一種蝴蝶蘭查爾酮合酶基因,其編碼序列和應用的製作方法
2023-05-10 00:27:01 2
專利名稱：：一種蝴蝶蘭查爾酮合酶基因,其編碼序列和應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於分子生物學、分析化學以及基因工程
技術領域：
，具體涉及一種在蝴蝶蘭中表達的査爾酮合酶(蝴蝶蘭査爾酮合酶5，chalconesynthase,EC.2.3.1.74，p力cM)的基因克隆，此克隆的序列分析結果，基因表達模式分析結果，轉基因載體的構建，轉基因植株的獲得以及相應的生理生化特性的鑑定。技術背景蝴蝶蘭作為一種重要的經濟型花卉，其花卉品質的優劣直接關係到其觀賞價值與經濟價值。花卉品質中尤為重要的是花色，隨著基因工程的發展，運用分子生物學手段對花卉花色進行遺傳改良成為研究熱點。植物花冠的顏色由色素種類來決定，主要是黃酮類色素。苯基苯乙烯酮合成酶，即查爾酮合酶(CHS,chalconesynthase,EC.2.3.1.74)，催化類黃酮和花色素合成途徑的第一步反應，是類黃酮類物質生物合成途徑的限速酶。查爾酮合酶通常由植物中多基因家族編碼，査爾酮合酶能在花中特異性表達，它在植物中表達量的改變可能影響花的顏色。目前多採用反義RNA技術對花卉品質進行改良，荷蘭學者(1988)首先從矮牽牛中分離出CHS的cDNA，利用反義RNA技術，轉化矮牽牛花後獲得轉基因植株。花色從原來的紫色變成粉紅色並有白色，有些植株花全呈白色，這樣矮牽牛花色增多，觀賞價值得以提高(Elomaa等，1993)。Johzuka-Hisatomi等(1999)也從(牽牛)morningglories中分離出查爾酮合酶基因，並以反義和正義方向導入其中(開粉紅色花)品種，得到開白花與淡粉色的轉基因植株。以後相繼報導了從多種植物中克隆了與花青素代謝有關的査爾酮合酶基因，並將它轉入矮牽牛，獲得的轉基因矮牽牛花色發生了改變，出現了自然界沒有的變異(Ryutaro等，2000a，200b)。本發明研究了一種從蝴蝶蘭中克隆催化生成査爾酮的査爾酮合酶(P力cAs5)，轉入矮牽牛後改變花色素苷含量的技術。應用該技術對於改良蝴蝶蘭以及蘭科植物的花色品質、增加其品種的多樣性具有重要的意義。
發明內容本發明的目的在於提供一種從蝴蝶蘭中克隆催化生成査爾酮的查爾酮合酶基因，其編碼序列和應用。本發明的一方面提供了一種新的蝴蝶蘭基因P力cAs5，該基因是一個查爾酮合酶基因。p/c力s5包含1185bp的開放閱讀框和一個159bp的內含子(GeneBankaccessionnumber:DQ089652),其核酸序列為SEQIDNO.1所示。本發明的另一方面提供上述查爾酮合酶基因的蛋白質分子，該蛋白質分子具有SEQIDNO.2所示的胺基酸編碼序列。本發明還提供了用於調取獲得蝴蝶蘭樣品中査爾酮合酶基因的核苷酸引物序列，為根據上述査爾酮合酶基因家族保守區域設計的兼併引物，及用於進一步擴增Phchs5基因上下遊序列的反式PCR引物，引物序列如SEQIDN0.3所示。本發明還提供一種利用轉基因技術將編碼具有蝴蝶蘭査爾酮合酶活性的核苷酸序列轉化入矮牽牛以改變花色素含量的方法，其步驟如下(1)將蝴蝶蘭p力Ws5基因的開放讀框連於植物表達調控序列，形成含有蝴蝶蘭p力c力s5基因的植物表達載體；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入農桿菌，將含表達載體的農桿菌同矮牽牛葉片共培養，在22土2。C條件下，暗培養3天後，通過抗生素篩選，植物組織再生，獲得蝴蝶蘭p力c力s5基因的轉基因植株。含有蝴蝶蘭；^cA^基因的轉基因植株的花色發生改變，花色素苷含量發生變化。本發明還提供一種用於檢測樣品中蝴蝶蘭查爾酮合酶基因拷貝數的方法，其步驟為首先提取蝴蝶蘭的基因組DNA。然後利用Dral和HindIII酶切。酶切後的DNA片段轉膜並與前面所述核苷酸序列SEQIDNO.l進行Southern雜交，然後檢測目的片段的有無。在本發明中，還提供了一種對p力c力s5進行結構分析、進化分析的方法，其步驟如下運用ClustalXverl.8(Thompson等，1994)進行序列的同源性比較。MEGA2(Kumar等，2001)用於進化樹[鄰接法(Saitou和Nei，1987)]的構建，同時用於估計同義突變頻率和反義突變頻率(Nei和Gojobori，1986)。以RRTree軟體(Robinson—Rechavii和Huchon，2000)進行相對速率檢驗(見圖2)。本發明還提供一種檢測p力cA5mRNA表達模式的方法，其步驟如下(1)提取蝴蝶蘭根、葉以及處於不同發育階段的的各花器官的總RNA(Trizol，市售)。(2)利用反轉錄試劑盒(市售)將總RNA反轉錄成cDNA，然後根據/^cAs5的開放讀框的第706-720，950-965的特異序列設計引物，進行PCR。在本發明中，術語"蝴蝶蘭/^c力W基因的開放閱讀框"指編碼完整的蝴蝶蘭蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.1中第1-1855位的核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQIDNO.1中第1-1855位的核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQIDNO.1中第1-1855位的核苷酸序列同源性低至約85%的簡併序列也能編碼出SEQIDNO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更加的在高度嚴緊條件下與SEQIDNO.l中從核苷酸第1-1855位的核苷酸序列的同源性至少85%,較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與天然的蝴蝶蘭/^c力s5基因相同功能的蛋白的SEQIDNO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限於)若干個(通常為1一90個，較佳地1一60個，更佳地1—20個，最佳地1一10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為IO個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。本發明的蝴蝶蘭P力c力^5蛋白的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的蝴蝶蘭cDNA或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的蝴蝶蘭cDNA庫作為模板，擴增而得相關序列。當序列較長時，常常需要進行分步PCR擴增，然後將各次擴增出的片斷按正確次序拼接在一起。一旦獲得了目標序列，就可以用重組法來大批量地獲得本發明中的p力cAs5基因序列。這通常是將其克隆入載體，在轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離到有關序列。表1為本發明的蝴蝶蘭P力cAs5與其他植物CHS的胺基酸含量相似度比較表。表2為轉基因矮牽牛的花色素苷和類黃酮含量WT為野生型矮牽牛；EV為轉空載體的矮牽牛；Pl，P2，P3為正向轉入外源p力cA^的矮牽牛植株，每一樣品平行測定2-3次。圖1為蝴蝶蘭p力c/s5基因的Southernblot鑑定lane1Dral酶切，lane2為HindIII酶切。圖示結果說明基因為多拷貝。圖2鄰接法進行蝴蝶蘭和其它蘭科植物CHS基因的系統進化分析。圖3為RT-PCR鑑定/^c/^5^表達模式。1-5分別代表花發育的不同階段。T表示花被，P表示花瓣，L表示唇瓣。yel，wht，mau分別代表黃花紅唇，白花黃唇，紫紅品種三個品系。在紫紅品種的花被中，phchs5從階段l就有表達；而在"黃花紅唇"品系中，到階段3才能檢測到其轉錄物。白花品種出現表達的時間更晚。圖4為轉基因植株的PCR鑑定EV為轉空載載體的矮牽牛；Pl，P2，P3為正向轉入外源；力c力s5的矮牽牛植株。圖5野生型較轉基因植表型對比Pl，P2，P3為正向轉入外源p力c力s5的矮牽牛植株。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborUbortaryPress,1989)中所敘述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1蝴蝶蘭p力c/s5基因的克隆1.將室溫(25°C)生長的蝴蝶蘭花苞液氮中冷凍保存，應該注意到本實驗所選取的材料與選用的蝴蝶蘭品種沒有必然的聯繫。2.DNA的提取。取部分組織，用研缽研碎，加入盛有預熱的裂解液的50ml離心管，65。C保溫40min，離心。上清中加入RNaseA(0.5ixg/ml)，65。C消化RNAlh;以等體積的酚/氯仿/異戊醇(25/24/l)抽一次蛋白，以乙醇沉澱DNA，70%乙醇洗滌兩遍，最後用TE溶液溶解DNA。用0.8%瓊脂糖凝膠檢測DNA的質量。3.全長基因的克隆。根據其他植物CHS同源序列設計簡併引物/^c/s5—F和/7力c力W一R，採用RT-PCR方法從蝴蝶蘭cDNA中擴增出一條800bp左右的條帶。根據該800bp序列設計反式PCR引物5IN1-F，5IN1-R;5IN2-F，5IN2-R;5IN3-F，5IN3-R分別用於反式PCR的第一輪到第三輪擴增。以BglII和HindIII酶切且環化的DNA片段為模板，進行反式PCR，以便克隆該片段的上遊和下遊側翼序列。經過三輪巢式反應，序列拼接，得到全長為1855bp的基因。將PCR產物回收，連接到T-載體上，用SP6和T7做為通用引物進行測序。將測序結果提交至NCBI非冗餘資料庫，BLAST結果表明該序列和其他物種中相應的查爾酮合酶序列高度保守。上述各引物序列見SEQIDNO.3。實施例2蝴蝶蘭p力c力W基因的序列信息與同源性分析本發明新的蝴蝶蘭P力c力s5基因的長度為1855bp，詳細序列見SEQIDNO.1。該基因編碼的多肽由384個胺基酸殘基組成。詳細序列見SEQIDNO.2。將蝴蝶蘭p力c/^5全長基因的編碼區序列及其編碼的蛋白質序列用BLAST程序再Non—redundantGeneBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non—redundantGeneBankCDStranslations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR資料庫中進行蛋白質同源性檢測，結果發現在胺基酸水平上，它與其他植物的CHS基因存在很高的相似度(表l)。BLAST的結果表明從蝴蝶蘭中得到的基因可能為査爾酮合酶基因。已知的査爾酮合酶基因催化一分子的香豆醯CoA(CoumarylCoA)與三分子的丙二醯CoA(malonylCoA)縮合生成4，5，7三羥基黃烷酮(narigeninchalcone)(ControlofPlantGeneExpression.61993.)，可知此基因具有相同的功能。實施例3蝴蝶蘭p力c/^基因的拷貝數分析以CTAB方法大量抽提蝴蝶蘭基因組DNA，取10ugDNA分別用Dral和HindIII酶切，以0.8%瓊脂糖凝膠進行片段分離，將DNA轉到Hybond—N+尼龍膜上，固定；以蝴蝶蘭p力cAs5基因為探針進行Southern雜交，鑑定它在蝴蝶蘭中的拷貝數，結果表明，/力c力s基因是四到五個拷貝組成的多基因家族(見圖l)。實施例4蝴蝶蘭CHS序列置於來自蘭科和其它科屬的CHS基因的進化分析資料庫中獲得包括新的p力cAs5基因在內的5個蝴蝶蘭CHS序列和來自幾個科、的CHS超家族成員序列。以鄰接法推斷蝴蝶蘭CHS基因序列的系統進化關係，蝴蝶蘭CHS序列分布在較遙遠的兩個支系中。所有鑑定的蘭科CHS基因形成兩個亞家族(見圖2)。以RRTree軟體(Robinson—Rechavii和Huchon，2000)進行相對速率檢驗。蝴蝶蘭phchsl，2，3，4亞家族的進化速率是phchs5的1.5倍。序列分歧的時間用K/2r估計(K指突變頻率；r指序列的平均置換速率)。估計兩個CHS分支分歧發生在31500000年前。實施例5蝴蝶蘭p力c力s5表達模式分析用RT—PCR的方法檢測，提取不同品種蝴蝶蘭根、葉以及處於不同發育階段的的各花器官的總RNA，反轉錄，然後根據p/cAs5的開放讀框的第706-720，950-965的特異序列設計引物獲得DNA分子探針。結果表明該基因僅在花瓣和唇瓣中表達(唇瓣是花瓣的變形)。/7力cA5在花瓣中大量表達，其表達水平曲線與花色素合成速率的曲線明顯一致。比較p^力s5在蝴蝶蘭不同花色品種的花器官中的表達，其表達水平明顯與花色素在花器官中的積累水平一致。P力c力s5應該是負責蝴蝶蘭花瓣中花色素合成的基因。對/^C力55兩個外顯子分別檢測，表明P力c/^5基因在各品系中都是是全長轉錄的(見圖3)。實施例6蝴蝶蘭p/c力s5基因在矮牽牛中進行真核表達及轉基因植株的表型鑑定1.含目的基因(蝴蝶蘭p/c力W基因)表達載體的構建。擴增出完整的編碼閱讀框.並在正反向引物上分別引入限制性內切酶識別位點(視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將蝴蝶蘭p/7C力55基因正向克隆到雙元表達載體pCAMBIA2301中，在保證閱讀框架的前提下，將其轉入農桿菌中。利用葉圓盤法技術轉化模式植物矮牽牛。2.利用葉盤法轉化矮牽牛農桿菌培養1)挑取菌落，lml農桿菌培養基搖菌，200rpm，28°C。2)50ml培養基擴增培養，過夜。3)將上述菌落離心，3700rpm，6min;以3mlMS0重懸，每150mlMS0中加lml重懸液，200rpm，培養7h。矮牽牛轉化1)矮牽牛葉片切成0.8X0.8cm(lcm)方塊，放進含農桿菌的MSO液中，190rpm搖床，lOmin。2)取出葉片用濾紙吸乾多餘濾液(不能太幹)。3)吸乾葉片放在加蓋一層濾紙的MS1上，封口膜封好，22'C暗培養。材料培養3d,按以下步驟洗菌1)無菌水15minx2;2)無菌水+Cef50015minx2;3)MS0+Cef50020minx2;4)吸水紙吸乾多餘水分，轉移至MS2(葉片背面朝下)；5)25°C，16h光照培養715d，愈傷組織形成，20d分化芽；6)轉生根培養基，27d生根i昔養基。分子鑑定以CTAB方法小量抽提經部分轉基因植株的基因組DNA，以轉pCAMBIA2301空載體的矮牽牛作為負對照，根據蝴蝶蘭；^c力s5基因和選擇標記NPTII基因的特異序列分別設計引物CHS-XF和CHS-XR，進行PCR(引物序列見SEQIDNO.3)。結果表明轉化率高於50%(見圖4)。表型鑑定總共得到26棵轉基因植株，共有18個株系開花共73朵。通過表型鑑定發現絕大多數轉基因矮牽牛的花均有花色變淡的現象，個別個體的花發育出現畸形。推測外源CHS5基因在宿主矮牽牛中實現了超量表達的同時，發生共抑制減少內源矮牽牛中花色素苷和類黃酮的含量。較野生型表型對比見圖5。試驗結果表明，實施例1中得到的蝴蝶蘭p力c力s5基因為有功能的基因，可以用於利用轉基因技術改良蝴蝶蘭花色的研究和產業化中。具體生理數據參見表2。8表lcAs基因家族胺基酸含量相似度分析tableseeoriginaldocumentpage9WT為野生型矮牽牛；EV為轉空載體的矮牽牛；Pl,P2，P3為正向轉入外源p/c力s5的矮牽牛植株序列表1.SEQIDNO.1的信息(i)序列特徵長1855bp，線性單鏈核苷酸(ii)分子類型核酸(iii)序列及序列標記-30AGCTTGTGAGAGACGACGGAGAGGGAGTTAATGGCGCCGGCGATGGAGGAGATCAGGCGA30GCTCAGAGAGCGGAGGGCCCGGCGGCGGTGCTCGCAATCGGCACCTCCACGCCGCCGAAC90GCTGTGTATCAAGCCGATTATCCCGATTATTACTTCAGAATCACCMCTGCGAGCATCTC150ACTGACCTCMGGAGAAGTTCMGCGAAT6T(5TA4ftT7^fi4C&UUUUU4C6T7T270^7T7T7T釘Cfc47T釘7K46^7TJ7KUUU4ir力7777777T330T55T7T7^6GCGAGAAATCCATGATAAAAAAACGGTACATGTATCTAACAGAAGMTTC390CTGAAAGAAMTCCCAATATCTGCGCATTCATGGCTCCTTCACTCGACGCTAGGCMGAC450ATAGTTGTCGCCGMGTCCCAMGCTCGCCAAAGAGGCCGCCGCGCGCGCCATCAAGGM510TGGGGACACCCCAMTCACGCATAACTCATCTCATCTTCTGCACCACCAGCGGCGTCGAC,5IN3-R570ATGCCCGGCGCCGACTACCMCTCACCCGCCTCCTCGGTCTCCGCCCCTCCGTC八ACCGA、IN2-R'5IN1-R630TTCATGCTCTACCAGCAGGGCTGCTTCGCCGGCGGCACCGTCCTCCGCCTCGCCAAGGAT690CTCGCCGAGMCAACGCTGGCGCCCGCGTGCTCGTCGTTTGCTCCGAAATCACCGCCGTC750ACTTTCCGTGGCCCGTCGGMTCCCATCTTGATTCCCTCGTTGGACAGGCGCTCTTCGGC810GACGGAGCCGCCGCTATCATTGTCGGATCCGATCCTGATTTAGCCACTGAGCGCCCTCTG870TTTCMCTAGTCTCTGCTTCCCAAACCATCCTTCCCGAATCAGAGGGCGCCATCGATGGC930CACCTTCGTGAAATCGGACTCACCTTCCACCTACTCMGGACGTCCCCGGCCTTATTTCT990AAAAACATTCAAAMTGTCTCCTTGAGGCCTTCMGCCACTCGGTGTGCTTGATTGGAAC5IN1-F一1050TCAATTTTTTGGATCGCCCACCCGGGCGGCCCGGCTATACTCGATCAAGTTGAGACCAAG1110CTCGGTCTGMGTCCGAGAAGCTCGCCGCGAGTAGAMTGTGCTCGCTGAGTACGGTAAC5IN2-F:1.170ATGTCGAGCGCATGCGTTCTTTTCATACTCGATGAGATGCGGAGGCGATCAGCAGAGGCC1230GGGCAGTCGACCACTGGCGAGGGTTTGGAGTGGGGAGTTCTATTTGGGTTCGGTCCGGGA5IN3-F1290CTTACGGTCGAGGCTGTTGTATTACGTAGCGTTCCAATTGGTGGCACCGAGTAAATGGGA1350CTGAGGAGTTAGGGTTTGATATTTTGTGGTTTTATTGGACTTGTTTGTGGTTAATTTGAA1410GGATTAGGGCCATATMGGGCTTGAGTTGGGTGGAGTTTTGAAGGGTGGCAGAGGTAAAA■1470AAAGAMAAGGGATGTTTATCMTTTGATGTTMAAGGTAATACTTTTTTCTTTTTGTGTPAsite1530TATCTACATGGCTATATTTGTAATMAAGMAGTTCTTATGAAAGTATTTATGACTTGGT1590TTGATGCAAMCATGTTTGAAATTATTTTTATTTATATGATTTTGCACTTATTAAAGAGA1650AACTAGCTATCTAAATGTGATGMTTTTATAACTTAMATMTG嵐TATTGTTATGCAA1710AATCAMAATTTAGGCGATATAMCATAMAAGCTAMCTTAATTTGTTAGATATGAAAA1770TACCTAGAAATCGMTGTTACCAGATATTCTTGATTGACTCCCCATGGCTTCCT注核苷酸序列位點在左側加以標識，翻譯起始位點定為+1。(1)翻譯起始密碼ATG和中止密碼UAA加下劃線標識。多聚腺苷酸位點(PAsite)以黑體標識並在上方加以注釋。內含子區域呈斜體。(2)查爾酮合酶活性位點以黑體標識。它們是T132'S133，M135,C164，E192，T194，T197，F215'1255，G257,H304，N337,P376等(Ferreretal.，1999)。CHS家族標籤(GVLFGFGPGLT)加下劃線標識。5IN1-R,5IN2-R,5IN3-R,5IN1-F,5IN2-F,5IN3-F指反式PCR中用到的巢式引物(F-正向；R-反向)。2.SEQIDNO.2的信息(i)序列特徵長為384殘基的單鏈線性多肽(ii)分子類型多肽(iii)序列及序列標記AQRAEGPAAVLAIGTSTPPNAVYQADYPDYYFRITNCEHLTDLKEKFKRM51CEKSMIKKRYMYLTEEFLKENPNICAFMAPSLDARQDIVVAEVPKLAKEA101AARAIKEWGHPKSRITHLIFCTTSGVDMPGADYQLTRLLGLRPSVNRFML151YQQGCFAGGTVLRLAKDLAENNAGARVLVVCSEITAVTFRGPSESHLDSL201VGQALFGDGAAAIIVGSDPDLATERPLFQLVSASQTILPESEGAIDGHLR251EIGLTFHLLKDVPGLISKNIQKCLLEAFKPLGVLDWNSIFWIAHPGGPAI301L叫VETKLGLKSEKLAASRNVLAEYG醒SSACVLFILDEMRRRSAEAGQS351TTGEGLEWGVLFGFGPGLTVEAVVLRSVPIGGTE3.SEQIDNO.3的信息引物序列備註Wjc/w5—F5'CCKTCHYTGGAYGCNMGRCARGAC3'簡併引物用於RT-PCR/Vicfo5—R5'GGBCCRAANARMACACC3'5IN1-F5'GCCACTCGGTGTGCTTGATTG3'用於反式PCR第一輪擴增5IN1-R5'GTTGACGGAGGGGCGGAGA3'5IN2-F5'GAGTAGAAATGTGCTCGCTGA3'用於反式PCR第二輪擴增5IN2-R5'CGGGTGAGTTGGTAGTCGG3';5IN3-F5'GGCGAGGGTTTGGAGT3'用於反式PCR第三輪擴增5IN3-R5'TGAGTTATGCGTGATTTGG3'4SEQIDNO.4:CHS-XF:5，GCTCTAGAGGAGAGGGAGTTAATGGC3'CHS-XR:5，GCATTTTGTGGTTTTATTGGACT3，(上海生工合成)權利要求1.一種分離出的查爾酮合酶基因，其特徵在於為一種特定序列的DNA分子，長1855bp，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.—種如權利要求l所述的査爾酮合酶基因的蛋白質分子，其特徵在於具有SEQIDN0.2所示的胺基酸編碼序列。3.用於調取獲得蝴蝶蘭樣品中査爾酮合酶基因的核苷酸引物序列，其特徵在於為如權利要求1所述査爾酮合酶基因的家族保守區域設計的兼併引物，及用於進一步擴增phchs5基因上下遊序列的反式PCR引物，這些引物序列如SEQIDNO.3所示。4.一種將如權利要求1所述的蝴蝶蘭査爾酮合酶基因的核苷酸編碼序列SEQIDNO.l轉入矮牽牛，並改變其花色素苷含量的方法，具體步驟為；(1)將編碼具有蝴蝶蘭查爾酮合酶基因的開放讀框可操作的連接於植物表達載體；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入農桿菌，將含有表達載體的農桿菌與矮牽牛葉片共培養；(3)通過篩選，PCR鑑定，獲得再生轉基因植株，轉基因植物的花色發生改變，花色素苷含量變化。5.—種用於檢測樣品中蝴蝶蘭查爾酮合酶基因拷貝數的方法，其特徵在於使用權利要求1所述査爾酮合酶基因核苷酸序列SEQIDNO.1對蝴蝶蘭基因組DNA樣品進行southern雜交，然後檢測目的片段的有無；樣品為蝴蝶蘭的基因組DNA，經限制性內切酶酶切後的核苷酸片段。6.—種用於檢測樣品中是否存在如權利要求1所述的蝴蝶蘭査爾酮合酶基因的核苷酸序列SEQIDNO.1的方法，其特徵在於使用SEQIDNO.4的核苷酸序列對轉基因樣品進行PCR擴增，然後檢測目的片段有無，樣品為轉基因矮牽牛基因組DNA。全文摘要本發明屬於分子生物學、基因工程
技術領域：
，具體為一種在蝴蝶蘭中表達的查爾酮合酶(phchs5)的編碼序列，包含此基因序列的重組表達載體，及應用此載體轉化的轉基因植物。應用本發明所涉及基因並在植物中轉化表達，可對轉基因植物的花色起到明顯的改變作用。文檔編號C12N9/00GK101260406SQ20071004651公開日2008年9月10日申請日期2007年9月27日優先權日2007年9月27日發明者劉啟昆,鳳明,李霄競,石金磊,韓穎穎申請人:復旦大學