不含二硫鍵的鮭魚和鰻魚降鈣素類似物及其製備方法

2023-05-09 22:56:01 2

專利名稱：不含二硫鍵的鮭魚和鰻魚降鈣素類似物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及不含二硫鍵的鮭魚和鰻魚降鈣素類似物，製備它們的方法，及它們治療骨質疏鬆症、Paget’s症、骨痛、各種高血鈣症及與血鈣過高引起的有關疾病中的用途。
天然降鈣素能治療骨質疏鬆症，Paget’s症、骨痛、各種高血鈣症等。天然降鈣素都是由32個胺基酸殘基組成的單鏈多肽，目前已知的天然降鈣素包括人、豬、牛、雞、鼠、魚等動物的降鈣素。不同種屬的天然降鈣素其胺基酸殘基不同，但都包括由1，7位半胱氨酸形成的二硫鍵，C-端都是脯氨醯胺結構。在天然降鈣素中，以魚類(鮭、鰻)的活性最高，鮭魚降鈣素(Salmon calcitonin，sCT)和鰻魚降鈣素(Eel calcitonin，eCT)的活性約是人降鈣素(Human calcitonin，hCT)的30倍(Epand R M，Caulfield M P.Calcitonin and parathyroid hormone receptors，InComprehensive Medicinal Chemistry，Emmett J T，Ed；PergamonOxford；Vol.31023-1045，1990.)。
sCT和eCT的胺基酸序列如下Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-1 7Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2(sCT)32Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-1 7Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-
Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2(eCT)32天然降鈣素中1，7位Cys形成的二硫鍵對人、鼠等的降鈣素是活性必須基團，不含二硫鍵的hCT類似物基本沒有活性。但是二硫鍵對魚的降鈣素活性影響不大，例如用其它環取代sCT或eCT中的二硫環[Fujii，S，Yamamoto I，shimizu F，et al.Preparation of calcitonin derivatives andcalcium metabolism-improving agents.Eur Pat Apll EP 397，985(1990).]，以及用Cys(Acm)或Ala取代sCT或eCT中的1，7位Cys而形成的非環狀類似物[Orlowski R C，Epand R M，Stafford A R，et al.biologicallypotent analogues of salmon calcitonin which do not contain an N-terminaldisulfide bridged ring structure.Eur J Biochem，1987，162(2)399.]都保持活性。天然降鈣素的穩定性差，其中在溶液中的不穩定性與二硫鍵的不穩定性有關且天然降鈣素的來源也很有限。因此尋找合成簡單，成本低廉，穩定性好並同時具有與天然降鈣素活性基本相同的降鈣素類似物，是十分必要的。
本發明的目的是尋找易人工合成且保持有天然降鈣活性的降鈣素類似物。
本發明者經廣泛深入研究，現已發現具下面通式(I)的新降鈣素類似物，其不僅合成簡單，而且保持了與天然降鈣素基本相同的活性。本發明因此得以完成。
因此，本發明第一方面涉及的是新的不含二硫鍵的通式(I)sCT及eCT類似物。
AA1-(Ser)m-Asn-Leu-Ser-Thr-AA2-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-(Leu-Gln-Thr-Tyr)n-Pro-Arg-Thr-X-Y-Thr-Pro-NH2(I)
其中AA1，AA2可相同或不同且為選自Ala，Val，Leu，lle，Gly，Phe，Met，Trp的天然非極性胺基酸，條件是AA1和AA2不能同時為Ala；m，n＝0，1；X＝-Asn-Thr-Gly-Ser-或-Asp-Val-Gly-Ala-；Y為選自Gly，Ala，D-Ala，Sar的胺基酸殘基。其中在通式(I)中，主要是用一些天然非極性胺基酸殘基，如甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(lle)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)等取代天然sCT和eCT中1，7位的半胱氨酸(Cys)，形成不含二硫鍵的鮭魚和鰻魚的降鈣素類似物。新的通式(I)類似物的結構與現有的含二硫鍵及非環狀類似物相比，結構變化除了1，7位Cys殘基被取代外，30位的Gly殘基也可用Ala，D-Ala及Sar等取代，以改變C-端肽鍵的特性，有利於肽的酶穩定性。有些通式(I)中類似物由於缺失某些胺基酸殘基(Ser2，Leu19，Gln20，Thr21，Tyr22)，其胺基酸序列可縮短。
本發明第二方面涉及的是通式(I)降鈣素類似物的製備方法。該方法按固相合成方法進行。該方法包括採用固相合成方法以BHA或MBH作固相載體，胺基酸的α-氨基用Fmoc保護，首先將Fmoc-Pro與樹脂偶聯，然後通過DCC/HOBt複合縮合劑依次接肽，接肽完成後，先用TFA/TMSBr/苯甲硫醚混合試劑脫除側鏈保護基，再用HF把肽從BHA或MBHA樹脂上切下。
sCT及eCT的類似物都採用固相法(SPPS)合成。文獻報導中的CT類似物的合成一般是採用對甲基二苯甲基氨基樹脂(MBHA)或二苯甲基氨基樹脂(BHA)為固相載體，胺基酸的α-氨基用叔丁氧羰基(Boc)保護的合成路線，肽合成完後，一次用無水HF脫除側鏈保護基及把肽從樹脂上切下[Orlowski R C，Seyler J K，Stahl G L，et al.Analogs ofcalcitonin.US Pat 4,604,238(1986).]本發明合成方法中固相載體採用的是MBHA或BHA，胺基酸的α-氨基用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作保護基，一些胺基酸的側鏈基團用對酸敏感的保護基作保護，例如絲氨酸(Ser)，蘇氨酸(Thr)和纈氨酸(Tyr)的側鏈羥基，以及穀氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的側鏈羧基都用叔丁基(But)酯保護；賴氨酸(Lys)的ε-氨基用叔丁氧羰基(Boc)保護，組氨酸(His)的咪唑基用三苯甲基(Trt)保護；精氨酸(Arg)的側鏈胍基用4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺醯基(Mtr)保護。
胺基酸的縮合反應採用1-羥基苯並三氮唑(HOBt)活化酯方法完成，縮合是否完全通過茚三酮方法檢驗。
接肽完成後，首先和TFA/三甲基溴矽烷(TMSBr)/苯甲硫醚(8∶1.5∶2，v/v/v)處理全保護肽以脫除側鏈保護基，再用無水氟化氫(HF)把肽從樹脂上切下。
從樹脂上切下的肽粗品經冷凍乾燥後，先用葡聚糖凝膠色譜柱(Sephadex G-25)脫鹽，再用HPLC進一步純化。
本發明中的合成方法，特別是採用先脫除側鏈保護基再把肽從樹脂上切下的二步「脫保護/切除」方法，使合成的產物純度高，總產率提高很大。
本發明再一方面涉及的本發明通式(I)天然降鈣素類似物用於降低包括人等哺乳動物的血鈣濃度，及用於治療與哺乳動物中高血症有關的症狀或疾病，如骨質疏鬆症，Paget’s症及骨痛等。本發明式(I)降鈣素在實驗中顯示出在水溶液中良好的穩定性及良好的降鈣活性。表1是三個肽在大鼠體內測得的降鈣活性。
表1肽 降鈣活性(lU/mg) 降鈣活性95％可信度(lU/mg)sCT 4726 3418～6446[Val1，Ala7]sCT 4331 3114～5829[Val1，Ala7，Ala30]sCT 5053 4128～6191[Val1，Ala7，des19-22]sCT 3327 2454～4247在本說明書及權利要求書中，胺基酸及其它縮寫詞的縮寫如下說明Ser絲氨酸，Asn天門醯胺，Leu亮氨酸，Thr蘇氨酸Val纈氨酸，Gly甘氨酸，Lys賴氨酸，Gln穀氨醯胺Glu穀氨酸，His組氨酸，Tyr酪氨酸，Pro脯氨酸Arg精氨酸，Ile異亮氨酸，Phe苯丙氨酸，Met蛋氨酸Try色氨酸，Sar氮甲基甘氨酸或N-甲基甘氨酸(文中除表明為D-胺基酸外，其它胺基酸的構型都為L-構型)DCM二氯甲烷 DMFN，N-二甲基甲醯胺MeOH甲醇 TFA三氟乙酸 DIPEA二異丙基乙胺DCCN，N』-二環己基碳二亞胺 HoBt1-羥基苯駢三氮唑HPLC高效液相色譜 HF氟化氫 FAB-MS快原子轟擊質譜下面的實施例用來進一步說明本發明但不意味著對本發明有任何限制。
實施例1[Val1，Ala7]sCT的固相合成A.Fmoc-Pro與MBHA樹脂的連接1.0g MBHA樹脂(0.55mmol/g)放入肽反應器中，依次經過下列處理1.洗DCM，12ml，2×1分鐘。
2. 5％DIPEA/DMF，10m，2×5分鐘。
3.洗DMF，12ml，1分鐘；DCM，12ml，4×1分鐘。
4.加入556.7mg(1.65mmol)Fmoc-Pro，用8ml的DMF溶解，在0-5℃加入340.0mg(1.65mmol)DCC的4ml DCM溶液，在0-5℃反應1小時後，在室溫振搖6小時。
5.洗DMF，12ml，1分鐘；DCM/MeOH(1/1)，15ml，1分鐘；DCM，12ml，3×1分鐘。
6.加入2ml 5％DIPEA/DMF，1ml醋酐，8ml DCM，室溫反應2小時7.洗同上述3。B.固相接肽縮合反應A
1. 25％哌啶/DMF，8ml，2×15分鐘。
2.洗DMF，12ml，2×1分鐘；DCM，12nl，3×1分鐘。
3. 1.65mmol Fmoc保護胺基酸溶於8ml DMF，在0-5℃下加入223.0mg(1.65mmol)的HOBt，溶解後再加入340.0mg(1.65mmol)DCC溶於4ml DCM的溶液。以上混合溶液在0-5℃放置10分鐘，再於室溫放置10分鐘後，加入反應器中，在室溫振搖2小時。
4.洗DMF，12ml，1分鐘；DCM/MeOH(1/1)，12ml，1分鐘；DCM，12ml，3×1分鐘。
5.茚三酮檢測，若為陽性，繼續用縮合反應B縮合一次。
縮合反應B1. 0.8mmol Fmoc保護胺基酸溶於6ml DMF中，在0-5℃下加入108.0mg(0.8mmol)的HOBt，溶解後再加入165.0mg(0.8mmol)DCC溶於4ml DCM的溶液。以上混合溶液在0-5℃放置10分鐘，再於室溫放置10分鐘後，加入反應器中，在室溫振搖2小時。
2.同縮合反應A中4。
3.茚三酮檢測，若為陽性，繼續用縮合反應B再縮合一次。
表2是合成[Val1，Ala7]sCT所需的胺基酸及縮合反應類型表2胺基酸序號胺基酸 分子量 胺基酸用量 縮合mmol mg 反應32 Fmoc-L-Pro-MBHA 0.55 1000.031，27，25 Fmoc-L-Thr(But) 397.51.65 655.9A30，28 Fmoc-L-Gly297.31.65 490.5A29 Fmoc-L-Ser(But) 383.41.65 632.6A26 Fmoc-L-Asn354.41.65 584.8A24 Fmoc-L-Arg(Mtr).lPE 608.71.65 1000.0 A23 Fmoc-L-Pro337.41.65 556.7A22 Fmoc-L-Tyr(But)459.31.65757.8A0.80367.4B21，6Fmoc-L-Thr(But)397.51.65655.9A0.80318.0B20，14 Fmoc-L-Gln 368.41.65607.9A0.80294.7B19，16，12，9，4 Fmoc-L-Leu 353.41.65583.1A0.80282.7B18，11 Fmoc-L-Lys(Boc)468.61.65773.2A0.80374.9B17 Fmoc-L-His(Trt)619.71.651022.5 A0.80495.8B15 Fmoc-L-Glu(OBut) 425.51.65702.1A0.80340.4B13，5，2 Fmoc-L-Ser(But)383.41.65632.6A0.80306.7B10 Fmoc-L-Gly 297.31.65490.5A0.80237.8B8，1 Fmoc-L-Val 339.41.65560.0A0.80271.5B7Fmoc-L-Ala 311.31.65513.6A0.80249.0B3Fmoc-L-Asn 354.41.65584.7A0.80283.5BC.側鏈保護基的脫除接肽完成後，首先用25％的哌啶DMF溶液脫除N-端Fmoc基團，用DMF和DCM洗滌。在-5-0℃冷卻下加入冷至0℃的TFA/TMSBr/苯甲硫醚(8/1.5/2，v/v/v)混合溶液20-30ml，45分鐘後抽濾除去，依次用DCM，MeOH，DMF，DCM洗。D.肽從樹脂上的切下1.0g脫除側鏈保護基的樹脂，放入HF裂解器中，加入1ml苯甲醚，在-5-0℃下通入無水HF10-12ml，於0-5℃攪拌45分鐘後減壓抽去HF，用冷的無水乙醚洗。用30ml的20％醋酸分三次洗樹脂，再用水洗，合併醋酸與水的濾液，冷凍乾燥。E.肽的純化鑑定100mg經HF裂解下的粗肽，用5ml去離子水溶解，上Sephadex G-25柱(1.5×120cm)，用0.2N的醋酸洗脫。用紫外檢測，波長214nm。收集流出組分，冷凍乾燥。
以上純化的肽，再用反相HPLC方法純化分析鑑定[HPLC系統Waters 600E泵；C18柱(7u，8×250，大連物化所)；SP UV1000檢測儀，紫外波長214nm；SP Data-Getintegrator記錄儀；流動相A-0.1％TFA/H2O，B-70％CH3CN/H2O(0.1％TFA)，梯度B在20分鐘內由0％升至60％，10分鐘內再降至0％]。經HPLC純化的肽，經FAB-MS鑑定，分子離子峰為3398.5(M+1)，肽的理論分子量為3397.8。大鼠體內降鈣活性測定藥品劑量取7.2和18mU/100g的兩個劑量組，皮下注射給藥。用2.2法隨機及交叉實驗設計，每組10隻雄性大鼠，給藥前禁食17小時，給藥後1小時取血離心，取血清測定血鈣，比較供試品與標準品的血鈣下降程度，計算生物效價和可信限。具體實驗參照文獻[Findlay DM，MichelangeliVP，Orlowski RC.biological activities and receptor interactions of des-leu16salmon and des-phe16human calcitonin，Endocrinology，1983；1121288.錢德明，沈根全，柯若倫。用大鼠血鈣法測定降鈣素生物效價的探討，藥物分析雜誌，1994；4(3)30.]方法完成。結果見表1所示。
權利要求
1.結構為通式(I)的鮭魚和鰻魚降鈣素類似物AA1-(Ser)m-Asn-Leu-Ser-Thr-AA2-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-1 7Gln-Glu-Leu-His-Lys-(Leu-Gln-Thr-Tyr)n-Pro-Arg-Thr-X-Y-Thr-Pro-NH2(I)30其中AA1，AA2為選自Ala，Val，Leu，lle，Gly，Phe，Met，Trp的天然非極性胺基酸，條件是AA1和AA2不能同時為Ala，m，n＝0，1；X＝-Asn-Thr-Gly-Ser-或-Asp-Val-Gly-Ala-；Y為選自Gl，Ala，D-Ala，Sar的胺基酸殘基
2.製備權利要求1要求的通式(I)降鈣素類似物的方法，包括採用固相合成方法，以BHA或MBH為固相載體，胺基酸的α-氨基用Fmoc保護，首先將Fmoc-Pro與樹脂偶聯，然後通過DCC/HOBt複合縮合劑依次接肽，接肽完成後，先用TFA/TMSBr/苯甲硫醚混合試劑脫除側鏈保護基，再用HF把肽從BHA或MBHA樹脂上切下。
3.權利要求1的降鈣素類似物用於降低血鈣濃度。
4.權利要求1的降鈣素類似物用於治療骨質疏鬆症，Paget’s症，骨痛及各種高血鈣症等。
全文摘要
本發明涉及式(I)新的不含二硫鍵的鮭魚和鰻魚降鈣素類似物及其製備方法，其降低血鈣的作用以及用於治療骨質疏鬆症、Paget’s症、骨痛及各種高血鈣症等。
文檔編號A61K38/23GK1167114SQ97110848
公開日1997年12月10日 申請日期1997年4月30日 優先權日1997年4月30日
發明者楊彬, 丁振闓, 韓宗進, 董華進, 李必海, 馬秀英 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院毒物藥物研究所