穩定的二核苷酸類組合物和方法

2023-05-10 06:39:46

專利名稱:穩定的二核苷酸類組合物和方法
概括地說，本發明涉及穩定輔酶類的方法和組合物，特別是涉及穩定在溶液中的NADH(煙醯胺腺嘌呤二核苷酸)的方法和組合物。
生化反應幾乎普遍地都是通過酶來催化的，每種酶都是一種蛋白質，該蛋白質在底物中能引發高度特異的化學變化。
對許多種類的酶而言，為了發揮其功能，需要有稱為輔酶的一類低分子量分子參加催化。一般說來，輔酶的化學變化能均衡底物的化學變化，底物的變化是一個反應所期望的結果，例如，輔酶可以從底物中接受氫離子或向底物給出氫離子。
一些臨床診斷化驗包括氧化還原反應，在這些診斷反應中都是起輔酶作用的二核苷酸的那些氧化-還原反應，這些二核苷酸包括煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸2′磷酸(NADP)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。
二核苷酸是單核苷酸通過磷酸酯電橋連接起來的，單核苷酸是含氮鹼和醣的一種磷酸酯，在NAD和NADP中，第一單核苷酸是由鹼腺嘌呤和醣核糖而生成的核苷酸的磷酸酯，而第二單核苷酸是由鹼煙醯胺和核糖而生成的核苷酸的磷酸酯，在FAD中，由腺嘌呤和核糖的磷酸酯而生成的第一單核苷酸是與鹼7，8-二甲基異咯嗪和糖醇D-核糖醇連接的。
在可逆反應中，無論是NAD還是NADP都可以從還原的底物(Sr)通過用締合的電子接受氫，作為電子受體或對氧化的底物(So)作為電子給體，即
這些反應的有效特徵是，這些二核苷酸(即NADH和NADPH)的還原態能吸收340毫微米波長的光，而氧化態(即NAD+和NADP+)就不能吸收。因此，在繪出已知酶量的反應速率的校準曲線後，由已知量的底物、該酶的已知活性和在340毫微米處的光密度可觀測到的變化速率，就可以求催化其中一個反應的酶的未知量，同樣，由該校準曲線，已知活性的酶的已知量和在340毫微米處的光密度已測定出的變化速率可以求出催化其中一個反應的酶的底物的量。
雖然以診斷化驗的價值而言，NADH類似其他還原的二核苷酸，在水溶液中是十分不穩定的，由於配製NADH的水溶液要比配製較穩定的乾粉形式的NADH更容易的多、更廉價以及更精確，這樣，就給成套診斷化驗的生產者和使用者帶來了特殊的問題。
一種穩定NADH溶液的方法包括把混合物與有機溶劑一起儘可能多地除去水分，在美國專利申請號4，153，511中，採用一種惰性的吸溼劑和一種有機溶劑來獲得含有小於0.5%水的NADH溶液，然而，可得到的非水溶劑的NADH溶液趨向粘性，要準確而又精確地配製達到這一程度是很困難的。
在另一種方法中，如NAD和NADP的輔酶，在酸性pH下，被穩定在一種有機溶劑，最好是如丙三醇或丙二醇的液態多羥基化合物中，如Modrovich美國專利申請號4，153，511所述。然而，這些溶液都比較不穩定且對實際上要求該還原輔酶有100%穩定性的自動化化驗特別不適用。
按照本發明的一種穩定的輔酶組合物包括一種鹼性水溶液;一種還原的二核苷酸，優選的是在水溶液中，在第一濃度下的NADH或NADPH;一種多羥基烷基溶劑，最好是在水溶液中的丙二醇;和硼酸鹽順式羥基鍵聯化合物，最好是在水溶液中，在第二濃度下的硼酸或其鹽，該第二濃度約等於或大於第一濃度。
按照本發明，目前一種優選的、穩定的輔酶組合物包括pH在約8和約11之間的水溶液;濃度約介於10毫摩爾-500毫摩爾之間的Bicine緩衝液(N-N-二〔2-羥乙基甘氨酸〕);濃度介於約0.001毫摩爾-50毫摩爾之間的NADH;硼酸濃度至少等於NADH的濃度且在約10毫摩爾-500毫摩爾範圍內;丙二醇濃度介於該水溶液的約20%(體積/體積)-90%(體積/體積)範圍內，最優選的輔酶組合物是其中NADH濃度為10毫摩爾，硼酸濃度為50毫摩爾，丙二醇濃度為50%(體積/體積)和Bicine緩衝液濃度為200毫摩爾並將pH調至約10.0。
按照本發明，一種穩定還原的二核苷酸溶液的方法包括以下幾個步驟將第一濃度的還原的二核苷酸溶解在鹼性水溶液中，將該水溶液緩衝到pH介於約8.0和約11.0之間;在約等於或大於第一濃度的第二濃度下，使該還原的二核苷酸受到硼酸鹽順式羥基鍵聯化合物的作用;以及通過用多羥基烷基溶劑配製約20%(體積/體積)-90%(體積/體積)的水溶液，以還原暴露於水中的該還原的二核苷酸。
圖1是在不同的pH值下，在被金屬汙染的丙二醇中的NADH的穩定性與在未被金屬汙染的丙二醇中的NADH的穩定性比較的圖示。
圖2是在已經過各種純化程序的丙二醇溶液中的NADH的穩定性的圖示。
圖3是在各種pH值下，在純丙二醇中的NADH的穩定性與在50%(體積/體積)丙二醇/水中的NADH的穩定性比較的圖示。
圖4是按照本發明的穩定的二核苷酸溶液最佳pH的測定結果的圖示。
NADH是在臨床化學中廣泛應用在一種輔酶，現行配方通常是按照重新組成的裝填的幹配方或幹凍配方，且都是不穩定的，幹配方通過消耗器混合時是易於消耗的試劑，而且幹配方的生產包括幹凍和幹混合的損耗，當必須依賴消耗器適當地重組試劑時，還有由生產者質量檢查的損耗。
本發明包括製備和使用高度穩定的NADH水溶液，目前可得到的液體NADH配方被說成是基本上無水的，很難用吸管吸出，與本發明的配方相比較，這些配方更易消耗、且其生產需要更大的勞動強度。
本發明提供了一種液態NADH的溶液，它至少約一年是穩定的。可採用該溶液系統，其中NADH的氧化被用於分析物濃度的測定。NADH的損失可直接通過在340毫微米處的吸光率的損失而測定出或通過偶聯的比色系統，螢光分析或電化學分析的損失而測定出。此外，NADH水溶液的應用為前面配製的全部有機溶液提供了更大靈活性。本發明的一個優點，在NADH溶液內除水能測定NADH的性能，該性能取決於導電溶液的存在。
雖然，NADH被結合到帶有硼酸鹽鍵聯基的親和層析柱上，用硼酸鈉溶液洗脫，並在NADH存在時，通過分光光度分析來測定洗脫液〔Maestas等人色層分析法雜誌189 225-231(1980)〕，但迄今為止尚沒有人提出NADH在這種洗脫液中特別穩定或向這種洗脫液加入一種有機溶劑就會產生一種特別穩定的輔酶組合物。
一般說來，按照本發明，通過用4埃(
)分子篩來處理丙二醇並用硼氫化鈉從該溶液中除去少量的氧化劑來穩定本發明的NADH或其他還原的二核苷酸，該經處理的丙二醇與含有硼酸的緩衝液，以1∶1混合併將pH調至10.0，該NADH或NADH的還原類似物很容易溶解在含水的鹼性物質中，該溶液可在塑料或玻璃貯藏裝置中貯藏至少約一年，該NADH溶液可以重複使用多次且在敞開的容器中不會遭受任何損失。
人們認為硼酸鹽陰離子是通過在核糖的2′，3′位的1，2-順式二醇連接來結合二核苷酸的，由於這個原因，硼酸及其鹽和硼酸及其鹽的衍生物通常可以稱為順式羥基鍵聯化合物，見Fulton「Boronate Ligands in Biochemical Seapralions-，Amicon Corporation，Scientific Systems Division，Danvers，Massachusetts(1981)。按照本發明，有使用價值的硼酸的硼酸鹽包括苯基硼酸鹽、烷烴硼酸鹽、2-苯基乙烷硼酸鹽、3-氨基苯硼酸和其它硼酸鹽酯，見本文收入參考的下列公開文獻Fulton，上述;Glad等人色層分析法雜誌200，254-260(1980)及Bouriotis等人色層分析法雜誌，210，267-278(1981)。雖然鍵聯的氫和疏水作用也起一部分作用，但是在NAD(H)、NADP(H)、和FAD(H2)中有多過一個容易接近的1，2-順式二醇的存在將有助於牢固地與硼酸鹽結合，Fulton上述。
儘管不打算使本發明受任何特殊作用方式的限制，但人們認為硼酸鹽結合到二核苷酸的這些順式羥基上，通過在相信的不穩定的鍵的這些羥基會阻止親核的作用，這種親核作用可引起該分子降解到單核苷酸上。
按照本發明，採用丙二醇使水和還原吡啶鎓化合物之間的互相作用減至最小，並藉此使氧化作用減至最小。人們認為通過降低該溶液的電介質常數可以提供更穩定的NADH。
採用Bicine緩衝液可使該溶液的pH保持在約8-11之間，NADH在高pH時，特別是pH8.0以上更穩定，Lowry等人生物化學雜誌，236 2756-2759(1961)和Wu等人臨床化學，32 314-319(1986)，通常認為高pH能維持二核苷酸的還原態並防止硼酸鹽的損失，用硼氫化鈉處理約200毫克/升的丙醇過夜，這種處理將使溶液中的氧化作用降到最小值，當反應時，就生成了水、硼酸和氫氣，雖然，目前獲優選的是硼氫化鈉，但是預先處理其它的硼氫鹽類，由於硼氫鹽類分解而生成很有用的硼酸。
用4埃分子篩淨化丙二醇，以除去丙二醇中的水、氧化劑，如醛和過氧化物和其他汙染物。
在下列實施例中，將更詳細地說明本發明。在實施例1中，處理罐裝的、疑有金屬汙染的丙二醇以改進其性能，並將該性能與瓶裝的丙二醇的性能相比較，也將純丙二醇組成與實施例1中的水溶液比較。按照本發明的實施例2，提供了在不同的pH值下，NADH組合物的比較以及確定NADH溶液穩定性的最佳pH值。在實施例3中，驗證了本發明目前優選實施的貯藏期限。在實施例4和5中，分別敘述了本發明的NADH組合物與血脲氮(BUN)試劑結合或與甘油三酯化驗試劑結合時的穩定性。實施例6，涉及用按照本發明的穩定組合物在各種物質中的混合試劑來測定血氨。在實施例7中，驗證本發明的穩定組合物在BUN自動化驗中的適用性。在實施例8中，考慮把本發明的二核苷酸應用在丙氨酸轉氨酶化驗中。實施例9敘述了本發明穩定組合物在天冬酶氨基轉移酶化驗中的應用，實施例10，涉及本發明NADPH溶液的應用。
實施例1為了研究不同pH的影響，比較使用去除各種汙染物經處理的丙二醇與未經處理的丙二醇以及比較使用「純」丙二醇與使用含水混合物的影響，進行了下列諸實驗。
八個不同實驗條件分為三組第一組，未處理的丙二醇;第二組，經處理的丙二醇;和第三組，50%丙二醇溶液。
在第一組中，有四個試樣(1)取自金屬罐的丙二醇和22毫克/毫升NADH;(2)pH8.4的瓶裝丙二醇和22毫克/毫升NADH;(3)pH10.3的瓶裝的丙二醇和22毫克/毫升NADH;和(4)pH11.8的瓶裝的丙二醇和22毫克/毫升NADH。
在第二組中，有三個試樣(5)取自上述第一組的編號(2)和硼氫化鈉加上22毫克/毫升NADH一起處理;(6)取自上述第一組的編號(2)和硼氫化鈉和Chelex樹脂5%重量/體積(西格馬藥品公司St.Louis，Missouri)加上22毫克/毫升NADH一起處理;和(7)取自上述第一組的編號(2)只與分子篩3%重量/體積，8-12目(Davison Chemical Division，Baltimore，Maryland)一起處理。
在第三組中，有一個試樣，即(8)，它包含50%瓶裝丙二醇、100毫摩爾Bicine、和pH8.4的50毫摩爾硼酸;以及11毫克/毫升的NADH。
可將NADH溶液用作含有四唑鎓鹽心肌黃酶的反應混合物的試樣，在取樣間隔時間結束時所剩餘的NADH的量是與由下列反應而生成的甲
-INT的量成比例的。
即在試驗溶液中，所存在的NADH越多，反應結果所生成的甲-INT就越多。
所有NADH試樣均被貯藏在45℃，取樣間隔時間等於圖1和圖2所示的天數。
該實驗反應結果的根據，如圖1和圖2所示，已測出罐裝的丙二醇試樣是十分不穩定的，也已測出pH8.4時的溶液要比pH10.3時的溶液更不穩定，pH10.3的溶液要比PH11.8的溶液更不穩定，雖然在這些條件下，NADH溶液，在14天後，至多只有75%穩定。也已推斷出，汙染的丙二醇和硼氫化鈉以及分子篩一起處理，可以增加汙染的丙二醇的穩定性，而Chelex樹脂就無所幫助。
實施例2該實驗是研究NADH在不同的pH值下，在50%體積/體積(溶液/水)中的穩定性與上述「純」丙二醇的反應結果的比較，採用實施例1中的試驗程序。
圖3所示的反應結果說明，在下同pH值下，當pH為8.3或以下時，如圖3上面三條線所示的「純」丙二醇組合物要比由圖3下面三條線所示的50%溶液更穩定。
實施例3優選的二核苷酸穩定溶液是由丙二醇和4%重量/體積的4埃分子篩一起處理並加入2毫克/毫升硼氫化鈉而配製的，該溶液貯藏在排氣系統中過夜或至少8小時，配製pH9時的200毫摩爾Bicine和100毫摩爾硼酸蒸餾水溶液，該溶液以1∶1與丙二醇混合，以使最終濃度為50%丙二醇、50毫爾硼酸、和100毫摩爾Bicine，用氫氧化鈉將pH調至10，慢慢地加入約11毫克/毫升的NADH，該溶液在下文稱為二核苷酸溶液，在2-8℃下，貯藏的未混合的該溶液至少約一年是穩定的，標準的穩定性為在-20℃下，約一年;在2-8℃下，約一年;在室溫下，2個月;在37℃下，1個月;在45℃下，2周，測定臨床分析物時，該溶液可與酶溶液混合。
如圖4所示，優選的、二核苷酸溶液的穩定性試驗是在45℃高溫至模擬在低溫下延長貯藏的作用而進行的。如圖4所示的結果指出，在使用前，貯藏的按照本發明溶液的pH約10為最佳。
按照該實施例，目前較優選的二核苷酸溶液的成分包括Bicine(＃B-3876從西格馬藥品公司St.Louis.Missouri得到);NADH(＃N-8129從西格馬藥品公司得到);硼氫化鈉(＃S-9125從酉格馬藥品公司得到);丙二醇(食品級，從美國密西根州中部Dow藥品公司得到)和硼酸(從Baker藥公司得到)。
實施例4當將實施例3的二核苷酸溶液與20單位/毫升脲酶溶液及與在pH8.3時，在15毫摩爾三羥甲基氨基甲烷緩衝液中的0.2毫克/毫升α-酮戊二酸以1∶80稀釋的穀氨酸脫氫酶混合時，實施例3的二核苷酸溶液可用於測定BUN的試樣，如該溶液含有0.1%疊氮化鈉，該混合試劑在三個月內可用於測定BUN濃度，在三個月後，這種混合的化驗試劑系統僅損失原線性權利要求
的150毫克/升的15%。
實施例5當實施例3的二核苷酸溶液與含有100單位/毫升脂肪酶、5單位/毫升丙三醇激酶、2單位/毫升丙酮酸激酶、1單位/毫升乳酸脫氫酶的緩衝液;0.7毫摩爾磷酸烯醇丙酮酸;0.05毫摩爾三磷酸腺苷(ATP)及10毫摩爾氯化鎂以1∶80混合時，實施例3的二核苷酸溶液可用於測定在試樣中的甘油三酯的濃度，當該溶液混合時，該溶液在一個月內可用於測定試樣中的甘油三酯。
實施例6血清的氨測定在毒理學上是重要的，大多數醫院每個月都要進行幾次氨試驗，然而，由於對這個試驗要求有時間間隔期限，因此必須有相對穩定的試劑，實施例3的二核苷酸可在pH8.5時在三羥甲基氨基甲烷緩衝液中，與含有10單位/毫升穀氨酸脫氫酶和0.5毫克/毫升α-酮戊二酸的無氨溶液以1∶80混合，快速地用於測定血清中的氨水平，未混合的這種溶液至少穩定約一年之久，當混合時，混合溶液至少穩定1個月。
實施例7BUN也可以通過採用輻射衰減化驗的試劑進行螢光測定，它是本文收入參考的美國專利號4，495，293通常所特有的內容，該試劑可分為3瓶，這種試劑可由三瓶物質來配製，第一瓶含有NADH溶液;第二瓶含有1600單位/毫升脲酶、16毫克/毫升α-酮戊二酸和在pH7時，在磷酸緩衝液中的400單位/毫升穀氨酸脫氫酶以及25%丙三醇加5×10毫克/升螢光素鈉;第三瓶含有0.5毫克/毫升medola藍、thiazoyl藍和pH2.5檸檬酸鹽緩衝劑。
當第一瓶和第二瓶與pH7.5的100毫摩爾磷酸緩衝液以1∶1∶40相混合時，血液試樣被水解，產生的氨在穀氨酸中被吸收與在NADH中伴隨的損失相比是減少了，剩餘的NADH在第二反應中可與用上述緩衝液以1∶40稀釋的第三瓶反應催化生成MTT-甲
，所產生的MTT-甲
的量是與在原試樣中BUN的量成比例的，該試劑系統獨特地產生的CVs小於臨床試樣的6%，第一瓶、第二瓶和第三瓶的混合液可用於檢測試樣中的BUN，至少約一年。
實施例8丙氨酸轉氨酶(ALT)也可以通過用實施例3的二核苷酸溶液、500毫摩爾L-丙氨酸、15毫摩爾α-酮戊二酸，0.10毫摩爾吡哆醛-5-磷酸(任意的)、及600單位/升乳酸脫氫酶來測定，當該混合物混合時，至少穩定一個月，可用於定量地測定血清或血漿中的ALT。
實施例9天冬氨酸氨基轉移酶(AST)可通過採用實施例3的二核苷酸溶液與240毫摩爾L-天冬氨酸、12毫摩爾α-酮戊二酸、0.10毫摩爾吡哆醛-5-磷酸、420單位/升蘋果酸脫氫酶及600單位/升乳酸脫氫酶混合來測定，該混合物至少穩定一個月，可用於定量地測定血清或血漿中的AST。
實施例10在實施例3的二核苷酸溶液中，可用NADPH代替NADH，在診斷試驗中的某些酶可用NADPH代替NADH，由Proteus SP.純化的穀氨酸脫氫酶只能用NADH，這種酶可用於代替實施例2中的穀氨酸脫氫酶用以測定BUN。
雖然在優選的實施例中已描述了本發明，但要理解本發明的改進和提高，對本領域技術熟練的人們來說將會存在，如本發明主要是通過NADH的穩定溶液、按照本發明可被穩定的其他二核苷酸溶液來舉例例證的，又如考慮到，按照本發明，NADPH、還原的3-乙醯吡啶腺膘呤二核苷酸、還原的3-乙醯吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸酯、還原的硫逐亭醯胺腺嘌呤二核苷酸、還原的硫逐亭醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯及還原的煙醯胺次黃嘌呤二核苷酸也可被穩定。
同樣，雖然在上述實施例中採用了Bicine緩衝液，但也考慮了採用在優選的pH範圍內能維持二核苷酸溶液的pKa和具有充分緩衝容量的任何緩衝液，如其他適宜的緩衝液包括Tris〔三羥甲基氨基甲烷〕;Hepes〔4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸〕;三乙醇胺;MOPS〔4-嗎啉丙烷磺酸〕;CHES〔2-環己基氨基)乙烷磺酸〕;以及CAPS〔3-環己基氨基-1-丙烷磺酸〕。
按照本發明，在其他化驗分析中，有用的輔酶組合物包括涉及乳酸脫氫酸丙酮酸化驗分析乳酸〔即LDH(P到L)〕以及脲酸。
此外，本發明還考慮到採用與水混溶的其他穩定的有機溶劑來代替丙二醇，只要這些有機溶劑不與還原的二核苷酸反應，形成氫鍵除外。具有2到4個羥基和2到10個碳原子的液態多羥基化合物是優選的，這些優選的多羥基化合物包括丙三醇和1，2-丙二醇。
也考慮到按照本發明的輔酶組合物可以製成濃溶液和稀溶液使用。
因此，如本發明包含的所有變化，可用以包括在本發明的權利要求
範圍內。
權利要求
1.一種穩定的輔酶組合物，它包括一種鹼性的水溶液；一種在上述水溶液中的在第一濃度下的還原的二核苷酸；一種在上述水溶液中的多羥基烷基溶劑；及在上述水溶液中的在第二濃度下的硼酸鹽順式羥基鍵聯化合物，上述第二濃度約等於或大於上述第一濃度。
2.根據權利要求
1所述的輔酶組合物，其中所述多羥基烷基溶劑是在第一濃度下，在上述水溶液約20%(體積/體積)至90%(體積/體積)的範圍內。
3.根據權利要求
2所述的輔酶組合物，其中所述水溶液包括能有效地維持上述水溶液pH大於8.0的緩衝液。
4.根據權利要求
3所述的輔酶組合物，其中所述硼酸鹽順式羥基鍵聯化合物是從一組包括硼酸、硼酸鹽、硼酸的硼酸鹽衍生物以及硼酸的硼酸鹽衍生物的鹽中選擇的。
5.根據權利要求
4所述的組合物，其中所述多羥基烷基溶劑是丙二醇。
6.根據權利要求
5所述的組合物，其中所說上述水溶液的pH是在約8和約11之間。
7.根據權利要求
6所述的組合物，其中上述第二濃度是在約10和約50毫摩爾之間。
8.根據權利要求
7所述的組合物，其中所說上述多羥基烷基溶劑的濃度約等於上述水溶液的50%(體積/體積)。
9.根據權利要求
8所述的輔酶組合物，其中所述還原的二核苷酸是從一組包括還原的吡啶二核苷酸和還原的吡啶二核苷酸磷酸鹽中選擇的。
10.根據權利要9所述的輔酶組合物，其中所述還原的二核苷酸是NADH，其中所述第一濃度是介於約0.001毫摩爾-50毫摩爾之間。
11.一種穩定還原的二核苷酸溶液的方法，包括以不幾個步驟將第一濃度的還原的二核苷酸溶解在一種鹼性水溶液中;將水溶液緩衝至pH介於約8.0和約11.0之間;在約等於或大於第一濃度的第二濃度下，使該還原的二核苷酸受到硼酸鹽順式羥基鍵聯化合物的作用;以及通過用多羥基烷基溶劑配製約20%(體積/體積)-90%(體積/體積)的水溶液，以還原暴露於水中的該還原的二核苷酸。
專利摘要
一種還原的二核苷酸，最好是煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被穩定在含有丙二醇、硼酸和能在pH8-11範圍內緩衝的緩衝液的鹼性水溶液中，穩定液含有50％(體積/體積)以上的水，剩餘體積的穩定液含有除去了各種氧化劑經化學處理的丙二醇。可將該試劑本身或該試劑與鑑定試劑系統一起用於臨床化驗室中。
文檔編號C12Q1/00GK87100939SQ87100939
公開日1987年11月4日 申請日期1987年2月23日
發明者戴維·A·約斯特 申請人:艾博特公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan