一種檢測mthfr基因多態性的方法

2023-04-28 01:01:46 2

專利名稱：一種檢測mthfr基因多態性的方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及焦磷酸測序技術在基因多態性檢測方面的應用，具體涉及一種檢測MTHFR基因多態性的方法，還涉及一種MTHFR基因的擴增引物、檢測MTHFR基因多態性的測序引物及含有它們的試劑盒。
背景技術：
單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性。一般而言，SNP是指變異頻率大於1%的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每1000個鹼基就有一個SNP，人類基因組上的SNP總量大概是3 X IO6個。目前，SNP成為第三代遺傳標誌，其在疾病的早期風險性評估、早期診斷、預防和治療等各方面具有重要功能和應用價值。 MTHFR (亞甲基四氧葉酸還原酶)基因可編碼亞甲基四氫葉酸還原酶蛋白，該酶的主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸鹽。5-甲基四氫葉酸鹽可以進一步進入甲基傳遞通路，通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程間接地為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供甲基並且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一個比較低的水平。MTHFR基因存在多態性，可影響亞甲基四氫葉酸還原酶的活性和熱穩定性。MTHFR基因677位點的多態性可引起該酶的熱不穩定性增加，酶活性下降，導致血液中同型半胱氨酸濃度升高。目前國內外有關SNP檢測的技術研究已經非常廣泛，用於SNP檢測的主要方法如下(I) SSCP 技術即單鏈構象多態性檢測技術，是將經PCR擴增的目的片段在變性劑或低離子濃度下經高溫處理使之解鏈並保證在單鏈狀態下，然後在一定濃度的非變性聚丙烯醯胺凝膠中電泳。相同長度的單鏈DNA，可以因其順序或單個鹼基差異，所形成的空間構象就會不同，其在凝膠中泳動速度不一樣，從而顯示出帶型的差異。(2) RFLP 技術即限制性片段長度多態性分析技術，該方法的原理是鹼基的變異可導致已有酶切位點的消失或新的酶切位點的出現，從而引起不同個體在用同一限制性內切酶酶切時，DNA片段長度出現差異。(3) TaqMan 探針技術TaqMan探針技術是在常規PCR反應體系中加入一個突光標記探針,該探針的5』端和3』端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，若探針可以與模板完整退火，那麼Taq酶的5』 一 3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離，從而螢光監測系統可接收到螢光信號。(4)基因晶片技術
基因晶片技術的原理是將具有特定喊基序列的探針固定在特殊的載體上，待測基因經提取、螢光標記後，與固定好的探針進行雜交，最後根據螢光的強度和種類測出待測序列。(5) Sanger 測序技術Sanger測序技術原理是利用DNA聚合酶能夠以單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈。該酶能夠用2』，3』 一雙脫氧核苷三磷酸作底物並將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3』末端，從而終止其延伸反應。在含有模板、引物，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一種ddNTP反應管中，DNA聚合酶合成出一系列以ddNTP為3』末端的不同長度的新鏈，經電泳和放射自顯影后，能迅速地讀出DNA序列。其檢測過程包括質粒提取或PCR產物純化、模板質量鑑定、模板定量以及DNA測序反應。(6)焦磷酸測序技術隨著科技的發展，焦磷酸測序技術的應用為SNP的研究和臨床檢測提供了新的技`術平臺。焦磷酸測序技術是一項全新的DNA測序技術，該技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。該技術的原理是第I步測序引物與單鏈PCR產物模板結合，然後加入酶混合物(包括4種酶，DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、螢光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)和底物混合物(包括腺苷_5』 -磷醯硫酸(APS)和螢光素)；第2步向反應體系中加入dNTPs (每次只添加一種dNTP，包括dATP、dTTP、dCTP或dGTP)，如果該dNTP剛好能與模板鹼基配對，則其會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3』末端，同時釋放出等分子量的焦磷酸(PPi)。第3步在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP ;在螢光素酶的催化下，生成的ATP又可以和螢光素結合形成氧化螢光素，同時產生可見光。通過CCD攝像機即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低與合成的核苷酸鹼基數成正比。第4步反應體系中未結合的dNTPs和產生的ATP在雙磷酸酶的作用下發生降解。當降解完成時，另一種dNTP才會被添加到反應體系中。第5步dNTPs的添加是按照次序進行的。由於α-硫代脫氧三磷酸腺苷(dATPaS)能有效的被DNA聚合酶使用並且不會被螢光素酶識別，所以該系統中用dATPaS替代天然的dATP。隨著程序的持續進行，合成出互補的DNA鏈並且根據獲得的峰值圖即可確定DNA核苷酸序列。焦磷酸測序技術操作簡單快速、特異性好、靈敏度高、準確性高、通量高、檢測成本低，為單核苷酸多態性研究和臨床檢測提供了理想的技術平臺。本發明提供了一種利用焦磷酸測序技術進行MTHFR基因C677T多態性檢測的方法，並設計了特異性擴增引物和焦磷酸測序引物，該擴增引物能從基因組DNA中擴增MTHFR基因核酸片段。本發明的方法利用焦磷酸測序技術，對生物樣本中的MTHFR基因多態性進行檢測。

發明內容
本發明的第一方面提供一種檢測MTHFR基因多態性的方法，其包括以下步驟使用SEQ ID NO. I和/或SEQ ID NO. 2所示的擴增引物擴增MTHFR基因的擴增步驟。優選地，所述的引物對可以被生物素標記；進一步優選地，SEQ ID NO. I所示的引物被生物素標記。正向引物F :5，-TGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCC-3』 (SEQ IDNO. I)；反向引物R :5』-GATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATG-3』 (SEQ ID NO. 2)。本發明的檢測MTHFR基因多態性的方法，其進一步地可包括以下步驟(I)使用SEQ ID NO. I和/或SEQ ID NO. 2所示的擴增引物擴增MTHFR基因的擴增步驟；(2)將步驟(I)獲得的擴增產物變為單鏈DNA模板的步驟；(3)使用SEQ ID NO. 3所示的測序引物對步驟(2)獲得的單鏈DNA模板進行焦磷酸測序的步驟。`測序引物P :5』-GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG-3』 (SEQ ID NO. 3)在本發明的一個優選的實施方案中，所述的檢測MTHFR基因多態性的方法，其中所述的擴增條件為95°C預變性15min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共45個循環；72°C延伸IOmin。在本發明的另一個優選的實施方案中，所述的檢測MTHFR基因多態性的方法，其中，步驟(2)是將步驟(I)得到的擴增產物加入結合緩衝溶液和鏈黴親和素包被的磁珠，在室溫下孵育一定時間，優選15秒；與磁珠結合後的PCR產物在乙醇溶液(優選為70%乙醇溶液)中洗滌一定時間(優選洗滌5秒)、變性液(QIAGEN，貨號979007)中孵育一定時間(優選5秒)、洗脫液(QIAGEN，貨號979008)中孵育一定時間(優選10秒)，得到單鏈DNA模板；優選地，權利要求2的方法，其中，步驟(3)還包括以下步驟，將步驟(2)獲得的單鏈DNA模板轉入含有SEQ ID NO. 3所示的測序引物的退火緩衝液(QIAGEN，貨號979009)中，在合適的溫度條件下(例如80°C)孵育一定時間(例如2分鐘)，冷卻至室溫，得到單鏈測序模板；優選地，步驟(3)中進行焦磷酸測序時，按照以下鹼基分配順序進行焦磷酸測序反應TAGACTCTGCACGTA。在本發明的一個優選的實施方案中，本發明所述的檢測MTHFR基因多態性的方法，用於檢測MTHFR基因C677T的多態性；優選地，所述的MTHFR基因來源於人全血或人口腔上皮細胞。本發明的第二方面提供一種用於MTHFR基因擴增的引物對，其序列如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示，優選地，所述的引物對可以被生物素標記。本發明的第三方面提供一種用於檢測MTHFR基因多態性的測序引物，其序列如SEQ ID NO. 3 所示。SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的擴增引物、SEQ ID NO. 3所示的測序引物均可根據本領域的常規合成方法製備。本發明的實施例中用到上述引物由Invitrogen公司合成。本發明的第四方面提供一種基因擴增試劑盒，其中含有本發明第二方面所述的引物對。本發明的第五方面提供一種檢測試劑盒，其含有本發明第二方面所述的引物對，和本發明第三方面所述的測序引物，和任選的測序反應所需的其他試劑，優選的其他試劑為焦磷酸測序反應所需的試劑，例如焦磷酸測序反應所用的酶混合物(包括4種酶，DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、螢光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)、底物混合物(包括腺苷_5』 -磷醯硫酸(APS)和螢光素)等。本發明的第六方面提供本發明第二方面所述的引物對、或第三方面所述的測序引物、或第四方面所述的基因擴增試劑盒、或第五方面所述的檢測試劑盒的用途，在檢測MTHFR基因多態性中的用途；優選用於檢測MTHFR基因C677T的多態性；優選地，所述的MTHFR基因來源於人全血或人口腔上皮細胞。本發明的一個具體的實施方案中，所述的檢測MTHFR基因多態性的方法，其包括以下步驟a)採用常規方法提取基因組DNA，獲得基因組DNA提取液；
b) PCR擴增反應在PCR擴增反應體系中加入步驟a )中得到的基因組DNA提取液2uL進行PCR擴增，擴增體系包含特異性引物對SEQ ID No. I和SEQID No. 2 (Invitrogen公司合成)的反應濃度時 O. 2uM, 2 X PyroMark PCRMaster Mix 12. 5uL, IOXCoralLoad Concentrate 2. 5uL(Pyromark PCRKit，QIAGEN，貨號978703)，剩餘加水補足至25uL。PCR擴增條件為95°C預變性 15min，45 個循環(94°C變性 30s，60°C退火 30s，72。。延伸 30s)，72。。延伸 IOmin0c )單鏈測序模板製備將步驟b)中得到的擴增產物(15uL)加入結合緩衝溶液(40uL，購自QIAGEN，貨號979006)和鏈黴親和素包被的磁珠(3uL，購自GE Healthcare，貨號17-5113-01)，在室溫下孵育15秒；與磁珠結合後的PCR產物在70%乙醇溶液(IlOmL)中洗滌5秒、變性液(90mL，購自QIAGEN，貨號979007)中孵育5秒、洗脫液(llOmL，購自QIAGEN，貨號979008)中孵育10秒，上述擴增產物變為單鏈DNA模板。再將所述單鏈DNA模板轉入含有特異性的核苷酸測序引物(SEQID NO. 3所示的測序引物，O. 4uM)的退火緩衝液(40uL，購自QIAGEN，貨號979009)中，在80°C下孵育2分鐘，冷卻至室溫得到單鏈測序模板。d)確定鹼基分配順序為TAGACTCTGCACGTA。e)焦磷酸測序反應準備好焦磷酸測序反應所用的酶混合物、底物混合物及dNTPs(上述所用到的試劑均來自於試劑盒-Pyromark Gold Q96Reagents，QIAGEN公司，貨號972804)，加入試劑艙，將步驟c)中所得到的分離純化後的單鏈DNA模板放入焦磷酸測序儀，按照步驟d)中設計的鹼基分配順序進行焦磷酸測序反應。f)測序結果的分析確定儀器自動對測序數據進行分析，根據測序結果分析確定MTHFR基因677位點多態性類型。發明的有益效果本發明利用PCR擴增以及焦磷酸測序技術，對生物樣本中的MTHFR基因多態性進行檢測。本發明設計了特異性擴增引物和焦磷酸測序引物，該擴增引物能特異性地從基因組DNA中擴增MTHFR基因核酸片段，應用本發明設計的焦磷酸測序引物能夠使MTHFR基因多態性檢測更簡單快速。本發明的方法操作簡單快速，特異性好、靈敏度高、準確性高、通量高、檢測成本低，具有廣闊的應用前景。


圖1-1、圖1-2和圖1-3是實施例I中MTHFR基因質粒擴增產物的毛細管電泳檢測圖，其中圖1-1為野生型質粒擴增產物檢測結果；圖1-2為突變型質粒擴增產物檢測結果；圖1-3為野生型和突變型等比例混合質粒為模板的擴增產物檢測結果。圖1-4、圖1-5和圖1-6是實施例I中MTHFR基因質粒擴增產物的焦磷酸測序圖，其中圖1-4為野生型質粒焦磷酸測序圖；圖1-5為突變型質粒焦磷酸測序圖；圖1-6為野生型和突變型等比例混合質粒的焦磷酸測序圖。 圖2-1、圖2-2和圖2-3是實施例2中對全血樣本進行檢測的焦磷酸測序圖。圖3-1、圖3-2和圖3-3是實施例3中對口腔上皮細胞樣本進行檢測的焦磷酸測序圖。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例IMTHFR基因質粒序列的測定步驟a)質粒的構建質粒構建工作由TAKARA公司完成，所用載體為pMD18_T載體(購自TAKARA，貨號 D101A)。該質粒插入序列為 MTHFR 基因(NCBIReference Sequence:NC_000001. 10)從9601 -10000位點的序列片段。其中野生型質粒含MTHFR基因677C序列，突變型質粒含MTHFR基因677T序列。步驟b)質粒提取採用QIAGEN Plasmid Mini Kit (購自 QIAGEN，貨號 12123)進行質粒 DNA 的提取，具體操作步驟參照廠家說明書。步驟c)基因片段擴增採用PyroMark PCR Kit (購自 QIAGEN，貨號 978703)在 GeiieAmp PCRSystem 9700 (AB)上進行基因片段的擴增。擴增體系如下特異性擴增引物F (SEQ IDNo. I)和 R (SEQ ID No. 2)的工作濃度為 O. 2uM，2XPyroMark PCR Master Mix 12. 5uL,10 X CoralLoadConcentrate 2. 5uL,取上述步驟b)提取的質粒2uL作為模板,加ddH20補足至總體積25uL。擴增程序如下95°C預變性15min，45個循環(94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 30s)，72°C延伸 IOmin0所述特異性擴增弓I物的鹼基序列為正向引物F :5』-TGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCC-3』 (SEQ IDNo. I)；
反向引物R :5』 -GATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCATG-3』 (SEQ ID No. 2)，其中SEQ ID No. I為生物素標記的引物，生物素標記於引物的5』端。上述SEQ ID No. I和SEQID No. 2所示的引物委託Invitrogen公司合成。經過上述擴增得到PCR擴增產物，將得到的PCR擴增產物使用QIAxcel System(QIAGEN)和 QIAxcel DNA High Resolution Kit (購自 QIAGEN，貨號 929002)進行毛細管電泳檢測，野生型質粒的擴增產物電泳檢測結果如圖1-1所示；突變型質粒的擴增產物電泳檢測結果如圖1-2所示；野生型和突變型等比例混合質粒為模板的擴增產物電泳檢測結果如圖1-3所示。從圖1-1、圖1-2和圖1-3可以看出(其中A\B\C所示位置分別為目的條帶所在位置)，野生型質粒、突變型質粒以及野生型和突變型等比例混合質粒為模板的三個擴增體系中均可得到單一目的條帶，且無非特異性擴增產物，滿足焦磷酸測序要求。步驟d)單鏈模板的製備單鏈模板製備使用PyroMark Q96 Vaccum Station (購自QIAGEN)完成,具體操作按照說明書進行，所有試劑的用量按說明書的推薦用量，即將步驟c)擴增所得PCR擴增產·物(15uL)，加入結合緩衝溶液(40uL，購自QIAGEN，貨號979006)和鏈黴親和素包被的磁珠(3uL，購自GE Healthcare，貨號17-5113-01)，在室溫下孵育15秒；PCR擴增產物通過標記的生物素與鏈黴親和素包被的磁珠結合，與磁珠結合後的PCR產物在70%乙醇溶液(IlOmL)中洗滌5秒、變性液(90mL，購自QIAGEN，貨號979007)中孵育5秒、洗脫液(IlOmL,購自QIAGEN,貨號979008)中孵育10秒，上述擴增產物變為單鏈DNA模板。再將所述單鏈DNA模板轉入含有測序引物(工作濃度為O. 4uM)的退火緩衝液(40uL，購自QIAGEN，貨號979009)中，在80°C下孵育2分鐘，冷卻至室溫得到單鏈DNA模板。其中所述的測序引物的鹼基序列為P :5』-GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG-3』 (SEQID No. 3),委託 Invitrogen 公司合成。步驟e )鹼基分配順序打開PYROMARK ID軟體，點擊Simple Entries,將引物設計軟體中所保存的本實驗的引物目錄引入，程序即可自動生成一個Dispensation Order和預期的焦磷酸序列圖(Pyrogram)0確定鹼基分配順序為TAGACTCTGCACGTA。步驟f)焦磷酸測序反應測序反應在PYROMARK Q96ID (QIAGEN)儀器的SNP模式下進行。測序所用到的試劑均來自於試劑盒-Pyromark Gold Q96Reagents，購自QIAGEN公司，貨號972804。將焦磷酸測序反應所用的酶混合物、底物混合物及dNTPs，加入試劑艙，將步驟d)中所得到的單鏈DNA模板放入焦磷酸測序儀，按照步驟e)中設計的鹼基分配順序進行焦磷酸測序反應。引物鏈隨著不同dNTPs的加入而延伸，伴隨酶促反應的進行，CCD攝像機檢測到發出的螢光信號，焦磷酸測序圖譜見圖1-4、圖1-5和圖1-6。步驟g)測序結果的分析確定野生型質粒的焦磷酸測序結果如圖1-4所示，其測得的序列為GCTCCC(反向)，儀器根據峰圖判定其MTHFR基因677位點基因型為CC，與該野生型質粒的預期測序結果一致；突變型質粒的焦磷酸測序結果如圖1-5所示，其測得的序列為ACTCCC(反向)，儀器根據峰圖判定其MTHFR基因677位點基因型為TT，與該突變型質粒的預期測序結果一致；野生型和突變型等比例混合質粒的焦磷酸測序結果如圖1-6所示，其測得的序列為[A/G] CTCCC (反向)，儀器根據峰圖判定其MTHFR基因677位點基因型為CT，與該混合質粒的預期測序結果一致。實施例2全血樣本的檢測採用DNeasy Blood&Tissue Kit (購自QIAGEN，貨號69504)進行全血樣本(全血樣本1、2和3均來自臨床採集的樣本)的基因組DNA提取，具體操作步驟參照廠家說明書，獲得DNA提取液。MTHFR基因片段的擴增、單鏈模板的製備、鹼基分配順序、焦磷酸測序反應以及測序結果的分析確定同實施例I中的各步驟。樣本I的焦磷酸測序結果如圖2-1所示，測得序列為GCTCCC (反向)，儀器根據峰圖判定其MTHFR基因677位點基因型為CC (純和野生型)；
樣本2的焦磷酸測序結果如圖2-2所示，測得序列為ACTCCC (反向)，儀器根據峰圖判定其MTHFR基因677位點基因型為TT (純和突變型)；樣本3的焦磷酸測序結果如圖2-3所示，測得序列為[A/G]CTCCC (反向)，儀器根據峰圖判定其MTHFR基因677位點基因型為CT (雜合突變型)。實施例3 口腔上皮細胞樣本的檢測用C,.丨IiIfgeSw丨tch gDNA Normalized Buccal Cell Kit (購自 Invitrogen,貨號CSl 1020)進行口腔上皮細胞樣本(口腔上皮細胞樣本樣本4、5和6均來自臨床採集的樣本)基因組DNA提取，具體操作參照廠家說明書，獲得DNA提取液。MTHFR基因片段的擴增、單鏈模板的製備、鹼基分配順序、焦磷酸測序反應以及測序結果的分析確定同實施例I中的各步驟。樣本4的焦磷酸測序結果如圖3-1所示，測得序列為GCTCCC (反向)，儀器根據峰圖判定其MTHFR基因677位點基因型為CC (純和野生型)；樣本5的焦磷酸測序結果如圖3-2所示，測得序列為ACTCCC (反向)，儀器根據峰圖判定其MTHFR基因677位點基因型為TT (純和突變型)；樣本6的焦磷酸測序結果如圖3-3所示，測得序列為[A/G]CTCCC (反向)，儀器根據峰圖判定其MTHFR基因677位點基因型為CT (雜合突變型)。
權利要求
1.一種檢測MTHFR基因多態性的方法，其包括以下步驟 使用SEQ ID NO. I和/或SEQ ID NO. 2所示的擴增引物擴增MTHFR基因的擴增步驟，優選地，所述的引物對可以被生物素標記。
2.一種檢測MTHFR基因多態性的方法，其包括以下步驟 (1)使用SEQID NO. I和/或SEQ ID NO. 2所示的擴增引物擴增MTHFR基因的擴增步驟； (2)將步驟(I)獲得的擴增產物變為單鏈DNA模板的步驟； (3)使用SEQID NO. 3所示的測序引物對步驟(2)獲得的單鏈DNA模板進行焦磷酸測序的步驟。
3.權利要求I或2的方法，其中所述的擴增條件為95°C預變性15min;94°C變性30s，60°C退火30s，72。。延伸30s，共45個循環；72°C延伸IOmin0
4.權利要求I或2的方法，該方法用於檢測MTHFR基因C677T的多態性；優選地，所述的MTHFR基因來源於人全血或人口腔上皮細胞。
5.權利要求2的方法，其中，步驟(2)是將步驟(I)得到的擴增產物加入結合緩衝溶液和鏈黴親和素包被的磁珠，在室溫下孵育一定時間，優選15秒；與磁珠結合後的PCR產物在乙醇溶液(優選為70%乙醇溶液)中洗滌一定時間(優選洗滌5秒)、變性液中孵育一定時間(優選5秒)、洗脫液中孵育一定時間(優選10秒)，得到單鏈DNA模板； 優選地，權利要求2的方法，其中，步驟(3)還包括以下步驟， 將步驟(2)獲得的單鏈DNA模板轉入含有SEQ ID NO. 3所示的測序引物的退火緩衝液中，在合適的溫度條件下(例如80°C)孵育一定時間(例如2分鐘)，冷卻至室溫，得到單鏈測序模板； 優選地，步驟(3)中進行焦磷酸測序時，按照以下鹼基分配順序進行焦磷酸測序反應TAGACTCTGCACGTA。
6.用於MTHFR基因擴增的引物對，其序列如SEQID NO. I和SEQID NO. 2所示;優選地，所述的引物對可以被生物素標記；進一步優選地，SEQ ID NO. I所示的引物被生物素標記。
7.用於檢測MTHFR基因多態性的測序引物，其序列如SEQIDNO. 3所示。
8.—種基因擴增試劑盒，其中含有權利要求7的引物對，和任選的擴增所需的其他試劑。
9.一種檢測試劑盒,其含有權利要求7的引物對，和權利要求8所述的測序引物，和任選的測序反應所需的其他試劑，優選的其他試劑為焦磷酸測序反應所需的試劑。
10.權利要求6的引物對、或權利要求7的測序引物、或權利要求8的基因擴增試劑盒、或權利要求9的檢測試劑盒的用途，在檢測MTHFR基因多態性中的用途；優選用於檢測MTHFR基因C677T的多態性；優選地，所述的MTHFR基因來源於人全血或人口腔上皮細胞。
全文摘要
本發明涉及焦磷酸測序技術在基因多態性檢測方面的應用，具體涉及一種檢測MTHFR基因多態性的方法，還涉及一種MTHFR基因的擴增引物、檢測MTHFR基因多態性的測序引物及含有它們的試劑盒。本發明提供的方法操作簡單快速，特異性好、靈敏度高、準確性高、通量高、檢測成本低，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102943120SQ20121052770
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月10日 優先權日2012年12月10日
發明者劉建雲 申請人:北京明諦生物醫藥科技有限公司