具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法
2023-04-28 01:49:41 2
專利名稱：具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法
技術領域：
本發明涉及用於光動力治療的光敏劑領域，特別是涉及一種具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法。
背景技術：
光動力治療(Photodynamic therapy,F1DT)是最具潛力的癌症治療模式之一，因為它不但是一種非侵入型的技術，同時具有癌症治療的高選擇性。光動力學治療利用對病灶位置進行光照，通過光敏劑的能量轉換，生成對疾病細胞具有殺傷作用的單線態氧。因此，單線態氧的生成量是衡量光敏劑效率的一個關鍵指標。另一方面，由於光動力治療是一種外部刺激作用下的治療方式，光照治療前的精確診斷和定位是必不可少的。有趣的是，大部分的光敏劑具有螢光成像的潛力，作為一種優異的成像模式，螢光成像整合的診療(Theranostic)已經得到大量的研究，因為螢光成像具有非常高的時間和空間解析度，有利於手術操作中的精確指導。因此，螢光成像介導的光動力治療在提高抗癌療效方面具有非常大的研究意義和實際應用潛力。目前，卟啉是最普遍應用的光敏劑，但是，大部分的卟啉分子在生物體液環境中容易發生嚴重的聚集，引起螢光 淬滅，同時導致光敏劑更少的被激活，減少了單線態氧的生成，從而限制了光敏劑實際應用中的診斷和治療效果。為了解決這個問題，大量研究聚焦於將光敏劑摻雜並穩定在有機納米基質中，但是這些基質本身是惰性的，僅僅起到分散光敏劑分子減少自淬滅的作用，另外，基於這種惰性基質的光敏劑納米粒子為了達到有效的抗癌療效需要更高的光敏劑濃度，因為惰性基質下的光敏劑產生的單線態氧的量是有限制的。因此，為了應對這些挑戰，試圖發展一種光活化的光敏劑，這樣能在較低光敏劑濃度的前提下，產生更多的單線態氧，從而增強光動力療效。根據現有的知識，本申請提出一種在摻雜的前提下，進一步利用可光活化的基質作為突光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)的給體及同時作為天線吸取更多的光能並轉移給光敏劑的方法。一方面，螢光共振能量轉移(FRET)是一種通過給體和受體之間的能量傳遞實現提高受體發光效率的有效方式，它被廣泛的應用於設計高效的螢光納米粒子以用於生物成像領域，但是很少用於光動力治療領域。另一方面，天線效應也越來越多地被應用到增強螢光發射上，但據現有技術，目前還沒有研究將天線效應應用到光動力治療領域。綜上所述，一種理想的診療一體化的光敏劑摻雜的納米粒子應該是具有光活化的染料作為基質，它不僅可以作為捕獲更多吸收光的天線，同時可以將捕獲的這些光能通過FRET效應傳遞給光敏劑，這樣一種納米粒子將會具有高的單線態氧產量用於光動力治療，同時具有高的螢光強度用於診斷成像。因此，通過這種光敏劑摻雜的手段實現同時增強螢光成像診斷和光動力治療的療效，為將來設計出具有高單線態氧產量及高效的螢光成像引導的PDT治療提供一種有效的策略。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法，該方法簡單易行，可製備出作為優異的診療一體化的納米粒子應用於癌症治療。本發明採用的技術方案是提供一種具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法，該方法包括如下步驟I)配置一定濃度的卟啉類化合物的有機溶劑溶液A ;2)配置一定濃度的二萘嵌苯或芘的有機溶劑溶液B ；3)將上 述溶液A和溶液B以一定摻雜比例混合得到溶液C ；4)將一定量的溶液C逐滴加入水中，以超聲1000-1500轉/分鐘速率攪拌5-10分鐘，得到含有納米粒子的水溶液D。優選地，步驟I)中所述卟啉類化合物為5，10, 15，20-四(4-吡啶)卟啉或四取代
苯基P卜琳。優選地，步驟I)和步驟2)中所述的有機溶劑為四氫呋喃、丙酮。優選地，步驟I)和步驟2)中所述一定濃度為ImM-IOmM ;優選地，所述一定濃度為6mM0優選地，步驟3)中所述的一定摻雜比例指溶液A與溶液B的體積比為0.05 :100-5:100 ;優選地，一定摻雜比例為O. 2:100。優選地，步驟4)所述的一定量為100 μ 1-300 μ I ;優選地一定量為200 μ I ;所述水為高純水，用量為5-20ml，優選用量為5ml。本發明所述高純水指去離子水，即化學純度極高的水,其中的雜質的含量小於
O.lmg/L,也就是指經過純水系統設備過濾的水。 本發明的效果是本發明提供了一種通過結合摻雜、螢光共振能量轉移和天線效應等多種優勢，製備出可同時增強螢光成像診斷和光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的方法。該方法簡單易行。由於在該方法中使用了光活化的染料分子(即具有大的摩爾吸收係數，可以吸收光能並傳遞給光敏劑的分子)作為基質，因而具有以下優勢1、光活化基質可分散光敏劑，防止其自淬滅，以增強螢光發射；2、通過FRET效應將能量從二萘嵌苯轉移到光敏劑，以獲得更高的螢光增強；3、作為捕獲光能的天線，二萘嵌苯具有較高的摩爾消光係數，能更多的吸收光能，用以激發光敏劑。4、摻雜納米粒子在暗條件下，螢光發射很弱，且幾乎不產生單線態氧，但是在光照後，能發射很強的紅色螢光，且能產生大量單線態氧，具有光毒性，說明其具有很好的選擇性。5、如表所示，通過細胞實驗證實該摻雜粒子可很好的進入細胞，同時在細胞環境中具有很高的單線態氧產量及很強的螢光強度，說明其可作為優異的診療一體化納米粒子用於癌症治療。
圖I為製備的5，10, 15，20-四(4-吡啶)卟啉光敏劑摻雜納米粒子的掃描電子顯微鏡(SEM)示意圖A、透射電子顯微鏡(TEM)示意圖B、動態光散射(DLS)圖C ；圖2為製備的5，10，15，20-四(4_吡啶)葉啉光敏劑摻雜的納米粒子與純的光敏劑納米粒子及純的二萘嵌苯納米粒子的單線態氧檢測結果對比的電子自旋共振(ESR)譜圖；圖3為製備的5，10，15，20-四(4-吡啶)卟啉光敏劑摻雜的納米粒子的細胞成像(Confocal)照片；圖4為製備的5，10，15，20-四(4-吡啶)卟啉光敏劑摻雜的納米粒子與沒有摻雜的純光敏劑分子及純二萘嵌苯納米粒子的Hela細胞的活力實驗(MTT)對比；圖5為製備的5，10，15，20-四(4-吡啶)卟啉光敏劑摻雜的納米粒子光照前後的Hela細胞的活力實驗(MTT)對比。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明進一步加以說明。實施例1I)配置6mM濃度的5，10，15，20-四(4_吡啶)卟啉的四氫呋喃溶液；2)配置6mM濃度的二萘嵌苯的四氫呋喃溶液； 3)將步驟I)和步驟2)中的溶液按體積比為0.2:100的比例混合到IOml的茶容
量瓶中；
4)取200 μ I步驟3)中的混合溶液加入到已裝有5ml高純水的圓底燒瓶中，以超聲1200轉/分鐘攪拌5分鐘，得到最終含有納米粒子的水溶液。實施例2I)配置6mM濃度的四取代苯基卟啉的四氫呋喃溶液；2)配置6mM濃度的二萘嵌苯的四氫呋喃溶液；3)將步驟I)和步驟2)中的溶液按體積比為0.2:100的比例混合到IOml的茶容
量瓶中；4)取150 μ I步驟3)中的混合溶液加入到已裝有5ml高純水的圓底燒瓶中，以超聲1400轉/分鐘攪拌8分鐘，得到最終含有納米粒子的水溶液。實施例3I)配置6mM濃度的5，10，15，20-四(4_吡啶)卟啉的四氫呋喃溶液；2)配置6mM濃度的芘的丙酮溶液；3)將步驟I)和步驟2)中的溶液按體積比為0.2:100的比例混合到IOml的茶容
量瓶中；4)取300 μ I步驟3)中的混合溶液加入到已裝有5ml高純水的圓底燒瓶中，以超聲1500轉/分鐘攪拌10分鐘，得到最終含有納米粒子的水溶液。實施例4I)配置6mM濃度的四取代苯基卟啉的四氫呋喃溶液；2)配置6mM濃度的芘的丙酮溶液；3)將步驟I)和步驟2)中的溶液按體積比為0.2:100的比例混合到IOml的茶容
量瓶中；4)取200 μ I步驟3)中的混合溶液加入到已裝有5ml高純水的圓底燒瓶中，以超聲1300轉/分鐘攪拌5分鐘，得到最終含有納米粒子的水溶液。圖1是對製備得到的5，10, 15，20-四(4-吡啶)卟啉光敏劑摻雜的納米粒子進行表徵。從圖1可以看出摻雜納米粒子呈均勻的球形顆粒，經動態光散射測得納米粒子的尺寸在 91.8nm。圖2是對光敏劑5，10, 15，20-四(4-吡啶)葉啉摻雜的納米粒子、純光敏劑納米粒子、純二萘嵌苯納米粒子進行單線態氧生成的定性定量比較，可以得出本發明中所闡述的摻雜型的納米粒子具有最高的單線態氧生成量。圖3是將光敏劑5，10，15，20-四(4_吡啶)葉啉摻雜的納米粒子加入到Hela細胞中，在培養箱中培養一段時間，滴加到載玻片上，再用雷射共聚焦顯微鏡觀察，可看到該發明中的納米粒子可很好的進入到細胞，並在細胞環境中發出螢光。圖4及圖5是用MTT法檢測細胞活力，MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan )並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。用該方法得到的數據可看出，與純光敏劑納米粒子、純二萘嵌苯納米粒子對比，光敏劑5，10，15，20-四(4-吡啶)葉啉摻雜的二萘嵌苯納米粒子在光照之後具有更大的細胞毒性，即能很好的殺 死癌細胞。
權利要求
1.一種具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: 1)配置一定濃度的卟啉類化合物的有機溶劑溶液A ; 2)配置一定濃度的二萘嵌苯或芘的有機溶劑溶液B; 3)將上述溶液A和溶液B以一定摻雜比例混合得到溶液C； 4)將一定量的溶液C逐滴加入水中，以超聲1000-1500轉/分鐘速率攪拌5-10分鐘，得到含有納米粒子的水溶液D。
2.根據權利要求1所述的具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法，其特徵在於:步驟I)中所述卟啉類化合物為.5，10, 15，20-四(4-吡啶)卟啉或四取代苯基卟啉。
3.根據權利要求1所述的具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法，其特徵在於:步驟I)和步驟2)中所述的有機溶劑為四氫呋喃、丙酮。
4.根據權利要求1所述的具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法，其特徵在於:步驟I)和步驟2)中所述一定濃度為ImM-1OmM ;優選地，所述一定濃度為6mM。
5.根據權利要求1所述的具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法，其特徵在於:步驟3)中所述的一定摻雜比例指溶液A與溶液B的體積比為0.05:100-5:100 ;優選地一定摻雜比例為溶液A與溶液B的體積比為.0.2:100。
6.權利要求1所述的具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法，其特徵在於:步驟4)所述的一定量為100 μ 1-300 μ I ;優選地一定量為200 μ I ;所述水為高純水，用量為5-20ml，優選用量為5ml。
全文摘要
本發明公開了一種具有螢光共振能量轉移及天線效應的用於光動力治療的光敏劑摻雜納米粒子的製備方法，該方法包括如下步驟1)配置一定濃度的卟啉類化合物的有機溶劑溶液A；2)配置一定濃度的二萘嵌苯或芘的有機溶劑溶液B；3)將上述溶液A和溶液B以一定摻雜比例混合得到溶液C；4)將一定量的溶液C逐滴加入水中，劇烈攪拌，得到最終溶液D，即含有納米粒子的水溶液。該方法簡單易行，可製備出作為優異的診療一體化的納米粒子應用於癌症治療。
文檔編號A61K41/00GK103212074SQ20131013166
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月16日 優先權日2013年4月16日
發明者張曉宏, 張金鳳, 安菲菲 申請人:中國科學院理化技術研究所