一種聯合蘋果愈傷組織細胞培養和遺傳轉化鑑定蘋果抗病基因的方法與流程

2023-04-28 06:19:51

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種聯合蘋果愈傷組織細胞培養和遺傳轉化鑑定蘋果抗病基因的方法。

背景技術：

蘋果是世界四大水果之一，我國是世界上最大的蘋果生產和消費國，面積和產量均居世界首位。以蘋果輪紋病為代表的真菌病害，是嚴重製約我國蘋果產業優質高效發展的重要病害。以輪紋病為例，該病由致病真菌Botryosphaeria dothidea引起，其危害主要表現兩個方面：(一)侵染枝幹，導致樹體衰弱，造成蘋果產量與品質下降；嚴重時導致樹體死亡；(二)在果實成熟期和採後儲藏期，侵染果實，導致果實迅速腐爛，失去食用價值。目前，生產上主要採用刮樹皮、噴施與塗抹石硫合劑、多菌靈與禁用農藥福美胂等來防治枝幹輪紋病(國立耘等，2009)。對果實則採用套袋技術。雖然每年為防治輪紋病要耗費大量人力物力，但因輪紋病造成的爛果仍佔20％左右，損失巨大(張高雷等，2011)。因此，培育、推廣與主栽抗病品種是有效應對輪紋病等真菌病害的當務之急，長遠來看，也是實現蘋果產業綠色、環保與高效發展的必由之路。

而抗病基因的挖掘和鑑定，是充分挖掘與利用抗病基因潛能，進行抗病品種培育的理論基礎。近年來，蘋果基因組測序、重測序、深度測序以及相關組學等方面的研究取得了很大進展，為理解蘋果基因組的基因構成與表達提供了宏大的信息量，但對於蘋果基因功能的研究仍然受制於蘋果生長周期長、轉化難、童期長等生物學特徵。與擬南芥、水稻、菸草等模式植物相比，所鑑定的蘋果抗病基因的數量仍然非常少。這已然成為蘋果抗病分子機制研究與抗病育種研究的一個巨大障礙和技術瓶頸。在目前的研究中，研究者普遍借用模式植物轉化體系，將蘋果基因作為外源基因導入菸草、擬南芥等模式植物，這種研究路線在某種程度上可以對蘋果基因的功能進行注釋和研究，但這種策略抹殺了物種特異性，對問題的揭示具有很大的局限性。目前，國內外的研究科學家已經開始注重創製轉基因蘋果材料，並取得了一定進展。但仍然不可避免蘋果生長周期長、轉化難這一異於模式植物的主要制約因素。而且，由於蘋果高度雜合，基因功能冗餘以及生物學上的自交不親和，也很難通過突變體篩選來鑑定蘋果的抗病基因。因此，尋找一種高效的進行蘋果抗病基因鑑定與篩選的方法，對於目前蘋果抗病功能基因的研究尤為必要。

技術實現要素：

本發明的一個目的是提供一種鑑定目的基因為蘋果抗病相關基因的方法。

本發明提供的方法，為利用蘋果愈傷組織作為轉化受體，鑑定目的基因是否為蘋果抗病相關基因。

上述方法中，

所述方法包括如下步驟：

1)提高或沉默所述蘋果愈傷組織中目的基因的表達，得到轉目的基因愈傷組織細胞或沉默目的基因愈傷組織細胞；

2)將所述轉目的基因愈傷組織細胞或所述沉默目的基因愈傷組織細胞、和所述蘋果愈傷組織細胞分別接種引發蘋果發病的某種病原菌，得到接種後轉目的基因愈傷組織細胞、接種後沉默目的基因愈傷組織細胞和接種後蘋果愈傷組織細胞；

觀察抗病力，若所述接種後轉目的基因愈傷組織細胞或所述接種後沉默目的基因愈傷組織細胞與所述接種後蘋果愈傷組織細胞的抗病力有顯著差異，則目的基因為或候選為蘋果抗該病原菌引發病相關基因；若所述接種後轉目的基因愈傷組織細胞或所述接種後沉默目的基因愈傷組織細胞與所述接種後蘋果愈傷組織細胞的抗病力無顯著差異，則目的基因不為或候選不為蘋果抗該病原菌引發病相關基因。

顯著差異為如下：

若所述接種後轉目的基因愈傷組織細胞的抗病力顯著小於所述接種後蘋果愈傷組織，則所述目的基因為或候選為蘋果抗該病原菌的基因；

若所述接種後沉默目的基因愈傷組織細胞的抗病力顯著大於所述接種後蘋果愈傷組織，則所述目的基因為或候選為與蘋果抗該病原菌相關的基因；

上述方法中，

所述提高蘋果愈傷組織中目的基因的表達為將目的基因導入蘋果愈傷組織；

或，所述沉默蘋果愈傷組織中目的基因的表達為將幹擾所述目的基因表達的物質導入蘋果愈傷組織；

或，所述蘋果愈傷組織為蘋果葉片愈傷組織；

或，所述病為蘋果輪紋病；

或，所述病原菌為蘋果輪紋病病菌。

蘋果愈傷組織在鑑定目的基因是否為蘋果抗病相關基因中的應用也是本發明保護的範圍。

或蘋果愈傷組織在培育抗病性蘋果愈傷組織或抗病性蘋果中的應用也是本發明保護的範圍。

上述中，所述目的基因為序列2所示的蛋白的編碼基因或序列4所示的蛋白的編碼基因或序列6所示的蛋白的編碼基因；

所述幹擾序列2所示的蛋白的編碼基因表達的物質為序列7所示的核苷酸或者表達序列7所示核苷酸的重組載體。

本發明另一個目的是提供一種蛋白。

本發明提供的蛋白，是如下(1)或(2)或(3)：

(1)由序列表中序列4或序列6所示的胺基酸序列組成的蛋白質；

(2)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；

(3)將序列2或序列4或序列6的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與(1)具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白質。

編碼上述蛋白的DNA分子也是本發明保護的範圍。

本發明第三個目的是提供一種DNA分子。

本發明提供的DNA分子，為如下1)-4)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列3或序列5所示的DNA分子；

2)序列表中序列1所示的DNA分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且具有相同功能的由1)或2)衍生的蛋白質的DNA分子；

4)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同一性，且具有相同功能的由序列1或序列3或序列5衍生的DNA分子。

含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組微生物也是本發明保護的範圍；

或上述蛋白或上述DNA分子或上述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組微生物在調控植物抗病性中的應用也是本發明保護的範圍；

或上述蛋白或上述DNA分子或權上述的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組微生物在培育抗病性植物愈傷組織或抗病性植物中的應用也是本發明保護的範圍。

上述中，

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，

或所述雙子葉植物為蘋果；

或所述病為蘋果輪紋病；

或所述病原菌為蘋果輪紋病病菌。

本發明的實驗證明，本發明利用蘋果愈傷組織轉化進行蘋果抗病基因功能鑑定，克服了蘋果植株轉化周期長、轉化難等在開展蘋果抗病基因功能研究中的技術壁壘，大大提高了蘋果抗病基因的篩選效率，為篩選與鑑定蘋果抗病基因提供了一個高效、簡易的方法，使蘋果重要抗病基因的發掘成為可能。該方法具有高效、易行、耗時短的特點，它為蘋果抗病基因的篩選鑑定與蘋果抗病基因作用機制的深入研究奠定了基礎和可能。

附圖說明

圖1為MdSYP121基因的克隆。

圖2為MdSYP121基因沉默蘋果細胞系及MdSYP121超表達蘋果細胞系的分子和蛋白水平鑑定。

圖3為MdSYP121基因沉默蘋果細胞系及MdSYP121超表達蘋果細胞系的抗病力表型鑑定。

圖4為MdBAK1基因的克隆。

圖5為MdBAK1超表達蘋果細胞系及MdBAK1超表達蘋果植株的分子和蛋白鑑定。

圖6為MdBAK1超表達細胞系抗病力表型鑑定。

圖7為MdBAK1超表達蘋果植株葉片抗病力表型鑑定。

圖8為輪紋病菌菌絲的PDA板等距離的菌餅示意圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1、蘋果愈傷組織細胞培養和遺傳轉化鑑定蘋果抗病相關基因MdSYP121

一、待鑑定目的基因MdSYP121的獲得

1、應用CTAB法從富士蘋果果肉提取總RNA

CTAB提取緩衝液配方：0.1M Tris-Cl(pH 8.0)，1.4M NaCl，20mM EDTA，2％CTAB，2％PVP，2％β-巰基乙醇

1)水浴鍋調至65℃，離心機4℃預冷。

2)配CTAB提取液，取4mL加入DEPC處理過的10mL離心管，65℃水浴預熱。

3)液氮中研磨蘋果果肉0.5-1g，研磨至粉狀。

4)將研磨好的樣品迅速加入預熱過的離心管，劇烈震蕩、渦旋，65℃水浴5min。

5)在冰架上冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)並渦旋混合，4℃，10000rpm離心15min。

6)上清液轉移至新離心管，重複步驟5)一次。

7)上清液轉移至新離心管，加入1/3體積的LiCl(8M，4℃預冷)4℃沉澱過夜(不超過16h)。

8)4℃，10000rpm離心30min，棄上清。

9)用500μL SSTE溶解沉澱，常溫轉移至1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)，吸打混勻，4℃，10000rpm離心10min(抽提後上層應為澄清狀態，若為乳白色應繼續離心)。

10)取上清至新的1.5mL離心管(冰浴預冷)，加入兩倍體積無水乙醇，混勻後於-70℃沉澱30min或-20℃沉澱2h。

11)4℃，12000rpm離心20min，沉澱RNA，棄上清。

12)400μL 70％乙醇洗滌沉澱，重複一次，冰浴晾乾，20μL DEPC水溶解RNA。

利用1％濃度的瓊脂糖檢測RNA的完整性，利用Nanodrop2000測定RNA的濃度和純度。

取5μL總RNA，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)的說明書進行反轉錄為cDNA。

2、MdSYP121超表達載體構建

採用如下引物，以上述cDNA為模板，進行PCR擴增，獲得MdSYP121CDS序列全長，大小為1000bp。

MdSYP121-BamHI-F:5』-GGATCCATGAACGATTTGTTCTCCGGCTCCT-3』

MdSYP121-StuI-R:5』-AGGCCTCTGCGGTTGCGGYGGCGGT-3』

PCR反應體系：總體積100μL，包括cDNA模板5μL，8μLdNTP，克隆引物各5μL，5×HF Buffer20μL，ddH2O 56μL，Phusion高保真酶1μL。

反應程序為：

①98℃30s

②98℃15s

③58℃15s

④72℃ 1min30s

⑤go to②③④for 35個循環

⑥72℃ 5min

⑦4℃保存

PCR產物純化回收，片段大小約為1000bp(圖1)。

將該PCR產物用2.5倍體積的95％酒精進行PCR擴增產物沉澱；然後，用75％酒精洗沉澱，晾乾，用無菌水溶解。

測序該PCR產物，其核苷酸序列為序列表中序列1，編碼的蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2，將該核苷酸所示的基因命名為MdSYP121，編碼的蛋白命名為MdSYP121。

二、超表達MdSYP121的載體和MdSYP121沉默表達載體構建

1、超表達MdSYP121的載體

將序列表中序列1所示的MdSYP121替換pCB302』質粒的BamHI和StuI雙酶切位點間的片段得到的載體，命名為pCB302』-35S-MdSYP121-2HA，該載體超表達MdSYP121。

pCB302』質粒為將參考文獻：Cui et al.,Plant Physiology,2013,162:1018-1029第1028頁Generation of AXR2and AXR2P87S Transgenic Plants中的pCB302質粒中的FLAG標籤替換為HA標籤。

2、MdSYP121沉默表達載體

以蘋果果肉的cDNA為模板，用下面的引物擴增第一片段和第二片段：

第一片段：

F:5』-CGGGATCC GTCAACCTCGACAAGTTCTTC-3』；

R:5』-CCATCGAT CTTGCTCCTGTATTGCCTT-3』。

第二片段：

F:5』-CCGCTCGAG GTCAACCTCGACAAGTTCTTC-3』；

R:5』-GGGGTACC CTTGCTCCTGTATTGCCTT-3』。

得到493bp的第一片段，經過測序，其為具有序列1第121-613位核苷酸；

得到493bp的第二片段，經過測序，其為具有序列1第121-613位核苷酸；與第一片段僅酶切位點不同。

將上述第一片段替換RNAi中間載體pHannibal(參考文獻：Varsha Wesley et al.,Plant Journal,2001,27:581-590Figure 5)的BamH I和Cla I酶切位點間的片段，且將第二片段替換RNAi中間載體pHannibal的Xho I和Kpn I酶切位點間的片段，得到中間載體pHannibal-SYP121；

再用BamH I和Stu I雙酶切中間載體pHannibal-SYP121，得到2600bp的片段(該片段測序結果見序列7，第317-809位為第一片段，第1671-2163位為第二片段)；

將該該2600bp的片段與經過BamH I和Stu I酶切的pCB302』載體骨架連接，得到重組質粒pCB302』-RNAi-MdSYP121。

三、農桿菌介導的蘋果愈傷組織的轉化得到轉基因愈傷組織

1、農桿菌轉化及活化

1)所用農桿菌株係為：將100μL農桿菌LBA4404(ThermoFisher SCIENTIFIC,18313-015)感受態細胞於冰上融化，加入2μL質粒DNA(pCB302』-RNAi-MdSYP121或pCB302』-MdSYP121-2HA)，混勻，冰浴30min，液氮速凍1min，37℃熱激5min，冰浴2-3min。

2)加入1mL YEP培養基，28℃，200rpm，震蕩1.5h，離心棄上清，留100μL液體重懸菌體。

3)將重懸好的菌體均勻塗在加有利福平(50mg/L)和卡那黴素(50mg/L)的固體YEP培養基上，28℃倒置培養2d。

4)挑取固體YEP培養基上的單克隆農桿菌於2ml加有利福平(50mg/L)和卡那黴素(50mg/L)的液體YEP培養基中，28℃，200rpm，震蕩20h。

5)取50ml加有利福平(50mg/L)和卡那黴素(50mg/L)的液體YEP培養基於150ml錐形瓶，加入2ml已搖好的菌液，28℃，200rpm，震蕩6-7h至OD600值為0.4-0.6，得到LBA4404/pCB302』-RNAi-MdSYP121菌液和LBA4404/pCB302』-MdSYP121-2HA菌液。

2、蘋果愈傷組織的轉化

1)分別將LBA4404/pCB302』-RNAi-MdSYP121菌液和LBA4404/pCB302』-MdSYP121-2HA菌液移至50mL離心管，28℃，5000rpm，離心10min，棄上清。

2)用50mLMS液體培養基重懸，將蘋果葉片愈傷組織(品種名稱：王林；以下也稱為野生型細胞)移入菌液中28℃，200rpm，搖20min。

王林蘋果葉片愈傷組織製備：

以春天剛展開的王林蘋果幼嫩葉片為外植體，帶回實驗室用自來水洗淨。在超淨工作檯上用75％的酒精水溶液浸泡10s進行消毒，然後用無菌水衝洗3次，再用濃度為3％的次氯酸鈉水溶液(有效Cl濃度)浸泡10min進一步消毒，之後用無菌水衝洗3-6次，放在滅過菌的濾紙上吸乾水分，用無菌的剪刀剪幾道傷口，放置到誘導培養基上暗培養2周，得到王林蘋果葉片愈傷組織

上述誘導培養基為MS(Murashige and Skoog)培養基添加2.5mg/L 2,4-D、0.5mg/L 6-BA和0.1mg/L KT，之後進行每天16h的光培養，光照強度為2000～2500lx。溫度均為24±2℃。

3)紗布過濾蘋果葉片愈傷組織，用無菌濾紙吸去表面菌液，置於MS培養基上共培養2d。

4)共培養後的愈傷組織轉移至加有羧苄青黴素(300mg/L)和除草劑(glufosinate，8mg/L)的MS愈傷組織選擇培養基中，23-26℃暗培養。

5)培養約1個月後，取在愈傷組織選擇培養基上生長出來的細胞團，進行接種繁殖下一代，總共篩選4代，得到能夠在含有除草劑的MS培養基上進行均一穩定生長的細胞系，得到轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞和轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞。

3、鑑定

1)、陽性轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞的鑑定

提取轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞的RNA，反轉錄得到cDNA作為模板，用檢測第一片段引物和檢測第二片段引物分別PCR擴增；以野生型細胞作為對照(WT)。

檢測第一片段引物：

F:5』-CGGGATCC GTCAACCTCGACAAGTTCTTC-3』；

R:5』-GGTAACATGATAGATCATGTC-3』。

檢測第二片段引物：

F:5』-CGGGATCC GTCAACCTCGACAAGTTCTTC-3』；

R:5』-CTTCGTCTTACACATCACTTGTC-3』。

結果如圖2A所示(F1和R1分別為沉默載體的第一片段和第二片段)，可以看出，除野生型細胞WT無目的條帶外，10個轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞都有目的條帶(圖2A)，說明pCB302』-RNAi-MdSYP121轉化愈傷組織成功。

為進一步檢測MdSYP121是否被沉默，提取10個轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞RNA(#1-#10)，反轉錄為cDNA，經實時定量PCR檢測，引物序列為：qRT-RNAi-MLO1-F:5』-TCAAGGTGACCAGTTGGACG-3』；qRT-RNAi-MLO1-R:5』-GAACCTGGCCTTCTGCAACTG-3』；內參基因為MdActin、引物序列為:MdActin-F:5』-TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT-3』；MdActin-R:5』-TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC-3』)，以野生型細胞作為對照(WT)。

結果如圖2B所示，在10個轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞中，該基因的表達均被抑制，且抑制達90％以上，說明MdSYP121在蘋果細胞中被有效沉默，10個轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞為陽性轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞。

2)、陽性轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞的鑑定

分別提取6個轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞和野生型細胞WT的蛋白，用Anti-HA抗體(pCB302』載體上含有HA標籤)，應用Western Blot技術，檢測MdSYP121-2HA融合蛋白在蘋果細胞中的表達。

結果如圖2C所示，可以看出，在所得到的轉基因細胞系中，在分子量43KD處，全部檢測到了HA標籤信號，與根據MdSYP121胺基酸序列數目判定的分子量大小完全一致，而在野生型細胞中無此信號，也說明該信號特異，所檢測細胞為轉基因細胞。另，與Anti-HA抗體的檢測結果相對照，在野生型細胞和轉基因細胞中，均能檢測到MdActin的信號。結果表明，MdSYP121轉化愈傷組織成功並能穩定遺傳，轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞為陽性轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞。

總之，應用該愈傷組織的轉化方法，在以除草劑做選擇壓的條件下，所隨機選取的10個獨立的MdSYP121基因沉默轉基因細胞團的檢測結果表明：MdSYP121的表達均被抑制，轉化效率為100％(圖2B)；在所選取的6個MdSYP121超表達細胞團的檢測結果表明，均含有MdSYP121蛋白，轉化效率為100％(圖2C)。而且，獲得穩定生長的轉基因細胞所需時間均為2個月；具有轉化效率高、試驗周期短的特點。

四、轉基因愈傷組織的抗輪紋病鑑定

1、待接菌蘋果愈傷組織細胞的接種培養與準備

1)準備

培養基配置：使用無菌玻璃培養皿(上海五一)，培養皿大小為：直徑9cm，深度1.1cm，品牌為，將經121℃高壓滅菌20min後的MS培養基，35mL定量傾倒在無菌玻璃培養皿中，備用。

待接菌蘋果愈傷組織細胞：選取生長12d野生型蘋果愈傷組織(WT)、陽性轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞(MdSYP121-OX)和陽性轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞(MdSYP121-RNAi)，分別準確稱取2g均勻平鋪於MS培養基中，培養，得到待接種野生型蘋果愈傷組織(WT)、待接種陽性轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞(MdSYP121-OX)和待接種陽性轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞(MdSYP121-RNAi)。

野生型蘋果細胞在不同時期的生長狀態如圖3A所示，可以看出，細胞生長12d，此時期蘋果愈傷組織生長狀態良好均一併且已全部覆蓋在培養基表面。

待接種蘋果輪紋病病菌：生長於PDA培養基上的蘋果輪紋病病菌(Botryosphaeria dothidea(種名：dothidea)，參考文獻：張高雷等，蘋果輪紋病病瘤組織研究,植物病理學報2011,41(1):98－101)菌絲培養3d，得到待接種蘋果輪紋病病菌。

2)接種

選取大小一致生長狀態良好的待接種蘋果輪紋病病菌的菌餅分別置於上述待接種野生型蘋果愈傷組織(WT)、待接種陽性轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞(MdSYP121-OX)和待接種陽性轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞(MdSYP121-RNAi)的中央(採用直徑為6mm的實驗室白膠塞打孔器，在生長有輪紋病菌菌絲的PDA板上，以板圓心為核心，等距離打出大小均勻一致的菌餅，各菌餅所含菌絲量一致，如圖8所示)，24℃，黑暗培養3d，觀察不同愈傷組織上蘋果輪紋病病菌的擴展情況；陽性轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞(MdSYP121-OX)的重複數為6，陽性轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞(MdSYP121-RNAi)的重複數為11。

陽性轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞(MdSYP121-OX)結果如圖3B左圖和圖3C所示，與野生型細胞相比，蘋果輪紋病病菌在超表達MdSYP121轉基因愈傷組織上生長較旺盛，相同時間內病菌擴展面積大，MdSYP121超表達轉基因細胞株MdSYP121-OX病斑擴展面積在：50.27-73.79cm2之間，而野生型細胞系病斑擴展面積為：20.41-57.93cm2之間，二者具有顯著差異(p<0.05)，說明超表達MdSYP121顯著降低蘋果對輪紋病的抗性，陽性轉pCB302』-MdSYP121-2HA愈傷組織細胞(MdSYP121-OX)的抗病力低於野生型細胞。

陽性轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞(MdSYP121-RNAi)的結果如圖3B右圖和圖3C所示，與野生型細胞相比，蘋果輪紋病病菌在MdSYP121轉基沉默細胞株(MdSYP121-RNAi)中擴展與發病較緩慢，相同時間內病菌擴展面積小；培養3d之後，RNAi沉默細胞株中病斑面積在：9.61-22.04cm2之間，野生型細胞株病斑擴展面積為：24.62-48.98cm2之間，二者區別為極顯著(p<0.01)，說明沉默MdSYP121後可顯著增強蘋果對輪紋病的抗性，表明陽性轉pCB302』-RNAi-MdSYP121愈傷組織細胞(MdSYP121-RNAi)抗病力高於野生型細胞。

上述實驗證明了，MdSYP121基因為蘋果輪紋病抗性相關基因，具有調節蘋果對輪紋病的抗性，沉默後可以增強蘋果對輪紋病的抗性。

實施例2、蘋果愈傷組織細胞培養和遺傳轉化鑑定蘋果抗病相關基因MdBAK1

一、待鑑定目的基因MdBAK1的獲得

根據GDR公布的蘋果基因組數據，利用引物設計軟體DNASTAR設計蘋果中BAK1同源基因的克隆引物：

MdBAK1-1-NcoI-F:5』-CATGCCATGGACCCAACACTGATGAC-3』,

MdBAK1-1-SmaI-R:5』-TCCCCCGGGTCTGGGACCGGACAACTC-3』；

MdBAK1-2-NcoI-F:5』-CATGCCATGGCGTCCTCCGCCTCTGTT-3』,

MdBAK1-2-SmaI-R:5』-TCCCCCGGGTCTGGGACCGGACAACTC-3』。

提取新疆野蘋果紅色愈傷的RNA，反轉錄得到的cDNA為模板，分別用上述2對引物進行PCR擴增，獲得了MdBAK1-1CDS序列，片段長度為1851bp(圖4A，左)和MdBAK1-2CDS序列，片段長度1833bp(圖4A，右)。

MdBAK1-1CDS序列經過測序，其序列3，其編碼的蛋白為序列4，蛋白命名為MdBAK1-1；

MdBAK1-2CDS序列經過測序，其序列5，其編碼的蛋白為序列6，蛋白命名為MdBAK1-2；

二、超表達MdBAK1的載體構建

超表達MdBAK1-1的載體為將序列表中序列3所示的MdBAK1-1替換pCB302』質粒的BamHI和StuI雙酶切位點間的片段得到的載體，命名為pCB302』-35S-MdBAK1-1，該載體超表達MdBAK1-1(電泳圖如圖4B左)。

超表達MdBAK1-2的載體為將序列表中序列5所示的MdBAK1-2替換pCB302』質粒的BamHI和StuI雙酶切位點間的片段得到的載體，命名為pCB302』-35S-MdBAK1-2，該載體超表達MdBAK1-2(電泳圖如圖4B右)。

三、農桿菌介導的蘋果愈傷組織的轉化得到轉基因愈傷組織

1、農桿菌轉化及活化

與實施例1相同；

2、蘋果愈傷組織的轉化

與實施例1方法相同，分別將pCB302』-35S-MdBAK1-1和pCB302』-35S-MdBAK1-2分別轉入蘋果葉片愈傷組織(王林)中，得到轉pCB302』-35S-MdBAK1-1愈傷組織細胞和轉pCB302』-35S-MdBAK1-2愈傷組織細胞(圖5A)。

3、鑑定

分別提取轉pCB302』-35S-MdBAK1-1愈傷組織細胞、轉pCB302』-35S-MdBAK1-2愈傷組織細胞和野生型細胞WT的蛋白，用Anti-HA抗體(pCB302』載體上含有HA標籤)，應用Western Blot技術，檢測MdBAK1-1-HA融合蛋白在蘋果細胞中的表達。

轉pCB302』-35S-MdBAK1-1愈傷組織細胞、轉pCB302』-35S-MdBAK1-2愈傷組織細胞的結果如圖5C所示，在鑑定的5個轉pCB302』-35S-MdBAK1-1愈傷組織細胞中，均有MdBAK1-1表達(圖5C上排，MdBAK1-1OX),2個轉pCB302』-35S-MdBAK1-2愈傷組織細胞中，均有MdBAK1-2穩定表達(圖5C上排，MdBAK1-2OX)；可以看出，得到了MdBAK1超表達的蘋果細胞系。

總之，在以除草劑做選擇壓的條件下，所隨機選取的5個獨立發生的細胞團，全部含有MdBAK1-1蛋白信號，細胞轉化率為100％(圖5C上排，MdBAK1-1OX)；在MdBAK1-2轉基因細胞的檢測中，檢測了3個獨立發生的細胞團，2個含有MdBAK1-2的蛋白信號，細胞轉化率為66.7％(圖5C上排，MdBAK1-2OX)；而且，得到MdBAK1-1及MdBAK1-2穩定表達和生長的細胞團所需時間為2個月，具有轉化效率高、試驗周期短的特點。

四、轉基因愈傷組織的抗輪紋病鑑定

方法同實施例1，選取大小一致生長狀態良好的待接種蘋果輪紋病病菌的菌餅分別置於上述待接種野生型蘋果愈傷組織(WT)、待接種陽性轉pCB302』-35S-MdBAK1-1愈傷組織細胞和待接種陽性轉pCB302』-35S-MdBAK1-2愈傷組織細胞的中央(採用直徑6mm的實驗室白膠塞打孔器打出大小均勻一致的菌餅，圖8所示)，室溫黑暗培養6天，重複三次。

結果如圖6所示，輪紋病菌在陽性轉pCB302』-35S-MdBAK1-1愈傷組織細胞和陽性轉pCB302』-35S-MdBAK1-2愈傷組織細胞中的生長與擴展速度顯著高於對照野生型蘋果愈傷組織；表明，陽性轉pCB302』-35S-MdBAK1-1愈傷組織細胞和陽性轉pCB302』-35S-MdBAK1-2愈傷組織細胞的抗病力低於野生型蘋果愈傷組織。經接種於蘋果愈傷組織細胞，24℃度培養發病6天後，在野生型蘋果細胞中，病菌侵染與擴展面積為：15.9-19.63cm2之間，在MdBAK1-1超表達細胞中，病菌侵染與擴展面積為：63.2-63.6cm2之間，在MdBAK1-2超表達細胞中，病菌侵染與擴展面積為：62.2-63.6cm2之間。病菌在野生型細胞與MdBAK1-1或MdBAK1-2超表達的細胞中的擴展差異為極顯著(p<0.01)(圖6B)。

因此，MdBAK1-1或MdBAK1-2的超表達可降低蘋果對輪紋病菌的抗性，證明其為輪紋病菌抗病相關基因。

對比例：轉化受體為葉片

1、蘋果葉片轉化

將pCB302』-35S-MdBAK1-1分別轉入蘋果葉片(以下也稱為野生型細胞，品種名：嘎啦，葉片取自嘎啦組培苗上具有1個月葉齡的葉片，嘎啦組培苗製備方法如下)中，得到轉pCB302』-35S-MdBAK1-1蘋果苗(圖5B)。

上述嘎啦蘋果組培苗的誘導和再生：

收集嘎啦成熟種子，混在含水量50％左右的溼沙中4℃層積三個月，待種子萌發，挑選下胚軸為紅色的種子，去掉種子外殼，用自來水衝洗乾淨，在超淨工作檯上用75％的酒精浸泡10s進行消毒，然後用滅菌水衝洗3次，再用濃度3％的次氯酸鈉(有效Cl濃度)浸泡10～15min進一步消毒，之後用無菌水衝洗3～6次，放在滅過菌的濾紙上吸乾水分，接種到無激素的MS培養基中進行培養，生長成旺盛的小苗時切掉根部，將莖插到誘導培養基上(MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L)，經過1個月的培養，得到多叢芽後進行繼代培養。得到多叢芽後，取多叢芽的葉片切成正方形小塊，放在再生培養基上(MS+0.2mg/L IBA+1.0mg/L TDZ)，暗培養2周後進行光培養，4周後再生出不定芽，切下不定芽轉到繼代培養基進行培養。

2、鑑定

分別提取轉pCB302』-35S-MdBAK1-1蘋果苗和野生型蘋果苗的蛋白，用Anti-HA抗體(pCB302』載體上含有HA標籤)，應用Western Blot技術，檢測MdBAK1-1-HA融合蛋白和MdBAK1-2-HA融合蛋白在蘋果植株中的表達。

結果在2#、6#兩個系，共5個轉pCB302』-35S-MdBAK1-1植株2-1#、2-2#、2-3#、6-1#、6-2#中，均檢測到MdBAK1-1的穩定表達(圖5C，下排，MdBAK1-1OX)，得到了MdBAK1超表達的蘋果植株。

在應用蘋果葉片進行MdBAK1-1的基因轉化中，從600株生長的組培苗植株中，最終篩選得到了2個超表達MdBAK1-1的轉基因植株，轉化率為0.3％，耗時長達1年，而且，篩選工作量巨大，與愈傷組織細胞的轉化相比，轉化效率大為降低，而且，對操作者技術水平依賴程度高，得到轉基因植株較為困難。

2、轉基因植株的抗輪紋病鑑定

蘋果植株抗病力鑑定採用離體葉片接種法，具體如下：

在培養皿中加濾紙，倒入無菌水使濾紙保持溼潤，將轉pCB302』-35S-MdBAK1-1蘋果苗葉片分別置於濾紙上，正面朝上。葉片扎孔，在扎孔部位，覆蓋於PDA培養基上生長6天的待接種蘋果輪紋病病菌菌塊，培養3d(24℃，暗培養)。以野生型蘋果葉片為對照。

結果如圖7所示，輪紋病菌在轉pCB302』-35S-MdBAK1-1蘋果苗的葉片中的擴展侵染速度顯著大於野生型對照，所造成的接種部位葉片腐爛的面積顯著大於野生型，證明MdBAK1-1為抗病基因。

因此，表明本發明用葉片愈傷組織轉化的鑑定結果與用植株葉片的鑑定結果一致，說明利用蘋果愈傷組織轉化進行蘋果抗病基因功能鑑定為一種簡易可靠的方法。

儘管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和範圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬於本發明範圍內的所有這些變化和修改。