一種糜蛋白酶的純化工藝的製作方法

2023-04-28 14:47:51

專利名稱：一種糜蛋白酶的純化工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物製藥技術中糜蛋白酶領域，特別涉及一種糜蛋白酶的純化工藝。
背景技術：
糜蛋白酶是從牛胰臟或豬胰臟中提取分離純化得到的一種蛋白酶。它能切斷蛋白質肽鏈中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽鏈，故能有效酶解蛋白質，因而具有清創消膿，消化膿汁和去除壞死組織，助長新生肉芽生長的功能。在臨床上主要用於抗炎消腫，有報導稱其在輔助抗癌方面也具有不錯效果。此外，在皮革工業上，糜蛋白酶常用於脫去動物皮上的毛等。目前國內已對該酶做了大量的研究，提取純化工藝多採用鹽析多重結晶結合透析的方法。鹽析多重結晶純化能力弱，耗費時間長；低溫激活耗費時間長，激活效率低；透析工藝耗時長，不便於工業化生產；且得到的產品純度低，雜蛋白多，增加了用藥的不良反應； 傳統工藝所得產品的酶活性一般在1000-1200單位/毫克左右，產品純度為80-85%。酶活性低，產品中的雜蛋白增加了過敏反應風險。因此，提高糜蛋白酶的純度，提高其活性可以提高該酶的用藥安全性，是研究人員需關注的問題。

發明內容
為了解決以上糜蛋白酶活性含量低，純度低的問題，本發明提供了一種製得的糜蛋白酶活性含量高、純度高的糜蛋白酶的純化工藝。本發明是通過以下方式實現的
一種糜蛋白酶的純化工藝，包括以下步驟
(1)取牛胰，將脂肪、結締組織除去，絞碎成胰漿；
(2)向胰漿中加入硫酸溶液進行鹽析，過濾；
(3)濾液中加入硫酸銨至O.4飽和度，冷室中放置過夜；
(4)過濾，濾液用截留分子量50kDa的超濾膜進行超濾；
(5)濾出液用截留分子量5-10kDa的超濾膜進行超濾；
(6)濾液加硫酸銨至O.7飽和度，低溫放置過夜；
(7)過濾，將濾餅溶於冷純化水中，冷純化水的體積數為濾餅質量數的3-5倍，加硫酸調pH為2. 0，攪拌使溶解，加入飽和硫酸銨溶液，飽和硫酸銨溶液的體積數為濾餅質量數的 2倍，調pH至5. 0，250C，孵育2-5 h，有晶體析出，過濾收集晶體；
(8)晶體用冷純化水加硫酸溶解，冷純化水的體積數為晶體質量數的3-5倍，調節pH
7.6，加入胰蛋白酶，20°C活化2-4 h ；
(9)調節pH至4.0，加入固體硫酸銨使達O. 7飽和度，過濾收集沉澱；
(10)沉澱用冷純化水加硫酸溶解，用截留分子量IOkDa的超濾膜進行超濾；
(11)將上述超濾脫鹽的料液加至已用0.05mol/LNaAC緩衝液平衡好的SP離子交換柱上，用3倍柱體積的含O. 2 mol/L NaCl的緩衝液洗柱，用3倍柱體積的含O. 4 mol/L NaCl的緩衝液洗脫得洗脫液；
(12)將上述洗脫液用截留分子量10-30kDa的超濾膜進行超濾，除菌，既得。所述的純化工藝，步驟(3)中濾液中加入硫酸銨至O. 4飽和度，加入硅藻土助濾。
所述的純化工藝，步驟(7)中用5N NaOH調節pH至5.0，加入的硫酸為5N的硫酸。所述的純化工藝,步驟(8)中胰蛋白酶加入量為5mg/100g晶體,加入晶體重量I倍的體積的pH 7. 6,0. 5 mol/L的磷酸鹽緩衝液，以5N NaOH調節pH 7. 6。
所述的純化工藝，步驟(10)中超濾時添加pH 3.0的冷純化水，至母液電導與
O.05mol/L NaAC緩衝液電導相同為止。冷純化水是指10°C以下的純化水。本發明的有益效果本發 明的糜蛋白酶的純化工藝，使用超濾膜與離子交換柱的結合來純化糜蛋白酶，純化效果好，得到的產品純度高，降低了以往因產品中的雜蛋白而導致的過敏反應風險；本發明工藝得到的糜蛋白酶酶活性高，效價大於1500 U/mg，提高了該酶的用藥安全性。


圖I為實施例I所得產品HPLC檢測純度圖。
具體實施例方式實施例I
(1)取新鮮牛胰10kg，去除脂肪、結締組織等，用絞肉機絞碎成胰漿；
(2)加入20L(胰漿體積量的2倍)O. 25 N硫酸溶液，於冷室中攪拌提取24h，過濾，濾餅用10 L冷的O. 25 N硫酸同法攪拌提取lh，過濾，合併兩次濾液；
(3)濾液攪拌並逐漸加入硫酸銨至O.4飽和度，冷室中低溫放置過夜；
(4)過濾，濾液用截留分子量50kDa的超濾膜進行超濾，收集濾出液，
(5)用截留分子量IOkDa的超濾膜進行超濾；
(6)濾液加硫酸銨至O.7飽和度，低溫放置過夜；
(7)過濾收集濾餅390g，將濾餅溶於冷純化水中，冷純化水的體積數為濾餅質量數的5 倍，滴加5 N硫酸使pH達2.0，攪拌使溶解，緩慢加入飽和硫酸銨溶液，用5 N NaOH調節pH 至5. 0，於25°C，孵育2-5 h，即有針狀晶體析出，過濾收集晶體；
(8)晶體用冷純化水加硫酸溶解，冷純化水的體積數為晶體質量數的3倍，加適量5N 硫酸使溶解，加入晶體重量I倍體積量的pH 7.6 ,0.5 mol/L的磷酸鹽緩衝液，以5 N NaOH 調節pH 7.6，加入少量胰蛋白酶(211^/10(^晶體)，於室溫活化2-4 h ；
(9)激活結束後，用5N硫酸調節pH至4. O，加入固體硫酸銨使達O. 7飽和度，過濾收集沉澱；
(10)沉澱用冷純化水加5N硫酸溶解，於冷室中用截留分子量IOkDa的超濾膜進行超濾，不斷添加pH 3.0左右的冷純化水，至母液電導與0.05mol/L NaAC緩衝液電導相同為止;
(11)將上述超濾脫鹽的料液加至已用O.05mol/L NaAC緩衝液平衡好的SP離子交換柱上，用3倍柱體積的含O. 2 mol/L NaCl的緩衝液洗柱，用3倍柱體積的含O. 4 mol/L NaCl的緩衝液洗脫的洗脫液；
(12)將上述洗脫液於冷室中用截留分子量IOkDa的超濾膜進行超濾，不斷添加pH3. O 左右的冷純化水，至HPLC檢測母液中蛋白純度大於95%，HPLC檢測結果見附圖I。將上述超濾液通過O. 22μπι的濾膜除菌，凍幹得產品65g，所得成品的效價為1536 U/mg。
實施例2
(1)取5kg冷凍的牛胰，將脂肪、結締組織等去除，絞碎成胰漿；
(2)加入15L (胰漿體積量的3倍)0.25 N硫酸溶液，於冷室中攪拌提取24h，過濾， 濾餅再用胰漿體積量I倍的冷的O. 25 N硫酸同法攪拌提取lh，過濾，合併兩次濾液；
(3)濾液攪拌並逐漸加入硫酸銨至O.4飽和度，加入硅藻土助濾，冷室中低溫放置過
夜；
(4)過濾，濾液用截留分子量50kDa的超濾膜進行超濾； (5)濾出液用截留分子量IOkDa的超濾膜進行超濾；
(6)濾液加硫酸銨至O.7飽和度，低溫放置過夜，次日過濾；
(7)過濾收集濾餅186g，將濾餅溶於冷純化水中，冷純化水的體積數為濾餅質量數的3 倍，滴加5 N硫酸使pH達2. 0，攪拌使溶解，緩慢加入飽和硫酸銨溶液，飽和硫酸銨溶液的體積數為濾餅質量數的2倍，用5N NaOH調節pH至5. 0，於25°C，孵育2_5 h，即有針狀晶體析出，過濾收集晶體；
(8)晶體用冷純化水加硫酸溶解，冷純化水的體積數為晶體質量數的3倍，加入晶體重量I倍體積量的pH 7. 6、0. 5mol/L的磷酸鹽緩衝液，以5N NaOH調節pH 7. 6，加入少量胰蛋白酶(5mg/100g晶體)，於室溫20°C活化2-4 h ；
(9)激活結束後，用5N硫酸調節pH至4. O，加入固體硫酸銨使達O. 7飽和度，過濾收集沉澱；
(10)上述沉澱用冷純化水加5N硫酸溶解，於冷室中用截留分子量IOkDa的超濾膜進行超濾，不斷添加pH 3.0左右的冷純化水，至母液電導與0.05mol/L NaAC緩衝液電導相同為止；
(11)將上述超濾脫鹽的料液加至已用O.05mol/L NaAC緩衝液平衡好的SP離子交換柱上，用3倍柱體積的含O. 2mol/L NaCl的緩衝液洗柱，用3倍柱體積的含O. 4mol/L NaCl 的緩衝液洗脫得洗脫液；
(12)將上述洗脫液於冷室中用截留分子量30kDa的超濾膜進行超濾，不斷添加pH3. O 左右的冷純化水，至HPLC檢測母液中蛋白純度大於95%為止，將上述超濾液通過O. 22 μ m 的濾膜除菌，凍幹得產品32g，所得成品的效價為1525U/mg。對比實施例
(I)取5kg冷凍的牛胰，去除脂肪、結締組織，絞碎成胰漿；
(2)加入IOLO. 25 N硫酸溶液，於冷室中攪拌提取24h，過濾，濾餅再用胰漿體積量I 倍的冷的O. 25 N硫酸同法攪拌提取lh，過濾，合併兩次濾液；
(3)濾液攪拌並逐漸加入硫酸銨至O.4飽和度，加入少量硅藻土助濾，冷室中低溫放置過夜；
(4)過濾收集濾液，濾液加硫酸銨至O.7飽和度，低溫放置過夜，次日過濾收集濾餅；
(5)將濾餅溶於冷純化水中，冷純化水的體積數為濾餅質量數的3倍，滴加5N硫酸使 pH達2. 0，攪拌使溶解，緩慢加飽和硫酸銨溶液，飽和硫酸銨溶液的體積數為濾餅質量數的 2倍，用5N NaOH調節pH至5. 0，於25°C，孵育48 h，過濾收集晶體；
(6)再按上述步驟重複結晶五次，過濾收集糜蛋白酶糜原結晶。(7)晶體用冷純化水加硫酸溶解，冷純化水的體積數為晶體質量數的3倍，加入晶體重量I倍體積量的pH 7. 6、0. 5mol/L的磷酸鹽緩衝液，以5N NaOH調節pH 7. 6，加入少量胰蛋白酶(5mg/100g晶體)，於室溫5°C活化48 h ；
(9)激活結束後，用5N硫酸調節pH至4. O，加入固體硫酸銨使達O. 7飽和度，過濾收集鹽析品；
(10)加入上述濾餅重量I.3倍量的純化水溶解，裝入透析袋中，置於5°C冷水中透析 48-72h，過濾取清液，凍幹的成品45g，效價為1250 U/mg，產品純度84. 1%。
權利要求
1.一種糜蛋白酶的純化工藝，其特徵在於包括以下步驟(1)取牛胰，將脂肪、結締組織除去，絞碎成胰漿；(2)向胰漿中加入硫酸溶液進行鹽析，過濾；(3)濾液中加入硫酸銨至O.4飽和度，冷室中放置過夜；(4)過濾，濾液用截留分子量50kDa的超濾膜進行超濾；(5)濾出液用截留分子量5-10kDa的超濾膜進行超濾；(6)濾液加硫酸銨至O.7飽和度，低溫放置過夜；(7)過濾，將濾餅溶於冷純化水中，冷純化水的體積數為濾餅質量數的3-5倍，加硫酸調pH為2. O，攪拌使溶解，加入飽和硫酸銨溶液，飽和硫酸銨溶液的體積數為濾餅質量數的 2倍，調pH至5. O，250C，孵育2-5 h，有晶體析出，過濾收集晶體；(8)晶體用冷純化水加硫酸溶解，冷純化水的體積數為晶體質量數的3-5倍，調節pH 7. 6，加入胰蛋白酶，20°C活化2-4 h ；(9)調節pH至4.O，加入固體硫酸銨使達O. 7飽和度，過濾收集沉澱；(10)沉澱用冷純化水加硫酸溶解，用截留分子量IOkDa的超濾膜進行超濾；(11)將上述超濾脫鹽的料液加至已用O.05mol/L NaAC緩衝液平衡好的SP離子交換柱上，用3倍柱體積的含O. 2 mol/L NaCl的緩衝液洗柱，用3倍柱體積的含O. 4 mol/L NaCl的緩衝液洗脫得洗脫液；(12)將上述洗脫液用截留分子量10-30kDa的超濾膜進行超濾，除菌，既得。
2.根據權利要求I所述的純化工藝，其特徵在於步驟(3)中濾液中加入硫酸銨至O.4 飽和度，加入娃藻土助濾。
3.根據權利要求I所述的純化工藝，其特徵在於步驟(7)中用5NNaOH調節pH至5.0， 加入的硫酸為5N的硫酸。
4.根據權利要求I所述的純化工藝，其特徵在於步驟(8)中胰蛋白酶加入量為 5mg/100g晶體，加入晶體重量I倍的體積的pH 7.6,0.5 mol/L的磷酸鹽緩衝液，以5N NaOH 調節pH 7.6。
5.根據權利要求I所述的純化工藝，其特徵在於步驟(10)中超濾時添加pH3. O的冷純化水，至母液電導與0.05mol/L NaAC緩衝液電導相同為止。
全文摘要
本發明涉及生物製藥技術中糜蛋白酶領域一種糜蛋白酶的純化工藝碎漿；鹽析，過濾；加入硫酸銨至0.4飽和度，冷室中放置過夜；過濾，用50kDa的超濾膜進行超濾；用5-10kDa的超濾膜進行超濾；濾液加硫酸銨至0.7飽和度，低溫放置過夜；過濾，析晶；活化；沉澱；用10kDa的超濾膜進行超濾；SP離子交換柱純化；用10-30kDa的超濾膜進行超濾，除菌，即得。使用超濾膜與離子交換柱的結合來純化糜蛋白酶，純化效果好，得到的產品純度高；本發明工藝得到的糜蛋白酶酶活性高，大於1500U/mg，可以減少用藥量，減少患者醫療支出，也提高了該酶的用藥安全性。
文檔編號C12N9/64GK102618523SQ20121012535
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者孫廷華, 李全義, 李剛, 李娟 , 王朋田 申請人:山東眾山生物科技有限公司