溶劑耐受微生物及分離方法

2023-05-09 23:18:21 1

專利名稱：：溶劑耐受微生物及分離方法CPCH0864039P_說明書_溶劑耐受微生物及分離方法此申請要求2006年6月15日提交的美國臨時申請No60/813779的權益。發明領域本發明涉及工業微生物學領域。特別地，微生物已被分離，表現出對醇，尤其是丁醇的高耐受性。
背景技術：
：丁醇是重要的工業化學品，用作燃料添加劑、塑料行業的化工原料，以及食品和調味品工業的食品級提取劑。每年通過石化方法製備100至120億磅的丁醇，對此日用化學品的需求可能會增加。丁醇的化學合成方法是眾所周知的。例如l-丁醇可利用巴豆趁的Oxo法、Reppe法,或力口氬製備(t/Z/ma/wJ五"cyc/opeW"。/7m^WnWC/7em&^7,6thedition,2003,Wiley-VCHVerlagGmbHandCo"Weinheim,Germany,Vol.5,pp.716-719)。2-丁醇可4吏用正-丁丈希7K合製備(t/〃maw7's五"qyc/opeafeo//"dwW/-/"/C/zew/s^y,6thedition,2003，Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.,Weinheim,Germany,Vol.5,pp.716-719)。或者異丁醇可用一氧化碳的Oxo合成、催化i^ft^t/Z/maww&五"cyc/ope(i/(3o//"cksr/a/C7zew&^y,6thedition,2003，Wiley-VCHVerlagGmbHandCo"Weinheim,Germany,Vol.5,pp.716-719)，或曱醇和正-丙醇的Guerbet縮合(Carlini等，/Mo/ec.Cato/.A'C72em.220:215-220(2004))製備。這些方法4吏用的起始原料來自石化產品，通常昂貴且不利於環保。通過發酵生產丁醇的方法也是已知的，最普遍的方法製備出丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物，被稱為ABE法(Blaschek等，U.S.PatentNo.6,358,717)。通過丙酮丁醇4發菌(4炎狀芽孢桿菌ac^o6w/^cww)的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發酵是最古老的已知工業發酵，製備這些溶劑的途徑和基因已有報導(Girbal等，7Ve"A/"5/o&c/7"o/ogy16:11-16(1998))。此外，表達l-丁醇生物合成途徑(Donaldson等，同時待審並共同擁有的美國專利申請No.11/527995),2-丁醇生物合成途徑(Donaldson等，同時待審並共同擁有的美國專利申請No.60/796，816),以及異丁醇生物合成途徑(Maggio-Hall等，同時待審並共同擁有的U.S專利申請No.ll/586315)的重組體微生物製備宿主已有描述。但是人們認為丁醇的生物製備被丁醇對發酵中使用的宿主微生物的毒性所限制。耐受l-丁醇的梭狀芽孢桿菌菌抹已通過化學誘變(Jain等，美國專利No.5,192,673;和Blaschek等，美國專利No.6,358,717),某些類別的基因如表達應激反應蛋白的基因的過度表達(Papoutsakis等，美國專利No.6,960,465;和Tomas等，J///,￡wv/ra".M/cra&o/.69(8):4951-4965(2003)),以及連續富集(Quratulain等，Fo"aM/craWo/og/ca(Prague)40(5):467-471(1995);和Soucaille等，CurrentMicrobiology14(5):295-299(1987))分離。Desmond等(^^/.￡"v/ra".M/craZ)/o/.70(10):5929-5936(2004))報導，應激反應蛋白GroESL在乳酸乳球菌(丄actococc船/acfe)和類乾酪乳桿菌(丄""oZa"7/ws;aracasd)中的過度表達產生了能在0.5。/。體積/體積(v/v)l-丁醇存在下生長的菌4朱。此外，來自河口沉積物(Sardessai等，C"rew/SWewce82(6):622-623(2002))和活化汙泥(Bieszkiewicz等,爿ctoMfcra6/o/og/cG屍o/om.ca36(3):259-265(1987))的1-丁醇耐受性菌株的分離已有描述。另外已知一些乳4幹菌耐受乙酉享(參見例力口Couto,PinaandHoggBiotechnology.Letter19:487-490).IngramandBurke(1984)Adv.Micribial.Physiol25:253-300。但是，對本領域描述的大多數微生物而言，37。C下生長在9液體培養基時，濃度小於2.0。/。w/v的l-丁醇使生長完全受到抑制。而且耐受2-丁醇和異丁醇的微生物菌林在本領域不是已知的。因此，對l-丁醇、2-丁醇和異丁醇具有高耐受性的微生物的鑑別將代表著本領域內的進步。此外，2-丁酮和乙醇都是可用微生物發酵製備的有價值的化合物。2-丁酮也被稱為曱乙酮(MEK)，是繼丙酮後廣泛使用的溶劑和最重要的商業製備的酮。它能用作漆、樹脂和粘合劑的溶劑，以及氧化反應的選擇性提取劑和活化劑。2-丁酮可以通過省略2-丁醇生物合成途徑的最後一步製備(Donaldson等，同時待審並共同擁有的美國專利申請No.60/796816)。乙醇作為替代燃料需求高。大腸桿菌(五.//)的基因修飾菌抹已用作乙醇製備的生物催化劑(Underwood等，(2002)App1.Environ.Microbiol.68:6263-6272)。乙醇產出提高的運動酵單胞菌(Zywomow^woM/力的基因修飾菌林在US2003/0162271Al中有描述。對2-丁酮和乙醇具有提高的耐受性的微生物的鑑別將增加這些化合物的產出。因此存在著對丁醇耐受性更高的微生物宿主菌抹的需求，可用於生物製備高含量(titer)的丁醇。本發明通過丁醇耐受微生物的發現及其分離方法的開發解決了此需求。此外，發現的微生物對2-丁酮和乙醇的耐受性增加。發明概述本發明涉及丁醇耐受的微生物，尤其是乳桿菌屬的成員及其分離方法。富集並篩選對丁醇耐受的微生物聚生體。分離了37。C下在固體培養基生長時，對至少2.5%w/v濃度的1-丁醇表現出耐受性的乳桿菌的一些種。因此，本發明提供了分離丁醇耐受微生物的方法，其包括a)提供包含微生物聚生體的微生物樣品；b)使所述微生物聚生體與包含可發酵碳源的生長培養基接10觸，直至微生物聚生體的成員生長；c)使步驟(b)的生長中的微生物聚生體與丁醇接觸；以及d)分離步驟(c)的可存活成員，其中丁醇耐受的微生物被分離。在另一實施方案中，本發明提供通過本發明方法分離的丁醇耐受微生物，優選的微生物是乳桿菌屬的。在另一實施方案中，本發明提供了丁醇耐受乳桿菌的分離方法，其包含a)提供包含微生物聚生體的微生物樣品；b)在含有可發酵碳源的培養基中，富集存在乳桿菌的微生物聚生體(enrichingthemicrobialconsortiumforthepresenceof丄acto&c/〃w)，以生成乳桿菌富集的培養物，其中乳桿菌富集培養物的成員正在生長；c)使步驟(b)的生長中的乳桿菌富集培養物與丁醇接觸；以及d)分離步驟(c)的可存活成員，其中丁醇耐受乳桿菌被分離。在優選實施方案中，本發明提供了通過本發明的方法分離的丁醇耐受的乳桿菌，所述具體丁醇耐受乳桿菌被鑑定為ATCCPTA-8318(植物乳桿菌PN0510),ATCCPTA-8320(植物乳桿菌PN0511),ATCCPTA-7727(植物乳桿菌PN0512)和ATCCPTA-8319(亞利桑那乳桿菌PN0514)。在另一實施方案中，本發明提供了製備丁醇的方法，其包含a)提供通過本發明的方法分離的乳桿菌，其包含編碼丁醇生物合成途徑的基因構建物，和b)使步驟(a)的乳桿菌在可製得丁醇的條件下生長。在另一實施方案中，本發明提供了製備2-丁酮的方法，其包含c)提供通過本發明的方法分離的乳桿菌，其包含編碼2-丁酮生物合成途徑的基因構建物；以及d)使步驟(a)的乳桿菌在可製得丁酮的條件下生長。生物保藏簡述及序列說明本發明的各種實施方案可從作為此發明的一部分的下列詳細說明、生物保藏和附隨的序列說明得到更完全的理解。在國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約的條款下，申請人進行了下列生物保藏。保藏物識別參考號國際保藏名稱保藏日期植物乳桿菌PN0510植物乳桿菌PN0511植物乳桿菌P廳12亞利桑那乳桿菌PN0514ATCC:PTA-8318ATCC:PTA-8320ATCC:PTA-7727ATCC:PTA-83192007年4月3曰2007年4月3曰2006年7月12日2007年4月3曰下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825("含核苷酸序列和/或胺基酸序列的專利申請的公開所需的要求-序列規則(R叫uirementsforPatentApplicationsContainingNucleotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRules)"),並與世界歲口i口、產權組織(WIPO)標準ST.25(1998)，以及EPO和PCT的序列列表要求(法條5.2(Rules5.2)和49.5(a-bis)，以及管理規範(AdministrativeInstructions)的208節(Section208)和附件C(AnnexC))一致。用於核苷酸和胺基酸序列數據的符號和形式與37C.F.R.§1.822中所示的規則一致。表11-丁醇生物合成途徑的基因和蛋白SEOID號的概要12說明SEGIDNO:核酸SEQIDNO:肽來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙醯-CoA乙醯轉移酶thlA12來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的乙醯-CoA乙醯轉移酶細34來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的3-羥基丁醯基-CoA脫氫酶56來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的巴豆酸酶"78來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的推定反烯醯CoA還原酶910來自拜季林斯基梭狀芽孢桿菌(Clostridiumbeijerinckii)NRRLB594的丁醛脫氫酶1112來自丙酮丁醇^f炎菌ATCC824的l-丁醇脫氫酶bdhB1314來自丙酮丁醇^l菌ATCC824的l-丁醇脫氫酶bdhA1516表22-丁醇生物合成途徑的基因和蛋白SEOID號的概要說明SEQIDNO:核酸SEQIDNO:肽budA，來自肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC25955的乙醯乳酸脫羧酵1718budB,來自肺炎克雷伯桿菌ATCC25955的乙醯乳酸合酶1920budC，來自肺炎克雷伯桿菌IAM1063的丁二醇脫氬酶2122pddA，來自催產克雷伯桿菌(Klebsiellaoxytoca)ATCC8724的丁二醇脫水酶a亞基2324pddB,,來自催產克雷伯桿菌ATCC8724的丁二醇脫水酶p亞基2526pddC,來自催產克雷伯桿菌ATCC8724的丁二醇脫水%亞基2728sadH,來自赤紅球菌(Rhodococcusruber)219的2-丁醇脫氫酶293013表3異丁醇生物合成途徑的基因和蛋白SEOID號的概要tableseeoriginaldocumentpage14如實施例1中所述，SEQIDNOs:39和40是用於擴增丁醇耐受菌株16SrRNA基因的引物的核普,列。如實施例1中所述，SEQIDNOs:41-44是丁醇耐受乳桿菌菌林16SrRNA基因的核苦酸序列。發明詳述本發明提供了表現出醇高耐受性的微生物，尤其是丁醇，以及2-丁酮和乙醇。本發明的微生物能在存在有2.5%w/v或更高的1-丁醇的固體培養基上生長。此外，本發明提供了分離丁醇耐受微生物的方法。這些丁醇耐受微生物可以是通過基因工程改造成包含丁醇生物合成途徑或2-丁酮生物合成途徑，並用於生物合成高含量的l-丁醇、2-丁醇、異丁醇或2-丁酮。下列定義和縮略語用於解釋權利要求和說明書。本文所用的術語"丁醇，，指l-丁醇、2-丁醇、異丁醇或其混合物。當用於描述本發明的微生物時，術語"丁醇耐受微生物"和"耐受"指37。C下在存在2.5°/。w/v或更高的l-丁醇、2-丁醇或異丁醇的固體培養基上生長時，或37。C下在存在2.0。/。w/v或更高的l-丁醇、2-丁醇或異丁醇的液體培養基中生長時，顯示出生長態勢的細菌或酵母菌。術語"微生物聚生體"指不同基因型的異質微生物種群。例如，微生物聚生體可以是環境樣品，如廢水汙泥或土壤或堆肥或受汙染的水樣；純菌抹的化學誘變微生物種群；含有多拷貝質粒庫的微生物菌抹；某一特定菌抹的轉座子標記的突變體群。術語"環境樣品"指從環境獲得的樣品。尤其地，環境樣品可能是從接觸丁醇和/或其它溶劑的環境獲得的廢水汙泥或其他樣品。環境樣品包含孩i生物聚生體。施用於微生物培養物，特別是微生物聚生體培養的術語"富集，，指向聚生體或微生物培養物的細胞提供過量生長營養物以提高或促進細胞生長的做法。術語"可發酵碳源"、"碳底物"或"可發酵碳底物"互換使用，指很容易為微生物聚生體利用的碳源。可發酵碳源包括但不限於單糖、寡糖、多糖和一碳底物或其混合物。優選的可發酵碳源的非限制列表包括筒單糖，如葡萄糖、果糖和蔗糖；以及羧酸，如脂肪酸、丁酸和戊酸。術語"需氧條件"指有氧存在的生長條件。術語"厭氧條件"至無氧存在的生長條件。術語"微需氧條件"指低水平氧(即低於正常的大氣氧水平)的生長條件。術語"丁醇生物合成途徑"指產生l-丁醇、2-丁醇或異丁醇的酶途徑。術語"l-丁醇生物合成途徑"指從乙醯輔酶A(乙醯-CoA)產生1-丁醇的酶途徑。術語"2-丁醇生物合成途徑"指從丙酮酸產生2-丁醇的酶途徑。術語"異丁醇生物合成途徑"指從丙酮酸產生異丁醇的酶途徑。術語"2-丁酮生物合成途徑"指從丙酮酸產生2-丁酮的酶途徑。術語"乙醯CoA乙醯基轉移酶"指催化兩分子乙醯CoA轉化為乙醯乙醯-CoA和輔酶A(CoA)的酶。雖然具有更寬底物範圍的酶(E.C.2.3丄16)也會有功能，但優選的乙醯CoA乙醯基轉移酶是底物優選(在正向上反應)短鏈醯基CoA和乙醯CoA的乙醯輔酶A醯基轉移酶，分類為E.C.2.3.1.9[五w^yweiVowe"c/Www7992，AcademicPress,SanDiego]。乙醯CoA乙醯基轉移酶乂人一些來源獲得，例如大腸桿菌C&c/^n'c/2/aco//)(GenBankNos:NP一416728,NC一000913;NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)胺基酸序列，NCBI核苷酸序列)，丙酮丁醇梭菌(GenBankNos:NP一349476.1(SEQIDNO:2),NC—003030;NP—149242(SEQIDNO:4),NC—001988),枯草桿菌(萬ac/〃wsswto'fe)(GenBankNos:NP—390297,NC—000964)以及釀酒酵母(5V7cc/zara附ycascemvz'w'(3e)(GenBankNos:NP一O15297，NC_001148)。術語"3-羥基丁醯基CoA脫氬酶"指催化乙醯乙醯基-CoA轉化成3-羥基丁醯基CoA的酶。3-羥基丁醯基CoA脫氬酶可以是還原的煙醯胺腺噪呤二核苷酸(NADH)依賴性的，底物優選(S)-3-羥基丁醯基CoA或(R)-3-羥基丁醯基-CoA，分別被分類為E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。此外，3-羥基丁醯基CoA脫氬酶可以是還原的煙醯胺腺噤呤二核苷酸磷酸(NADPH)依賴性的，底物優選(S)-3-輕基丁醯基-CoA或(R)-3-羥基丁醯基-CoA,分別分類為E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羥基丁醯基CoA脫氬酶從一些來源獲得，例如丙酮丁醇梭菌(GenBankNOs:NP—349314(SEQIDNO:6),NC—003030),枯草桿菌(GenBankNOs:AAB09614,U29084)，營養產i鹹菌(Wa/Wo"/aew/ra//z")(GenBankNOs:ZP—0017144，NZ—AADYO1000001，營養產鹼菌(j/ca//ge"wewrop/m力(GenBankNOs:YP—294481，NC—007347)以及營養產鹼菌(Aew/rap/2w)(GenBankNOs:P14697,J04987)。術語"巴豆酸酶"指催化3-羥基丁醯基CoA轉化為巴豆醯基CoA和H20的酶。巴豆酸酶底物優選(S)-3-羥基丁醯基CoA或(R)-3-羥基丁醯基CoA,分別分類為E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶從一些來源獲得，例如大腸桿菌(Eco//)(GenBankNOs:NP—415911(SEQIDNO:8),NC—000913)，丙酮丁醇梭菌(C.ac"o6w/y//cwm)fGenBankNOs:NP—349318,NC一003030)，枯草桿菌(GenBankNOs:CAB13705，Z99113)和豚鼠氣單胞菌(Jerawo"osom'ae)(GenBankNOs:BAA21816,D88825)。術語"丁醯基CoA脫氫酶"也稱作反烯醯CoA還原酶，指催化巴豆醯基CoA轉化為丁醯基CoA的酶。丁醯基CoA脫氫酶可以是NADH-依賴性的或NADPH依賴性的，分別分類為E.C.1.3丄44和E.C.1.3丄38。丁醯基CoA脫氫酶從一些來源獲得，例如丙酮丁醇梭菌(GenBankNOs:NP—347102(SEQIDNO:10),NC—003030),薄肌眼蟲(五wg/e"agrad&)(GenBankNOs:Q5EU卯,AY741582),山地鏈黴菌(5^eptow_yc^co〃/wws)(GenBankNOs:AAA92890,U37135)以及天藍色鏈黴菌(5^e/tow_yc&scoeZ/co/or)(GenBankNOs:CAA22721,AL939127)。術語"丁醛脫氫酶"指催化丁醯CoA轉化為丁醛的酶，使用NADH或NADPH為輔助因子。丁醛脫氫酶優選NADH，已知為E.C.1.2.1.57，從例如拜季林斯基梭狀芽孢桿菌(C7os/nW/wm一"."c嗣(GenBankNOs:AAD31841(SEQIDNO:12),AF157306)和丙酮丁醇梭菌(GenBankNOs:NP—149325,NC—001988)獲得。術語"l-丁醇脫氫酶"指催化丁醛轉化為l-丁醇的酶。l-丁醇脫氫酶是醇脫氫酶廣闊家族的亞類。l-丁醇脫氫酶可以是NADH-或NADPH-依賴性的。l-丁醇脫氫酶從例如丙酮丁醇梭17菌(GenBankNOs:NP一149325，NC—001988;NP—349891(SEQIDNO:14)，NC—003030;和NP—349892(SEQIDNO:16),NC—003030)以及大腸桿菌(GenBankNOs:NP—417484,NCJ)00913)獲得。術語"乙醯乳酸合酶"也稱為"乙醯羥酸合酶"，指具有催化兩分子丙酮酸轉化為一分子a-乙醯乳酸的酶活性的多肽。乙醯乳酸合酶已知為EC2.2.1.6[以前為4丄3.18](五"2^me7Vome"c/art^7卯麼AcademicPress,SanDiego)，其活性可以是輔助因子焦磷酸疏胺素依賴性的。合適的乙醯乳酸合酶/人一些來源，例如枯草桿菌(GenBankNos:AAA22222NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)胺基酸序列，L04470NCBI核脊酸序列)，土生克雷伯菌C^/e&/e〃"^r/ge"a)(GenBankNos:AAA25055:L04507),以及肺炎克雷伯桿菌(GenBankNos:AAA25079(SEQIDNO:20)，M73842(SEQIDNO:19)獲得。術語"乙醯乳酸脫羧酶"是指具有催化a-乙醯乳酸轉化為3-羥基-2-丁酮的酶活性的多肽。乙醯乳酸脫#友酶已知為EC4.1.1.5,從例如枯草桿菌fGenBankNos:AAA22223,L04470),土生克雷伯菌fGenBankNos:AAA25054,L04507)和肺炎克雷伯桿菌〖SEQIDNO:18(胺基酸)SEQIDNO:17(核苦酸))獲得。術語"丁二醇脫氫酶"也被稱為"3-羥基-2-丁酮還原酶"是指具有催化3-羥基-2-丁酮轉化為2,3-丁二醇的酶活性的多肽。丁二醇脫氬酶是醇脫氬酶廣闊家族的亞類。丁二醇脫氬酶可特異性製備R-或S-立體化學的醇產品。孓特異性丁二醇脫氫酶已知為EC1.1.1.76，從例如肺炎克雷伯桿菌(GenBankNos:BBA13085(SEQIDNO:22),D86412獲得。/-特異性丁二醇脫氫酶已知為EC1.1.1.4，例如從蠟樣芽孢桿菌CS"c/〃M(GenBankNos.NP—830481,NC—004722;AAP07682,AE017000)和乳酸乳球菌(GenBankNos.AAK04995，AE006323)獲得。術語"丁二醇脫水酶"也稱為"二醇脫水酶"或"丙二醇脫18水酶"是指具有催化2,3-丁二醇轉化為2-丁酮，也稱為曱基乙基酮(MEK)的酶活性的多肽。丁二醇脫水酶可利用輔助因子腺苷鈷胺。腺苷鈷胺依賴性的酶已知為EC4.2丄28,例如從催產克雷伯桿菌(GenBankNos:BAA08099(oc亞單位)(SEQIDNO:24),BAA08100(卩亞單位)(SEQIDNO:26)，和BBA08101(y亞單位)(SEQIDNO:28)，(注意所有三種亞單位對活性都是必需的)，D45071)獲得。術語"2-丁醇脫氬酶"是指具有催化2-丁酮轉化為2-丁醇的酶活性的多肽。2-丁醇脫氬酶是醇脫氫酶廣闊家族的亞類。2-丁醇脫氫酶可以是NADH或NADPH依賴性的。NADH依賴性的酶被稱為ECl丄l.l，例如從赤紅球菌(GenBankNos:CAD36475(SEQIDNO:30),AJ491307(SEQIDNO:29))獲得。NADPH依賴性的酶已知為EC1.1.1.2,例如從激烈熱球菌CPyracoccw/wn'aw力(GenBankNos:AAC25556，AF013169)獲得。術語"乙醯羥酸異構還原酶"或"乙醯羥酸還原異構酶"指用NADPH(還原的煙醯胺腺噤呤二核苷酸磷酸)作為電子供體，催化乙醯乳酸轉換為2,3-二羥基異戊酸的酶。優選的乙醯羥酸異構還原酶已知為EC號1.L1.86,序列從各種大批的微生物，包括但不限於大腸桿菌(GenBankNos:NP_418222(SEQIDNO:32),NC—000913(SEQIDNO:31))，釀酒酵母(GenBankNos:NP—013459,NC—001144),海沼曱坑球菌(Me^z朋ococ面願一a/wcfa)(GenBankNos:CAF30210,BX957220)和枯草桿菌(GenBankNos:CAB14789,Z99118)獲得。術語"乙醯羥酸脫水酶"是指催化2,3-二羥基異戊酸轉化為oc-酮異戊酸的酶。優選的乙醯羥酸脫水酶已知為EC號4.2.1.9。這些酶從各種大批的微生物，包括但不限於大腸桿菌(GenBankNos:YP—026248(SEQIDNO:34),NC—000913(SEQIDNO:33))，釀酒酵母(GenBankNos:NP—012550,NC—001142)，海沼曱烷球菌(GenBankNos:CAF29874,BX957219)和枯草桿菌(GenBankNos:CAB14105,Z99115)獲得。術語"支鏈ot-酮酸脫羧酶"是指催化a-酮異戊酸轉化為異丁醛和C02的酶。優選的支鏈a-酮酸脫羧酶已知為EC號4.1.1.72,從一些來源包括但不限於乳酸乳球菌(GenBankNos:AAS49166,AY548760;CAG34226(SEQIDNO:36),AJ746364,鼠傷寒沙門氏菌0Sa/mowe〃a/>^/zz>wwn'ww)(GenBankNos:NP—461346,NC—003197)和丙酮丁醇4炎菌(GenBankNos:NPJ49189,NC—001988)獲得。術語"支鏈醇脫氫酶"是指催化異丁醛轉換為異丁醇的酶。優選的支鏈醇脫氫酶已知為EC號1丄1.265，但也可分類歸入其他醇脫氫酶(具體指EC1.1.1.1或1.1.1.2)。這些酶利用NADH(還原的煙醯胺腺。票呤二核苷酸)和/或NADPH作為電子供體，從一些來源包括但不限於釀酒酵母(GenBankNos:NP—010656,NC—001136;NP—014051,NC—001145),大腸桿菌(GenBankNos:NP一417484(SEQIDNO:38)，NC—000913(SEQIDNO:37))和丙酮丁醇梭菌(GenBankNos:NP—349892,NC—003030)獲得。術語"基因"是指能被表達為特定蛋白的核酸片段，任選包括編碼序列之前(5'-非編碼序列)及之後(3'-非編碼序列)的調控序列。"天然基因"是自然界中發現的具有自身調控序列的基因。"嵌合基因"是指非天然的任何基因，包含在自然界中沒有一起發現的調控和編碼序列。因此嵌合基因可包含不同來源的調控序列和編碼序列，或相同來源的但與自然界中發現的排列方式不同的調控序列和編碼序列。"內源性基因"是指有機體基因組中處於其自然位置的天然基因。"外源，，基因是指通常不會在宿主有機體中發現，但通過基因轉移引入宿主有機體的基因。外源基因可以包含插入到非天然有機體的天然基因或嵌合基因。"轉基因"是通過轉化過程已被引入到基因組的基因。20本文所用的術語"編碼序列"指編碼特定胺基酸序列的DNA序列。"適當的調控序列"指位於編碼序列上遊(5'-非編碼序列)、之中或下遊(3'-非編碼序列)的核苷酸序列，其影響轉錄、RNA加工或穩定性，或相關編碼序列的翻譯。調控序列可包括啟動子、翻譯前導序列、內含子、聚腺苦酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點和莖-環結構。術語"啟動子"是指能控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一^:而言，編碼序列位於啟動子序列的3'端。啟動子可全部來源於天然基因，或由來源於自然界中發現的不同啟動子的不同因子組成，甚至包含合成的DNA片段。本領域技術人員理解，不同啟動子可指導基因在不同組織或細胞類型中，或在不同發育階段，或針對不同的環境或生理條件的表達。使基因大多數時間在大多數細胞類型中表達的啟動子通常被稱為"組成型啟動子"。進一步認識到，由於大多數情況下調控序列的確切界限尚未完全確定，因此不同長度的DNA片段可能有相同的啟動子活性。術語"可操作地連接"指核酸序列結合到單個核酸片段上，這樣使其中一個的功能受其它的影響。例如，當啟動子能影響編碼序列的表達時(即編碼序列受啟動子的轉錄控制)，啟動子可操作地連接到編碼序列。編碼序列可正義或反義地可操作地連接到調控序列。本文所用的術語"表達"指來自本發明核酸片段的正義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定累積。表達也可指mRNA翻i奪成多肽。本文所用的術語"轉化"是指核酸片段轉移進入宿主有機體，使基因穩定遺傳。含有轉化核酸片段的宿主有機體被稱為"轉基因"或"重組的，，或"轉化的"有機體。術語"質粒"和"載體"是指通常攜帶非細胞中心代謝部分的基因的額外染色體元件，通常形式是環狀雙鏈DNA片段。這樣的元21件可以是來自任何來源的自主複製序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列，線性或環形，單或雙鏈DNA或RNA，其中一些核苷酸序列已加入或重組到了獨特的結構中，該結構能將選定基因產物的啟動子片段和DNA序列，以及合適的3'端非翻譯序列引入細胞。"轉化載體，，指含有外源基因，並具有除促進特定宿主細胞轉化的外源基因之外的元件的特定載體。本文使用的術語"密碼子簡併"是指允許核苷酸序列變化，且不影響編碼的多肽的胺基酸序列的遺傳密碼的性質。熟練的技術人員很清楚在使用核苷酸密碼子以指明特定胺基酸中，具體的宿主細胞表現出的"密碼子偏好"。因此，為改善宿主細胞中的表達而合成基因時，理想的是設計基因使其密碼子使用頻率與宿主細胞的優選密碼子使用頻率接近。術語"密碼子優化"當指對於不同宿主的轉化而言的核酸分子的基因或編碼區時，指的是核酸分子的基因或編碼區中密碼子的變化，從而反映宿主有機體的典型密碼子使用，並且不改變所述DNA編碼的多肽。這裡使用的標準重組體DNA和分子克隆技術在本領域是眾所周知的,在Sambrook,J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T"Mo/ecw/arC7麵'"g.'^丄a6orato^yMawwa/(分子克隆實驗指南),SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)(以下為"Maniatis");和Silhavy,T.J.,Bennan，M.L.andEnquist,L.W.,5!x/en,膨她w欣CeweF,'om1，ColdSpringHarborLaboratoryColdPressSpringHarbor,NY(1984);以及Ausubd,F.M.等，CwreWPratoco/s/"Mo/ecw/『S/o/ogy(分子生物學實驗指南)，出版商GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987)有描述。本文所用的術語"發明"或"本發明"指普遍適用於權利要求中描述的、出現的或之後修正或補充的，或說明書中的本發明所有實施方案。在一個實施方案中，本發明提供了分離丁醇耐受微生物的方法。如下面詳述的，該方法包括在生長條件下富集微生物聚生體，並使富集的聚生體與丁醇接觸。還提供了通過本發明的方法鑑別的，表現出對醇，特別是丁醇高耐受性的微生物。這些鑑別出的微生物對2-丁酮和乙醇耐受性也高。這些丁醇耐受微生物可以是基因工程得到，包含丁醇生物合成途徑或2-丁酮生物合成途徑，並可用於生物製備高含量的l-丁醇、2-丁醇、異丁醇或2-丁酮。丁醇耐受微生物的分離丁醇耐受微生物可從環境樣品如廢水汙泥和來自其它接觸丁醇或其它溶劑的環境樣品分離。例如環境樣品可從化工廠的廢水處理設施獲取。由於長期在存在不同有機溶劑的條件下生長，工業廢水生物反應器是特別好的具有理想耐受性表型的微生物環境樣品來源(Bramucci等，7>ewfe所o&c/7"o/.18:501-505(2000))。丁醇耐受微生物也可自其他微生物樣本分離。例如微生物樣本可以是純菌抹的化學突變微生物種群，含有多拷貝質粒庫的微生物菌抹，或某一特定菌林的轉座子標記的突變體群。包括混合種群的任意這些微生物樣本據說包括微生物聚生體。在本發明的一個實施方案中，微生物樣本是在含有過量生長營養的生長培養基中培養的，從而富集其中含有的微生物聚生體直至聚生體的成員生長。在一個實施方案中，培養物處於對數生長期。生長培養基包含可發酵碳源，並可以包括適當水平的氮、磷、硫和鹽。對於微生物聚生體生長必需的合適水平的這些營養對本領域技術人員是公知的，非限制性的例子如下。可發酵碳源可以是微生物聚生體成員很容易代謝的任何碳源，包括但不限於蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物。可發酵碳源也可以是羧酸，如23脂肪酸、丁酸或戊酸。通常情況下，碳源出現的濃度為約0.1%重量/體積w/v至約1.5%w/v。氮源可以是任何合適的氮源，包括但不限於銨鹽或酵母提取物。氮源通常在生長培養基中出現的濃度約為10mM。磷在培養基中以磷酸鹽形式存在，如鈉和鉀的磷酸鹽，通常在生長培養基中出現的濃度約為50mM。硫在培養基中以硫酸鹽的形式出現，如鈉或銨的硫酸鹽，通常在生長培養基中出現的濃度約為10mM。其它鹽包括但不限於氯化鎂、氯化鈣、氯化錳、氯化鐵、氯化亞鐵、氯化鋅、氯化銅、氯化鈷和鉬酸鈉。這些鹽通常在生長培養基中出現的濃度約為lpM到約2mM。生長培養基還可含有維生素，如鹽酸硫胺素。富集的培養物在溫度為約25。C至約60r下生長足夠時間，使樣本中的微生物聚生體的成員生長，通常約12小時至約24小時。培養物可在厭氧、微需氧或有氧條件，振蕩或不振蕩下生長。正如熟練技術人員容易理解的，厭氧條件是缺氧的條件，有氧條件是含氧的條件，微需氧條件是存在的氧水平低於空氣中水平的條件，即低於21%。培養物的生長可通過測量光密度監測，通常在波長600nm監測。生長富集的培養物隨後與丁醇接觸。此接觸可通過用含有丁醇的新鮮生長培養基稀釋富集培養物進行。如果此時富集的培養物處於對數生長期，則尤其適合。使用的丁醇濃度約為0.8%w/v至約3.0%w/v,優選約0.8%w/v至約2.0%w/v。在一個實施方案中，所述丁醇主要是l-丁醇。在另一實施方案中，所述丁醇主要是2-丁醇。在另一實施方案中，所述丁醇主要是異丁醇。此處使用的主要指以總丁醇重量計的至少約90%。此外可使用包含1-丁醇、2-丁醇和異丁醇的兩種或多種的各種組合的混合物。培養物生長了一段時間，直到觀察到明顯生長。任選地，表現出明顯生長的培養物可再一次或多次接觸丁醇，以篩選增加的丁醇耐受性。每次接觸可逐步提高丁醇濃度進行。隨後分離與丁醇接觸的微生物聚生體，以分離單個菌^k細胞分離的多種手段為本領域技術人員所知，涉及液體或固體培養基。例如與丁醇接觸的微生物聚生體可置於可能含有或不含有丁醇的固體培養基上，如營養瓊脂、LuriaBertani(LB)瓊脂、改良LB瓊脂(即補充了可發酵碳源和鹽的LB培養基)，或最小富集瓊脂培養基。如果固體培養基中有丁醇，其濃度一般是約1.2%w/v至約3%w/v。培養物生長直至菌落形成。然後用本領域已知的方法分離菌落，從而提供丁醇耐受的微生物。例如所述固體培養基的菌落可用本領域已知的方法收集並鑑定，如下所述。或者固體培養基的所述菌落可接種到液體或固體的不含丁醇的生長培養基(如最小富集培養基)。生長後可收集並鑑別所述細胞。任選地，菌落的細胞可在有丁醇的液體或固體培養基(如最小富集培養基)中生長。一般來說，培養基中丁醇濃度約1.2%w/v至約3%w/v。收集丁醇存在下生長的細胞。分離的微生物可用本領域已知的方法鑑別，如16S核糖體RNA(rRNA)基因測序，脂肪酸分布型分析或核糖分型。用本發明的方法分離的所述丁醇耐受^f鼓生物於37。C在固體培養基上生長時，耐受至少2.5%丁醇(即l-丁醇、2-丁醇或異丁醇)，或者37。C在液體培養基裡生長時，耐受至少2.0。/ow/v丁醇。應該指出的是，丁醇耐受微生物一般在固體培養基上比在液體培養基內生長得更旺盛。此外，丁醇耐受微生物依賴於生長溫度，通常在較低生長溫度下生長更旺盛。通過將富集的微生物聚生體與一種丁醇接觸而分離的微生物通常也耐受其他丁醇以及2-丁酮和乙醇。例如使用1-丁醇分離的微生物也耐受2-丁醇和異丁醇。使用本方法分離的菌林的耐受性，可通過測定在含有添加待測化學物質的液體培養基中生長的IC5Q值評估。ICso值是造成50%生長抑制的化學物質的濃度。如本文實施例1和第2所示，IC5025值1-丁醇為1.8%w/v，異丁醇為2.4°/。w/v,2-丁醇為3.1%w/v,2-丁酮為4.5%w/v,乙醇為5.9%w/v，是在篩選到的菌林中測定的。基於含有l-丁醇的固體培養基上所述菌林的生長，這些IC50值以及對l-丁醇和對每種其它待測化合物耐受性間的相關性，所確定的耐受菌株預計在含有2.7%w/v異丁醇，3.9w/v2-丁醇，5.0%w/v2-丁酮或9.0%w/v乙醇的固體培養基上生長。所述富集的培養物還可在恆化器生物反應器中連續培養生長並與丁醇接觸。通過適當調整稀釋率，恆化器生物反應器中的細胞可以以不同生長率生長。恆化器培養可精確控制通氣和pH值，從而得到更高的細胞密度。此外，可通過調節原料構成，逐步增加丁醇濃度。富集培養物和丁醇在生物反應器中接觸後，如上所述丁醇耐受的微生物被分離和鑑別。意想不到的是，本文實施例中使用本發明的方法鑑別的許多丁醇耐受微生物是屬於乳桿菌屬的細菌。乳桿菌細菌為兼性厭氧、革蘭氏陽性、不能運動的、杆狀細胞(5er取少》M朋wa/o/爭fem加'c^Sa"m'o/ogy,Vol2，Sneath等,Eds.;Williams&Wilkins,Baltimore,MD,1986,pp.1063-1065)。通過測定16SrRNA基因序列(SEQIDNOs:41,42，43和44),本文進一步表徵了丁醇耐受的乳桿菌菌抹，確定它們為植物乳桿菌和亞利桑那乳桿菌菌抹。可改變分離丁醇耐受^:生物的本方法，以選擇性分離丁醇耐受乳桿菌。例如可用使用乳酸細菌培養基如細菌乳酸菌(BactoLactobacilli)MRS瓊脂培養乳桿菌的標準方法從各種環境富集乳桿菌，然後篩選l-丁醇耐受的。分離的丁醇耐受乳桿菌菌林可以是基因工程得到的，包含編碼丁醇生物合成途徑或丁酮生物合成途徑的基因構建物，並在合適的條件下生長從而生成丁醇或丁酮。所述丁醇生物合成途徑可以是l-丁醇、2-丁醇或異丁醇生物合成途徑。1-丁醇生物合成途徑製備1-丁醇的生物合成途徑由Donaldson等在同時待審並共同擁有的美國專利申請No.11/527995中描述，此申請在此引作參考。此生物合成途徑包含以下底物向產物的轉化a)乙醯CoA向乙醯乙醯CoA轉化，例如通過作為SEQIDNO:l或3給出的基因編碼的乙醯CoA乙醯轉移酶催化；b)乙醯乙醯CoA轉化為3-羥基丁醯CoA,例如通過作為SEQIDNO:5給出的基因編碼的3-羥基丁醯CoA脫氫酶催化；c)3-羥基丁醯CoA轉化為巴豆醯基CoA，例如通過作為SEQIDNO:7給出的基因編碼的巴豆酸^f崔化；d)巴豆醯基CoA轉化為丁醯CoA,例如通過作為SEQIDNO:9給出的基因編碼的丁醯基-CoA脫氫酶催化；e)丁醯CoA轉化為丁醛，例如通過作為SEQIDNO:ll給出的基因編碼的丁醛脫氬酶催化；以及f)丁醛轉化為l-丁醇，例如通過作為SEQIDNO:13或15給出的基因編碼的1-丁醇脫氫酶催化。所述途徑不需要ATP,並生成NAD+和/或NADP+，因此與產生乙醯-CoA的中心代謝途徑相平衡。2-丁醇和2-丁酮生物合成途徑生成2-丁醇和2-丁酮的生物合成途徑由Donaldson等人，在同時待審並共同擁有的美國專利申請Nos.11/741892和11/741916中描述，所述申請在此引作參考。一個2-丁醇生物合成途徑包含以下底物向產物的轉化a)丙酮酸轉化為a-乙醯乳酸，例如通過作為SEQIDNO:19給出的基因編碼的乙醯乳酸合酶催化；b)a-乙醯乳酸轉化為3-羥基-2-丁酮，例如通過作為SEQIDNO:17給出的基因編碼的乙醯乳酸脫羧酶催化；27c)3-羥基-2-丁酮轉化為2,3-丁二醇，例如通過作為SEQIDNO:21給出的基因編碼的丁二醇脫氫酶催化；d)2,3-丁二醇轉化為2-丁酮，例如通過作為SEQIDNOs:23、25和27給出的基因編碼的丁二醇脫水酶催化；以及e)2-丁酮轉化為2-丁醇，例如通過作為SEQIDNO:29給出的基因編碼的2-丁醇脫氫酶催化。省略上述途徑的最後一步(e)提供了製備2-丁酮，也稱為曱乙酮(MEK)的生物合成路徑。異丁醇生物合成途徑生成異丁醇的生物合成途徑由Maggio-Hall等人，在同時待審並共同擁有的美國專利申請No.11/586315中描述，所述申請在此引作參考。一個異丁醇生物合成途徑包含以下底物向產物的轉化a)丙酮酸轉化為乙醯乳酸，例如通過作為SEQIDNO:19給出的基因編碼的乙醯乳酸合酶催化；b)乙醯乳酸轉化為2,3-二羥基異戊酸，例如通過作為SEQIDNO:31給出的基因編碼的乙醯羥酸異構還原i^f崔化；c)2,3-二羥基異戊酸轉化為a-酮異戊酸，例如通過作為SEQIDNO:33給出的基因編碼的乙醯羥酸脫水酶催化；d)a-酮異戊酸轉化為異丁醛，例如通過作為SEQIDNO:35給出的基因編碼的支鏈酮酸脫羧酶催化；以及e)異丁醛轉化為異丁醇，例如通過作為SEQIDNO:37給出的基因編碼的支鏈醇脫氫^f崔化。生成丁醇或丁酮的乳桿菌宿主的構建含有編碼將可發酵碳源底物轉化為丁醇或丁酮的酶促途徑之一的酶的必需基因的重組體丁醇耐受乳桿菌菌4朱，可用本領域已知的技術構建。植物乳桿菌(丄.p/a"toraw)、唾液乳桿菌(丄.^"van'w》、清酒乳桿菌(丄sa&0、約氏乳桿菌(丄yo/7raom7)、嗜酸乳桿菌(丄.a"Wop/H7w力和德氏乳桿菌(丄.6fe/Z^wech7)的基因組序列是已知的(NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)資料庫)，genbankTM鑑定如下植物乳桿菌WCFS1，全部基因組gi|28376974|ref]NC—004567.1|[28376974]唾液乳桿菌唾液亞種(Lactobacillussalivariussubsp.Salivarius)UCC118,全部基因組gi|90960990|reflNC—007929.11[90960990]清酒乳桿菌菌林23K全部基因組gi|78609255|emb|CR936503.1|[78609255]約氏乳桿菌NCC533，全部基因組gi|42518084|ref]NC—005362.11[42518084]嗜酸乳桿菌NCFM，全部基因組gi|58336354|reflNC—006814.1|[58336354;|德氏乳桿菌保力口利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)ATCC11842,全部基因組gi|104773257|reflNC—008054.11[104773257]這些細菌的G+C含量範圍為32%到49%。在本發明中，編碼上述丁醇或丁酮生物合成途徑之一的酶的基因可從不同來源分離(見上文)。從細菌基因組得到所需基因的方法在分子生物學領域是常見和熟知的。例如如果所述基因的序列是已知的，可用標準引物引導擴增法如聚合酶鏈反應(美國專利號No.4,683,202)設計引物並擴增所需序列，以得到適合克隆到轉化載體內的量的DNA。如果要分離與已知序列異源的基因，則可通過限制性內切酶消化創建合適的基因組庫，並用具有與所需基因序列互補序列的探針進行篩選。一旦序列被分離，所29述DNA可用標準引物引導擴增法如聚合酶鏈式反應(美國專利No.4,683,202)擴增，以獲得適合克隆到表達載體的量的DNA，隨後所述DNA被轉化入適當的宿主細胞中。此外，考慮到具有理想酶活性的蛋白的胺基酸序列，編碼序列可通過所述蛋白序列的反向翻譯確定。含有編碼序列的DNA片段可合成製備，並克隆到表達載體中，然後轉化到所需宿主細胞中。在製備含有編碼序列的合成的DNA片段中，為了在靶宿主細胞中表達，可優化該序列。為在異源宿主中表達所進行的密碼子優化工具很容易獲得。一旦有關途徑的基因被確認和分離，它們可能會通過本領域眾所周知的方法插入載體並轉化到丁醇耐受乳桿菌宿主中。用於乳桿菌轉化的載體是已知的(見下文)。通常載體或盒包含引導插入的DNA序列、可選擇標記和允許自主複製或染色體整合的序列的轉錄和翻譯的序列。合適的載體包括含有轉錄起始控制的插入DNA片段的5'區，以及控制轉錄終止的DNA片段的3，區。雖然可以理解這樣的控制區也可來自非源於特定製備宿主的基因，但兩種控制區可以來自與被轉化的宿主細胞同源的基因。用於驅動在所需乳桿菌宿主細胞中表達相關途徑編碼區的起始控制區或啟動子，可從其他乳酸菌或其他革蘭氏陽性有機體獲得。非限制性的例子是來自乳球菌(丄actococcw力的"/sA啟動子。終止控制區也可來自源於優選宿主或相關細菌的不同基因。任選地，終止位點可以是非必要的，但是如果包括在內，則它是最優的。乳桿菌屬屬於乳(酸)桿菌族0^"0&"7/"/&5)家族，枯草桿菌和鏈球菌CSrr甲tococcw)轉化中使用的許多質粒和載體可用於乳杆183:175-182(1996);和O，Sullivan等，137:227-231(1993));p扁Bl和pHW800，pMBBl衍生物(Wyckoff等j/p/.五"Wra".M/craWo/.62:1481-1486(1996));pMGl，接合質粒(Tanimoto等，/萬acfen.。/,184:5800-5804(2002));pNZ9520(Kleerebezem等，jpp/.M/cro&o/.63:4581-4584(1997));pAM401(Fujimoto等，^pp/.￡謂>。".M/cto6/o/.67:1262-1267(2001》；以及pAT392(Arthur等，爿""Vw.cra6.C/^woAm38:1899-1903(1994))。來自植物乳桿菌的一些質粒也已有淨艮道(vanKranenburgR,GolicN,BongersR,LeerRJ,deVosWM,SiezenRJ，KleerebezemM.五謂'raw.M/cto6/o/.2005Mar;71(3):1223-1230),可用於轉化。丁醇或丁酮生物合成路徑的各種基因可組裝成任何合適的載體，如上述那些。可優化所述密碼子，以在從宿主菌抹如植物乳桿菌或亞利桑那乳桿菌的基因組序列推導出的密碼子索引(index)的基礎上進行表達。質粒可用本領域已知的方法引入宿主細胞，如電穿孔，在任何一篇的下列參考文獻中有描述Cruz-Rodz等(Mo/ecw/arGew幼'csG^w蘭z'cs224:1252-154(1990)),BringelandHubert(^;/.M/craZ)/o/.33:664-670(1990)),以及TeresaAlegre,RodriguezandMesas(F五MSM/cra6/o/ogy/e"era241:73-77(2004))。質粒也可以通過接合引入植物乳桿菌(Shrago,ChassyandDobrogosz如/.五謂.raw.M'cra.52:574-576(1986))。丁醇或丁酮生物合成途徑基因也可使用整合載體整合到乳桿菌染色體中(Hols等五"v/ra".M/cra.60:1401-1403(1990);Jang等M/cra.Z飢24:191-195(2003》。發酵培養基生產丁醇或丁酮的發酵培養基必須含有合適的碳底物。合適的底物可以包括但不限於單糖如葡萄糖和果糖，低聚糖如乳糖或蔗糖，多糖如澱粉或纖維素或其混合物，以及來自可再生原料的31未純化混合物如乾酪乳清透析液(cheesewheypermeate)、玉米漿、甜菜糖蜜、大麥芽。蔗糖可從如甘蔗、甜菜、木薯以及甜高粱的原料獲得。葡萄糖和葡萄糖可以通過包括穀類如玉米、小麥、黑麥、大麥和燕麥的基於澱粉的原料的糖化獲得。此外，發酵糖類可通過預處理和糖化過程從纖維素質和木質纖維生物質獲得，如同例如在共同擁有並同時待審的美國專利申請US20070031918A1中描述的，此專利申請在此引作參考。生物質指任何纖維素質或木質纖維材料，包括包含纖維素，及任選進一步包含半纖維素、木質素、澱粉、低聚糖和/或單糖的物質。生物質還可包含其他成分如蛋白質和/或脂質。生物質可來自單一來源，或生物質可包含超過一個來源的混合物，例如生物質可包含玉米棒和玉米秸稈的混合物，或青草和樹葉的混合物。生物質包括但不限於生物能源作物、農業剩餘物、城市固體廢物、工業固體廢物、造紙的汙泥、庭院廢物，木材和林業廢料。生物質的例子包括但不限於玉米粒、玉米棒、作物剩餘物，如玉米殼、玉米秸稈、草、小麥、小麥秸稈、大麥、大麥秸稈、乾草、稻草、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、大豆、穀物碾磨得到的成分、樹木、樹枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木、蔬菜、水果、花卉和動物糞肥。儘管設想所有上述碳底物及其混合物在本發明中是合適的，但優選的碳底物為葡萄糖、果糖和蔗糖。除了適當的碳源，發酵培養基必須含有本領域技術人員已知的合適的礦物質、鹽類、輔助因子、緩衝液和其他組分，這些物質適合培養物的生長，並促進位備丁醇或丁酮必需的酶促途徑。培養條件通常細胞在合適培養基中生長的溫度範圍約25。C至約40。C。本發明的合適生長培養基是普通的商業製備培養基，如細菌乳酸菌MRS肉湯或瓊脂(Difco)，LuriaBertani(LB)肉湯，沙氏葡萄糖(SD)肉湯或酵母培養基(YM)肉湯。也可使用其他界定的或合成的生長培養基，特定微生物生長的適當培養基對微生物和發酵科學領域的技術人員來說是已知的。使用已知直接或間接調節降解物阻遏的物質，如環腺苷2':3'-單磷酸，也可納入發酵培養基中。發酵的合適pH值範圍為pH5.0至pH9.0,pH6.0至pH8.0優選作為初始條件。發酵可在有氧或無氧條件下進行，優選厭氧或微需氧條件。工業分批和連續發酵丁酮或丁醇可使用分批發酵方法製備。典型分批發酵是封閉的系統，培養基組成在發酵開始時設定，發酵過程中不受人為變更。標準分批發酵系統的變化是補料系統。本發明中補料分批發酵過程也是適合的並包含典型分批系統，只不過底物是隨著發酵的進行遞增添加的。當降解物阻遏有抑制細胞代謝的傾向時，補料分批系統是有用的，理想的是培養基中有有限量的底物。分批和補料分批發酵在本領域是常見並眾所周知的，例子可見所o&c/wo/ogy中ThomasD.Brock:j7fexAooA:o//"(i組ha/Afz'craWo/ogy(工業微生物手冊)，SecondEdition(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA.,orDeshpande,MukundV.，^p/.36:227,(1992)，其在此引入參考。丁醇或丁酮也可利用連續發酵法製備。連續發酵是開放的系統，向生物反應器中連續加入確定的發酵培養基，加工時同時去除等量條件培養基。連續發酵普遍保持恆定高密度的培養物，細胞主要處於對數生長期。連續發酵允許調節影響細胞生長或終產物濃度的一個因素或任何數目的因素。調節營養物和生長因子以進行連續發酵處理的方法，以及最大化產物形成率的技術在工業33微生物學領域是眾所周知的，各種方法的詳見Brock，同上。設想丁醇或丁酮的製備可以使用分批、補料分批或連續處理進行，任何已知模式的發酵都是合適的。此外，設想細胞可固定在底物上作為整體細胞催化劑，並經受丁醇或丁酮製備的發酵條件。丁醇和2-丁酮乂人發酵培養基分離的方法對於ABE發酵生物製備的丁醇可以用本領域已知的方法從發酵；咅養基分離(參見例^口Durre,jpp/.A/z'croWo/.S/otec/z"o/.49:639-648(1998)，Groot等，27:61-75(1992)在此作為參考)。例如固體可通過離心、過濾、傾析等等從發酵培養基除去。然後丁醇可使用例如蒸餾、共沸蒸餾、液液萃取、吸附、氣提、膜蒸發或滲透蒸發的方法從發酵培養基分離。這些相同的方法可適於從發酵培養基分離生物製備的2-丁酮。實施例本發明在下列實施例中進一步明確。應該理解的是，這些實施例，同時指出優選實施方案，僅通過例證方式給出。從上述討論和這些例子，本領域技術人員可確定此發明的基本特徵，並且不偏離其精神和範圍可作出本發明的各種變化和修改，以適應各種用途和條件。使用的縮略語意義如下"min"指分鐘，"h，，指小時，"sec，指秒，'VL"指微升，"mL"指毫升，"L"指升，"nm"指納米，"mm"指毫米，"cm"指釐米，'Vm"指微米，"mM，，指微摩爾，"M"指摩爾，"mmol"指毫摩爾，")imole"指微摩爾，"g"指克，"iag"指微克，"mg"指毫克，"rpm"指每分鐘轉數，"w/v"指重量/體積，"OD"指光密度，"OD6oo"指600nm處測得的光密度，"00595"指595nm處測得的光密度；"ICso"指導致50%生長抑制的丁醇濃度，"GCMS"指氣相色語-質譜，以及"HPLC"指高效液相色譜。通法實施例中使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域眾所周知的,由Sambrook，J.,Fritsch，E.F.andManiatis,T.,A/o/ecw/arC7ow/"gv爿丄a6orato^yAfowwa/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"1989，T.J.Silhavy，M.L.Ben醒，andL.W.Enquist,五x/m'膨"tow"/zGeweF脂'o叫ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y"1984，以及Ausubel,F.M.等，CWrewf屍ratoco/sMo/ecw/arGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,N.Y"1987描述。適合於細菌培養物的保持和生長的材料和方法也是本領域眾所周知的。適用於下列實施例的技術可見Afo"wa/o/Ma/zo&/orGe"era/5acfen'o/ogy'PhillippGerhardt，R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.KriegandG.BriggsPhillips,eds.，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.,1994,或ThomasD.Brockin說'ofec/z"o/ogy:7fex;/6ooA:o//"i/w血'a/M/craWo/ogv，SecondEdition,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA,1989。所有用於細菌細胞生長和保持的物質、P艮制性內切酶和材料/人AldrichChemicals(Milwaukee，WI)，BDDiagnosticSystems(Sparks,MD)，LifeTechnologies(Rockville,MD)，或SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)獲得，除非另有說明。實施例1採用連續培養的丁醇耐受菌株的分離這些實施例的目的是分離丁醇耐受菌抹。環境樣品取自幾個流出液處理場所，l-丁醇存在下在恆化器生物反應器中連續培養。幾種1-丁醇耐受菌抹被分離，並鑑定為植物乳桿菌或亞利桑那乳桿菌。Appilikon發酵罐(Fermentor)(AppilikonInc.,Clinton,NJ)(AppilikonInc.,Clinton,NJ)作為厭氧恆化器進行操作。該生物反應器系統由1-L碟底(dishedbottom)反應器，控制器(Controller)ADI1032P100,以及帶有船推進渦輪攪拌槳的攪拌器單位組成。帶有適當傳感器的生物控制器(BioController)ADI1030Z510300020監控pH值、溶解氧和溫度。ColeParmer泵和泵頭(ColeParmerInstrumentCo.,VernonHills,IL)用於添力口酸石烕，<吏pH值為維持在7.0。用循環水浴使溫度保持在37°C。培養基(S20培養基)由5mM磷酸鉀緩衝液，pH值7.0、10mM硫酸銨、0.1%酵母提取物、0.1%酪蛋白水解物、100mMMOPS、2mMMgCl2、0.7mMCaCl2、0.05mMMnCl2、0.001mMZnCl2、0.002mM鹽酸硫胺素、1.72CuCl2、2.53|uMCoCl2、2.42|uMNa2Mo04、25mM葡萄糖、12.5mM蔗糖、12.5mM果糖組成。生物反應器中用體積500毫升的此培養基。該生物反應器操作給料速率範圍為0.1至1.0mL/分鐘，攪拌速度為50rpm。生物反應器用/人E.I.duPontdeNemoursandCompany幾處4立置的不同廢水處理設施獲取的一些廢水汙泥樣本混合物接種。短期分批模式操作後，生物反應器操作在連續給料模式下操作，逐漸加入濃度增加的1-丁醇至培養物培養基中。培養基流速範圍為0.1至1.0ml/min。生物反應器中的細胞密度通過測量600nm處的光密度進行監測。原料和流出液中的l-丁醇用帶有5973MassDetector(AgilentTechnologies,Inc，Wilmington,DE)的HP6890GasChromatograph通過GCMS測定。GC柱為DB-WAX,30mx0.32mmIDx0.25柱(J&WScientific,Inc.,Folsom，CA)。或者過濾(AcrodiscCRPTFE0.2濾器)樣本，用帶有ShodexSH-G保護柱的Shodex36SHIOil柱(8mmIDx300mm長度；ShokoAmericaInc.,ColoradoSprings,CO),通過HPLC分析。流動相為O.OIN硫酸。柱溫50。C,使用的流速0.5mL/min。為檢測，所用光度檢測器i殳為210nm，並使用折光率4企測器。樣品注射體積為10pL。初始調整階段後，通過原料進入生物反應器的l-丁醇的量逐漸增加至2.5%w/v。此同一期間內，監測生物反應器流出液中葡萄糖的量。原料中增加l-丁醇的量導致細胞密度降低，並伴隨葡萄糖利用減少。適應更高水平的l-丁醇後，連續培育使細胞密度和葡萄糖利用率再次提高。例如1-丁醇增加至1.6%導致細胞密度下降到少於1.5OD6Q,葡萄糖利用相應降低。然而連續培育〗吏細胞密度增加至2.3OD6Q,葡萄糖消耗相應增加。從此生物反應器分離1-丁醇耐受純菌株如下進行。來自生物反應器廢品罐(wasterjug)的細胞樣品被連續稀釋，系列稀釋液置於無l-丁醇的胰酶大豆瓊脂上(Difco;BektonDickinsonandCompany;SanJose,CA)。然後菌落從瓊脂培養基4妄種到正方形孔孩t量滴定才反(BeckmanCoulterInc，Fullerton,CA;CatalogNo.069681)孔內1.2ml無1-丁醇的S20培養基中。所述正方形微滴定4反用津佔鬥生；f隻蓋4勿(adhesivecover)(BeckmanCoulterInc.;CatalogNo.538619)密封，37°C振動培育直至72小時。將每個正方形孔的200uL培養物分配到"U形底"微滴定板(VWRScientificProducts,WestChester,PA;CatalogNo.62409-052)的相應孔內，用所述正方形孩i量滴定板製成主板。用Nunc-TSP可轉移固相篩選系統(Nunc-TSPtransferablesolidphasescreeningsystem)(NalgeneNuncInternational,Napersville,IL;CatalogNo.445497)，從主板得到的分離物複製鋪板到含有1.2%至3.4%l-丁醇的S20瓊脂或TSA瓊脂板上。耐受性分離物37°C生長24至72小時後鑑別。在含有3%l-丁醇的瓊脂培養基上生長的幾種分離物進一步得以表徵。分離菌抹的ICso值如下在37。C測定。在沒有(對照)和有各種量l-丁醇的條件下，分離物37。C下培養在S30L培養基中(即10mM硫酸銨、pH7.0的5mM磷酸鉀緩衝液、pH7.0的50mMMOPS、2mMMgCl2、0.7mMCaCl2、50jaMMnCl2、1|LiMFeCl3、1ZnCl2、1.72CuCl2、2.53岸CoCl2、2.42Na2Mo04、2鹽酸硫胺、0.01M葡萄糖和0.2%酵母提取物)，每種培養物的倍增時間從生長曲線的對數部分計算(倍增時間=0.693/生長率)。樣品瓶中1-丁醇導致的生長抑制百分比/人100%減去生長百分比([對照瓶的倍增時間/樣品瓶的倍增時間]X100)而測定。IC5。是造成50%生長抑制的丁醇濃度，通過丁醇濃度對抑制百分比作圖測定。結果總結於表4。分離物通過測定/人每種分離物提取的DNA中16SrRNA基因的聚合酶鏈式反應(PCR)得到產物的序列而鑑別。DNA從每種1-丁醇耐受菌抹提取。每種分離物用使用商業試劑盒(UltracleanMicrobialGenomicDNAIsolationKit,來自MoBioLaboratories,Inc,Carlsbad,CA，PartNo.12224-50)處理。分離物的16SrRNA基因通過4吏用HotStarTaq(Qiagen，Valencia,CA;CatalogNo.203446)和作為SEQIDNO:39給出的引物JCR14(ACGGGCGGTGTGTAC)以及作為SEQIDNO:40給出的JCR15(GCCAGCAGCCGCGGTA)的PCR進行擴增。PCR條件為95°C15分鐘；然後30個循環的94°C45秒，55。C1分鐘，72。Cl分鐘；然後72。C10分鐘。PCR產物純化並測序。每個序列用作查詢序列，進行GenBank的BLAST搜索，以確定最近似的先前鑑別的16SrRNA基因序列。作為丁醇耐受所選定的三種菌抹確定為植物乳桿菌，一種菌抹確定為亞利桑那乳桿菌(見表4)。表4從環境樣品分離的丁醇耐受菌衝朱tableseeoriginaldocumentpage39實施例2l-丁醇耐受的乳桿菌對其它化合物的耐受性本實施例的目的是測試基於l-丁醇耐受性分離的乳桿菌菌抹對另外的化合物2-丁醇、異丁醇、2-丁酮和乙醇的耐受性。如同實施例1中關於1-丁醇的描述，測量了這些化合物對選定的1-丁醇耐受植物乳桿菌PN0512菌株的ICso值。結果總結在表5中。基於測得的每種化合物的ICso值，以及對1-丁醇耐受性和對每種其它測試化合物耐受性間的相關性，預期經鑑定的耐受性菌抹在含有3.9。/。w/v2-丁醇、2.7。/ow/v異丁醇、5.0。/ow/v2-丁酮或9.0%w/v乙醇的固體培養基上生長。表5PN0512對2-丁醇、異丁醇和2-丁酮的耐受性tableseeoriginaldocumentpage39權利要求1.分離丁醇耐受的微生物的方法，其包含a)提供包含微生物聚生體的微生物樣品；b)使所述微生物聚生體與包含可發酵碳源的生長培養基接觸，直至所述微生物聚生體的成員生長；c)使步驟(b)的所述生長的微生物聚生體與丁醇接觸；以及d)分離步驟(c)的能存活成員，其中丁醇耐受的微生物被分離。2.根據權利要求1的方法，其中步驟(b)的生長聚生體處於對數生長期。3.根據權利要求1的方法，其中步驟(c)後所述聚生體置於固體培養基上。4.根據權利要求3的方法，其中所述固體培養基含有丁醇。5.根據權利要求1的方法，其中步驟(c)所述的接觸重複一次或多次。6.根據權利要求1的方法，其中所述接觸步驟(c)的所述丁醇濃度為約0.8%w/v至約3.0%w/v。7.根據權利要求1的方法，其中步驟(d)的所述分離包含步驟i)使步驟(d)的可存活成員在無丁醇存在的液體培養基內生長；從而使所述可存活成員繁殖；ii)使步驟(i)的所述細胞在丁醇存在下生長；以及iii)收集丁醇存在下生長的步驟(i)的所述細胞，其中所述丁醇耐受的微生物被分離。8.根據權利要求1的方法，其中所述可發酵碳源選自蔗糖、果糖、葡萄糖、丁酸、戊酸及其混合物。9.根據權利要求l的方法，其中所述丁醇主要是l-丁醇。10.根據權利要求1的方法，其中所述丁醇主要是2-丁醇。11.根據權利要求1的方法，其中所述丁醇主要是異丁醇。12.根據權利要求1的方法，其中所述聚生體是在厭氧條件下生長。13.根據權利要求1的方法，其中所述聚生體是在微需氧條件下生長。14.根據權利要求1的方法，其中所述聚生體是在需氧條件下生長。15.根據權利要求1的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少2.5。/。w/v的l-丁醇。16.根據權利要求1的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少3.9。/。w/v的2-丁醇。17.根據權利要求1的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少2.7。/。w/v異丁醇。18.根據權利要求1的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少5.0%w/v的2-丁酮。19.根據權利要求1的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少9.0%w/v的乙醇。20.根據權利要求1的方法，其中所述微生物樣品是環境樣口P。21.根據權利要求1的方法，其中所述丁醇耐受的微生物是乳桿菌。22.丁醇耐受微生物，其通過權利要求1所述的方法分離。23.根據權利要求22的丁醇耐受微生物，其中所述微生物是乳桿菌屬的細菌。24.分離丁醇耐受的乳桿菌的方法，其包含a)提供包含微生物聚生體的微生物樣品；b)在含有可發酵碳源的培養基中，富集存在乳桿菌的所述微生物聚生體，以生成乳桿菌富集培養物，其中所述乳桿菌富集培養物的成員正在生長；c)使步驟(b)所述的生長的乳桿菌富集培養物與丁醇接觸；以及d)分離步驟(c)的可存活成員，其中丁醇耐受的乳桿菌被分離。25.根據權利要求24的方法，其中步驟(c)的所述生長的乳桿菌處於對數生長期。26.根據權利要求24的方法，其中所述微生物樣品是環境樣口Po27.根據權利要求24的方法，其中步驟(c)後所述聚生體的所述成員置於固體培養基上。28.根據權利要求27的方法，其中所述固體培養基含有丁醇。29.根據權利要求28的方法，其中所述固體培養基是含有丁醇的乳酸細菌培養基。30.根據權利要求24的方法，其中步驟(c)所述的接觸重複一次或多次。31.根據權利要求24的方法，其中步驟(c)所述的接觸是用濃度為約0.8。/。w/v至約3.0%w/v間的所述丁醇進行的。32.根據權利要求24的方法，其中步驟(d)的所述分離包含步驟i)使步驟(d)的所述可存活成員在無丁醇的液體培養基中生長，從而使所述可存活成員繁殖；ii)使步驟(i)的所述細胞在丁醇存在下生長；以及iii)收集丁醇存在下生長的步驟(ii)的所述細胞，其中丁醇耐受微生物被分離。33.根據權利要求24的方法，其中所述可發酵碳源選自蔗糖、果糖、葡萄糖、丁酸、戊酸，及其混合物。34.根據權利要求24的方法，其中所述丁醇主要是l-丁醇。35.根據權利要求24的方法，其中所述丁醇主要是2-丁醇。36.根據權利要求24的方法，其中所述丁醇主要是異丁醇。37.根據權利要求24的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少2.5。/。w/v的l-丁醇。38.根據權利要求24的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少3.9%w/v的2-丁醇。39.根據權利要求24的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少2.7。/。w/v的異丁醇。40.根據權利要求24的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少5.0。/。w/v的2-丁酮。41.根據權利要求24的方法，其中步驟(d)的所述可存活成員37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少9.0。/。w/v的乙醇。42.丁醇耐受的乳桿菌，其通過權利要求24所述的方法分離。43.權利要求42的丁醇耐受乳桿菌，其在固體培養基上生長時耐受至少2.5%w/v的丁醇。44.根據權利要求42的丁醇耐受乳桿菌，其中所述乳桿菌具有以下特性i)是無芽孢形成的兼性厭氧菌；以及ii)是革蘭氏陽性；以及iii)是不能運動的；以及iv)具有杆狀細胞形態學；以及v)包含選自SEQIDN0:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43和SEQIDNO:44的16SrRNA基因序列。45.丁醇耐受乳桿菌，其具有下列特性i)是無芽孢形成的兼性厭氧菌；以及ii)是革蘭氏陽性；以及iii)是不能運動的；以及iv)具有杆狀細胞形態學；以及v)在固體培養基上生長時，耐受至少2.5。/ow/v的丁醇。46.根據權利要求45的丁醇耐受乳桿菌，其包含選自SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43和SEQIDNO:44的16SrRNA基因序列。47.丁醇耐受乳桿菌，其選自ATCCPTA-8318(植物乳桿菌PN0510)、ATCCPTA-8320(植物乳桿菌PN05U)、ATCCPTA-7727(植物乳桿菌PN0512)和ATCCPTA-8319(亞利桑那乳桿菌PN0514)。48.製備丁醇的方法，其包含a)提供包含編碼丁醇生物合成途徑的基因構建物的乳桿菌，其具有以下特性i)無芽孢形成的兼性厭氧菌；以及ii)革蘭氏陽性；以及iii)不能運動的；以及iv)杆狀細胞形態學；以及v)37。C下在固體培養基上生長時，耐受至少2.5%w/v的丁醇，以及b)使步驟(a)的乳桿菌在可產生丁醇的條件下生長。49.製備丁醇的方法，其包含a)提供通過權利要求24所述的方法分離的乳桿菌，其包含編碼丁醇生物合成途徑的基因構建物；以及b)使步驟(a)的乳桿菌在可產生丁醇的條件下生長。50.根據權利要求48或49的方法，其中所述丁醇主要是1-丁醇。51.根據權利要求48或49的方法，其中所述丁醇主要是2-丁醇。52.根據權利要求48或49的方法，其中所述丁醇主要是異丁醇。53.根據權利要求48或49的方法，其中所述乳桿菌選自ATCCPTA-8318(植物乳桿菌PN0510)、ATCCPTA-8320(植物乳桿菌PN0511)、ATCCPTA-7727(植物乳桿菌PN0512)和ATCCPTA-8319(亞利桑那乳桿菌PN0514)。54.丁醇耐受的乳桿菌，其用於丁醇的製備。55.2-丁酮耐受的乳桿菌，其用於2-丁酮的製備。56.製備2-丁酮的方法，其包含a)提供包含編碼2-丁酮生物合成途徑的基因構建物的乳桿菌，其具有以下特性i)是無芽孢形成的兼性厭氧菌；以及ii)是革蘭氏陽性；以及iii)是不能運動的；以及iv)具有杆狀細胞形態學；以及v)在固體培養基上生長時，耐受至少5.0%w/v的2-丁酮，以及b)使步驟(a)的乳桿菌在可產生2-丁酮的條件下生長。57.製備2-丁酮的方法，其包含a)提供通過權利要求24的方法分離的乳桿菌，其包含編碼2-丁酮生物合成途徑的基因構建物；以及b)使步驟(a)的乳桿菌在可產生厶丁酮的條件下生長。全文摘要丁醇耐受性增強的乳桿菌細菌已被分離。所述細菌用於丁醇的發酵製備。還提供了分離丁醇耐受乳桿菌的新方法。文檔編號C12N1/20GK101473027SQ200780022430公開日2009年7月1日申請日期2007年6月13日優先權日2006年6月15日發明者M·G·布拉穆奇,M·辛格,N·塞德科瓦,V·納加拉延申請人:納幕爾杜邦公司