG CCA GG-3』2)寡聚核苷酸鏈的退火10×退火雜交緩衝液(SSC)成分1.5mol/L NaCl0.3M檸檬酸三鈉·2H2O，以HCl調pH至7.0退火反應體系10×SSC buffer 1μl正反寡聚核苷酸鏈 各5pmol無菌超純水 補齊體積至10μl退火反應條件94℃10min；0℃10min；72℃20min；實施例2新型表達載體pASK-75-EX的構建(1)pASK-75載體的雙酶切將德國Biometra公司pASK-75載體質粒DNA經限制性核酸內切酶StuI和HindIII充分消化，消化產物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，膠回收純化3200bp大片段；(2)酶切產物的連接及轉化將退火的寡聚核苷酸鏈和pASK-75載體大片段以5∶1的摩爾比例混合，並以T4DNA連接酶16℃連接過夜，構建成表達載體pASK-75-EX。連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞(轉化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學實驗指南》美國紐約John Wiley Sons出版社1995年第三版P39-40)，以氨卞青黴素抗性篩選轉化子。
(3)表達載體pASK-75-EX的驗證將挑選的陽性轉化子擴培，提取質粒DNA(質粒DNA提取方法按J.薩姆布魯克，E.F.費裡奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆實驗指南》美國紐約冷泉港出版社2001年第三版P27-30)，分別經僅存在於設計的載體克隆表達區的限制性內切酶SphI，EcoRI，BglII，XhoI，PstI單酶切鑑定(附圖1)，並以Sanger雙脫氧末端終止法測序證實。
實施例3新型表達載體pASK-75-EX的實際應用及效果評價(1)將外源基因片段連接入新型表達載體pASK-75-EX將pASK-75-EX質粒DNA和含有單鏈抗體ML基因的pET-28a-ml質粒DNA分別用Nco I、Not I雙酶切，經1.0％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收770bp的ml片段及pASK-75-EX質粒3200bp片段，以T4 DNA連接酶16℃連接過夜，構建單鏈抗體蛋白表達載體pASK-75-EX-ml。連接產物轉化E.coli BL21(DE3)感受態細胞。以氨卞青黴素抗性篩選轉化子，挑選重組克隆擴培，提取質粒DNA，經Nco I、Not I雙酶切鑑定正確重組克隆。
同樣方法以NcoI、XhoI雙酶切pASK-75-EX質粒和含有融合免疫毒素基因的pET-28a-b-l-sec2質粒DNA，構建融合免疫毒素蛋白表達載體pASK-75-EX-b-l-sec2。
(2)外源蛋白的表達分別接種轉化了重組質粒pASK-75-EX-ml和pASK75-EX-b-l-sec2的BL21(DE3)單菌落於含100μg/ml氨卞青黴素的液體LB中37℃過夜，次日按1∶50轉接，37℃培養至OD6000.8，加入終濃度為0.2ug/ml的四環素37℃誘導6h。
(3)利用新引入的His-tag標籤純化外源蛋白離心收集誘導表達後的菌體，每100ml原培養物的菌體重懸於10ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.5的緩衝液，加0.025％溶菌酶於37℃裂解細胞，於0℃超聲破碎直至菌液變的清亮，12000g離心20min收集上清，上樣於平衡緩衝液平衡好的Ni親和層析柱(購自美國Novagen公司)，以平衡結合緩衝液(5mmol/L咪唑，0.5MNaCl，20mmol/L Tris-HCl pH7.5)平衡至基線，用含100mmol/L咪唑的平衡結合緩衝液洗脫目的蛋白，並以SDS-PAGE分析純度(附圖2，3)。(SDS-PAGE具體操作方法按郭堯君《蛋白質電泳實驗技術》科學出版社1999年第一版P132)。單鏈抗體ML蛋白和融合免疫毒素蛋白B-L-SEC2的分子量分別為35kD和60kD。
(4)利用新引入的His-tag標籤以蛋白免疫印記法鑑定外源蛋白將純化後的單鏈抗體ML蛋白和融合免疫毒素蛋白B-L-SEC2以SDS-PAGE分離，半乾轉膜儀轉至硝酸纖維膜，2％脫脂牛奶封閉，以兔抗His-tag抗體、鹼性磷酸酶標記的羊抗兔抗體依次處理，NBT/BCIP顯色試劑盒顯色(附圖4，5)。(所用緩衝液和具體操作方法按汪家政，範明《蛋白質技術手冊》科學出版社2002第一版P166)
SEQUENCE LISTING110中國科學院瀋陽應用生態研究所120一種原核表達載體pASK-75-EX130
1601170PatentIn version 3.121012113252212DNA213載體pASK-75220
221misc_feature222(1)..(3252)223
4001accatcgaat ggccagatga ttaattccta atttttgttg acactctatc attgatagag 60ttattttacc actcccratc agtgatagag aaaagtgaaa tgaatagttc gacaaaaatc 120tagataacga gggcaaaaaa tgaaaaagac agctatcgcg attgcagtgg cactggctgg 180tttcgctacc gtagcgcagg cctggcccag ccggcccatg gcatgcgaat tcgcggccgc 240agatctgctc gagctgcagc atcatcatca tcatcataag cttgacctgt gaagtgaaaa 300atggcgcaca ttgtgcgaca ttttttttgt ctgccgttta ccgctactgc gtcacggatc 360tccacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 420ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 480ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 540ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 600ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 660gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 720tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 780ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc aggtggcact tttcggggaa 840atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 900tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 960aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc1020
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1.一種原核表達載體pASK-75-EX，其特徵在於具有序列表SEQ IDNO1中鹼基序列。
全文摘要
本發明涉及原核表達載體，採用設計併合成的載體克隆表達區基因構建成一種新型原核表達載體pASK－75－EX，其具有序列表SEQ ID NO1中鹼基序列；其具有常見的限制性核酸內切酶組成的多克隆位點和純化檢測標籤。結果表明pASK－75－EX可高效表達外源蛋白scFv－ML與B－L－SEC2，且其表達產物由於載體中新添加的純化檢測標籤而可被方便廉價的純化和檢測。
文檔編號C12N15/74GK1840666SQ200510046140
公開日2006年10月4日 申請日期2005年3月30日 優先權日2005年3月30日
發明者徐明愷, 張惠文, 張成剛 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所