一種中國被毛孢發酵菌粉提取物的製備及其在防治腎衰竭上的應用的製作方法

2023-05-10 00:19:36 1

專利名稱：一種中國被毛孢發酵菌粉提取物的製備及其在防治腎衰竭上的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及中藥技術領域。具體涉及中國被毛孢發酵菌粉提取物的製備方法及其 在防治腎衰竭上的應用。
背景技術：
冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis (Berk) G. H. Sung，J. M. Sung，Hywel-Jones & Spatafora)系中國著名中藥材。該藥材是真菌寄生於蝙蝠蛾幼蟲後的產物。冬蟲夏草的 「草」是該菌的繁殖器官-子座，蟲屍內的菌絲體是它的菌核。這種既有「蟲」又有「草」的 冬蟲夏草，目前尚不能人工栽培。但從冬蟲夏草中分離的真菌，已能用現代生物工程技術進 行發酵培養，所得產品為該菌的發酵菌粉。該真菌的拉丁學名為中國被毛孢(Hirsutella sinensis Liu, Guo, Yuet Zeng),俗禾爾冬蟲夏草菌(Yang QY et al Chinese Journal of Grassland, Vol. 32，supp. 79-85,2010)。
目前，已用中國被毛孢發酵菌粉開發成《百令膠囊》中成藥，它具有和天然冬蟲夏 草相似的補肺益腎功效(中華人民共和國藥典2010年版p. 681-682，2010)。
腎衰竭(renal failure)是一類由多種因素引起的腎功能低下疾病。包括急性腎 衰竭(ARF)和慢性腎衰竭(CRF)。腎衰竭的特徵性檢驗指標，是患者的血清肌酐(SCr)和血 尿素氮(BUN)含量異常升高；另外，其腎衰竭相關因子，如轉化生長因子(TGFi31)、金屬蛋 白酶組織抑制物I(TIMP-I)、纖溶酶原激活抑制物I(PAI-I)和內皮素(ET)等的mRNA表達 水平明顯上調(J Am Soc Nephrol. 2006，17 :2484-2494.，2005. 16 :133-143)。腎衰竭患者 的腎結構都有不同程度的變性，腎功能部分或全面低下。包括腎小球及腎小管間質纖維化， 濾過率降低；腎上皮細胞線粒體變形，濃縮尿液能力喪失，體內毒素和代謝物瀦溜等。腎功 能嚴重喪失者必需施行腎移植或血透析治療。但腎移植存在排異風險，血透析常有併發症， 兩者又給患者帶來沉重的經濟負擔。
《百令膠囊》的主要成分為中國被毛孢發酵菌粉。該產品對多種腎臟疾病有明確的 冶療效果。如它能使IgA腎病患者的血尿轉陰(中醫研究，第15卷，第4期，26-27,2002)； 也能明顯改善慢性腎炎患者的血肌酐、尿素氮和蛋白尿等指標(中國綜合臨床，第22卷，第 6期，514-515，2006)。但《百令膠囊》內含物的溶解性差，服用劑量大，每日需吞服45顆。 同時，其發酵菌粉中常混雜有蠶蛹粉等高脂類成分，易氧化產羶，保存期短。此外，《百令膠 囊》作為中成藥，無重金屬限量要求，有礙於在國際保健食品市場上推廣。發明內容
本發明所要解決的技術問題在於克服上述不足之處，研究設計一種中國被毛孢發 酵菌粉提取物，使其重金屬含量低、溶解性好、產品不易氧化，服用劑量小，能用於腎衰竭的 預防和治療的中成藥或保健食品。
本發明提供一種中國被毛孢發酵菌粉提取物。該品由冬蟲夏草發酵菌粉提取。其3理化特性為褐色粉末，能全溶於水或乙醇。用中國國家藥典委員會推薦的中藥指紋圖譜測 定，本提取物的HPLC色譜峰和天然冬蟲夏草的疊合一致，兩者的相似率大於90% ；本提取 物的蟲草腺苷、蟲草酸和蟲草多糖含量均比原發酵菌粉高2 10倍。經食品衛生檢測，本 發明提取物無農藥檢出，其汞、鉛、砷、鎘、鉻、鎳、餳、銅等重金屬含量均低於國際食品衛生 相應標準。
本發明所用的生產原料-冬蟲夏草發酵菌粉，可通過市售得到，質量標準應達到 中華人民共和國藥典2010年一部第681-682頁《百令膠囊》項下要求。該品的生產種為中 國被毛孢(又名中華被毛孢)，拉丁學名為Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yu & Zeng。
本發明的另一目的是提供了上述中國被毛孢發酵菌粉提取物的製備方法先將中 國被毛孢發酵菌粉加溶劑溼潤0. 5 1. 0小時。然後經回流提取提取1 2次，每次提取 時間為1 4小時，固液分離得提取液1。殘渣再加溶劑回流提取，固液分離，得提取液2。 合併提取液1和2，經減壓濃縮得濃縮液，濃縮液再經乾燥即得。
提取所用的溶劑為水或乙醇，水為無離子水，其電導率小於20ys/cm，乙醇為食用 級，濃度為10% 90%。溶劑的加量為發酵菌粉的5 15倍(w/w)。用水提取的溫度為 950C 100°C，用乙醇提取的溫度為80°C 90°C。殘渣再用水或乙醇再提取1 2次，每次 提取時間為1 4小時。提取液減壓濃縮的真空條件為0. 1 0. 09Mpa，溫度為60 80°C， 所得濃縮液的比密度為1. 04 1. 10。濃縮液經低溫冷凍乾燥或噴霧乾燥，即得本提取物。
本發明又一目的是提供了上述一種中國被毛孢發酵菌粉提取物在製備預防和治 療腎衰竭藥物中的應用。
本發明提取物經藥理活性檢驗，具有顯著的抗腎衰竭活性，0.2 1.0g/Kg劑量 的提取物能顯著降低腎衰竭鼠的血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)含量，改善由慶大黴素導 致的腎組織變性；逆轉由馬兜鈴酸導致的腎小管上皮細胞增殖抑制，下調腎衰竭關鍵因子 (TGF^ U TIMP-U PAI-U ET)的mRNA表達。結果顯示可用於腎衰竭疾病的預防和治療。
本發明中國被毛孢發酵菌粉提取物的重金屬含量均低於國際食品衛生標準，也無 農藥殘留，能全溶於水或乙醇，提取物也不含培養基殘渣，產品不易氧化產羶，保存期長。本 提取物中的功效比中國被毛孢發酵菌粉高2 10倍，服用劑量可大大減小，便於患者應用， 可用於腎衰竭疾病的預防和治療。
本發明中國被毛孢發酵菌粉提取物可作為活性成份與藥用輔料製成的顆粒劑，膠 囊齊U、片劑，也可製成口含片、口服液和酊劑等劑型。


圖1.中國被毛孢發酵菌粉提取物和天然冬蟲夏草的色譜指紋圖譜，圖中上為天 然冬蟲夏草，下為中國被毛孢發酵菌粉提取物，示兩者的HPLC色譜峰基本疊合一致。
圖2.正常對照組腎單位結構正常，腎小球毛細血菅完好，球囊腔清晰可見，腎小 管上皮細胞未見變性或壞死。間質未見出血或炎細胞浸潤。HEX200
圖3.模型組腎單位結構基本正常，腎小球血管輕度充血，球囊腔內有血漿纖維 蛋白滲出。腎小管上皮中度空泡或水腫變性，見中度灶性壞死，中度灶性血紅蛋白或顆粒管 型。間質有輕度充血或炎細胞浸潤。HE X 200
圖4.受試藥(發酵菌粉提取物)高劑量組腎單位結構基本正常，腎小球血管輕度充血其內細胞未見增多，囊腔內未見血漿纖維蛋白滲出。腎小管上皮輕度空泡或水腫變 性，見輕度灶性壞死，輕度灶性血紅蛋白或顆粒管型。間質未見充血或炎細胞浸潤。HEX 200具體實施方式
以下實施例所用的中國被毛孢發酵菌粉通過市售得到，質量標準應達到中華人民 共和國藥典2010年一部第681-682頁《百令膠囊》項下要求。
實施例1.中國被毛孢發酵菌粉提取物的製備
中國被毛孢發酵菌粉lOOKg，加無離子水(其電導率為15 μ/cm)
lOOOKg，浸潤半小時後，在中藥提取罐中回流提取3小時，提取溫度95 100°C， 固液分離後得提取液-1。殘渣再加500Kg無離子水，在95 100°C下回流提取2小時，抽 濾後得提取液-2。合併提取液-1和提取液_2，在旋轉式薄膜真空器下減壓濃縮得濃縮液。 濃縮液的比密度為1. 04。將上述濃縮液，置零下18°C冷凍M小時，然後在冷凍乾燥機上冷 凍乾燥。冷阱溫度零下^°C，真空度30mtOr，乾燥M-36小時後即得中國被毛孢發酵菌 粉的水提取物20 30Kg，編號為HsW。
另取中國被毛孢發酵菌粉lOOKg，用90%醫用酒精取代無離子水，按上述提取、濃 縮和乾燥，得中國被毛孢發酵菌粉的醇提取物10 MKg，編號為HsE。
實施例2中國被毛孢發酵菌粉提取物和中國被毛孢發酵菌粉的檢測比較
將中國被毛孢發酵菌粉和實施例1製備的中國被毛孢發酵菌粉提取物(HsW)作蟲 草腺苷(以腺苷計)、蟲草酸(以甘露醇計)和蟲草多糖(以葡聚糖計)的比較測定。結果 提取物比發酵菌粉的含量分別提高6. 7,8. 6和3. 0倍。表1
將上述提取物再作農藥殘留和重金屬含量測定。結果本品未見農藥檢出，其重金 屬含量亦低於國際食品衛生限量標準。表2
用國家藥典委員會推薦的中藥指紋圖譜測定，本提取物的HPLC色譜峰和天然冬 蟲夏草的色譜峰基本疊合一致，兩者的相似率大於90%。圖1
表1.中國被毛孢發酵菌粉提取物(HsW)活性成分測定中國被毛孢發酵活性成分實施例1提取物_mm_
蟲草腺苷 mg/100g4.127.4蟲草酸 g/100g1.714.6蟲草多糖 g/100g7. 522. 7
表2.中國被毛孢發酵菌粉提取物(HsW)農藥殘留和重金屬含量測定
權利要求
1.一種中國被毛孢發酵菌粉提取物，其特徵在於，所述提取物為褐色粉末，能全溶於水 或乙醇；提取物的HPLC色譜峰和天然冬蟲夏草的疊合一致。
2.如權利要求1所述中國被毛孢發酵菌粉提取物的製備方法，其特徵在於，該提取物 的原料為中國被毛孢發酵菌粉；提取方法為先向原料加溶劑溼潤0. 5 1. 0小時，然後經回 流提取1 2次，每次提取時間為1 4小時，提取液通過離心或抽濾固液分離得提取液1 ； 殘渣再加溶劑回流提取，提取液通過離心或抽濾固液分離，得提取液2，合併提取液1和2， 經減壓濃縮得濃縮液，濃縮液再經乾燥得中國被毛孢發酵菌粉提取物。
3.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，所述溶劑為水或乙醇，溶劑的加量為原料中 國被毛孢發酵菌粉的重量配比為5 15倍w/w。
4.根據權利要求3所述方法，其特徵在於，所述溶劑水為無離子水，其電導率小於 20μ s/cm，提取溫度為95°C 100°C。
5.根據權利要求3所述方法，其特徵在於，所述溶劑乙醇為食用級，濃度為10% 90%，用乙醇提取的溫度為80°C 90°C。
6.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，所述分離提取液1後的固體殘渣用水或乙醇 再回流提取1 2次，每次提取時間為1 4小時，回流提取後固液分離得提取液2，合併提 取液1和2，減壓濃縮時的真空條件為0. 1 0. 09Mpa，溫度為60 80°C。
7.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，所述濃縮液的比密度為1.04 1. 10。
8.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，所述濃縮液經低溫冷凍乾燥或噴霧乾燥得 提取物。
9.如權利要求1所述中國被毛孢發酵菌粉提取物在製備預防和治療腎衰竭藥物中的應用。
10.根據權利要求9所述應用，其特徵在於，所述藥物為中國被毛孢發酵菌粉提取物作 為活性成份與藥用輔料製成的顆粒劑，膠囊劑、片劑、口含片、口服液或酊劑。
全文摘要
本發明提供了一種中國被毛孢發酵菌粉提取物。本提取物的重金屬含量均低於國際食品衛生標準，也無農藥殘留，能全溶於水或乙醇，提取物也不含培養基殘渣，產品不易氧化產羶，保存期長。本提取物具有顯著的抗腎衰竭活性，0.2～1.0g/Kg劑量的提取物能顯著降低腎衰竭鼠的血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)含量，改善由慶大黴素導致的腎組織變性；逆轉由馬兜鈴酸導致的腎小管上皮細胞增殖抑制，下調腎衰竭關鍵因子(TGFβ1、TIMP-1、PAI-1、ET)的mRNA表達等功效，比中國被毛孢發酵菌粉高2～10倍，服用劑量可大大減小，便於患者應用，可用於腎衰竭疾病的預防和治療。本發明中國被毛孢發酵菌粉提取物可作為活性成份與藥用輔料製成顆粒劑，膠囊劑、片劑，也可製成口含片、口服液和酊劑等劑型。
文檔編號A23L1/28GK102038719SQ20101053057
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月3日 優先權日2010年11月3日
發明者楊慶堯 申請人:上海芝草生物技術有限公司