喹唑酮藥物及其應用的製作方法

2023-04-28 14:44:16

專利名稱：喹唑酮藥物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及含喹唑酮的組合物。尤其，本發明涉及抑制再狹窄的組合物，其中包含本文稱作活性組分的喹唑酮衍生物。
在1967年批准的美國專利3,320,124中描述和公開了用喹唑酮衍生物治療球蟲病的方法。
在所述專利中，首先由美國Cyanamid公司描述和公開了滷夫酮，此外已知為7-溴-6-氯-3-〔3-(3-羥基-2-哌啶基)-2-氧丙基〕-4-(3H)-喹唑酮，並且該化合物是所述專利中提到的優選化合物，是所述專利中描述和公開的衍生物中成為商品化產物的化合物。
隨後，美國再批准專利26,833和美國專利4,824,847；4,855,299；4,861,758和5,215,993中都提到了滷夫酮，同時，美國專利4,340,596中提到該化合物也可用於治療泰累爾梨漿蟲病。
最近，在未決的美國專利申請08/181,066中，描述和公開了抗纖維變性的組合物，它包含一定量作為其中活性組分的式I化合物
其中R1為下列基團氫，滷素，硝基，苯並，低級烷基，苯基和低級烷氧基；R2為下列基團羥基，乙醯氧基，和低級烷氧基，並且R3為下列基團氫和低級鏈烯氧基-羰基；可有效地抑制I型膠原蛋白的合成。
進一步研究和發展後發現，上述式I化合物在抑制非纖維變性型再狹窄中是有效的。
動脈粥樣硬化的發病機理涉及由巨噬細胞將平滑肌細胞浸潤並包埋在粘性糖蛋白，蛋白多糖和膠原蛋白組成的細胞外基質(ECM)中引起的平滑肌細胞(SMCs)的異常遷移和增殖〔V.Fuster等人，「冠狀動脈病和急性冠狀動脈綜合症的發病機理」New Eng.J.Med.，326卷，242-250頁(1992)；R.Ross，「動脈粥樣硬化的發病機理九十年代的觀點」Nature，362卷，801-809頁(1993)〕。在生理狀態下，大多數動脈SMCs保留在Go相併且通過內源性增殖刺激因子和增殖抑制因子之間的平衡作用來控制細胞的生長。下列內皮細胞紊亂歸因於致動脈粥樣硬化的危險因素(即高血壓，高脂蛋白血症，糖尿病)，血小板和非血小板衍生的生長因子，細胞激動素釋放出來並且刺激單核細胞和SMC遷移以及SMC增殖(V.Fuster等人，ibid.；R.Ross，ibid.)。這些生長因子包括血小板衍生的生長因子(PDGF)〔G.A.A.Ferns等人.，「PDGF抗體對血管成形術Neoinitmal平滑肌蓄積的抑制作用，」Science，253卷，1129-1132頁(1991)〕，鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)〔V.Lindner等人，「鹼性成纖維細胞生長因子在血管損傷形成中的作用，」Circ.Res.，68卷，106-113頁(1991)〕，和白細胞介素-1(IL-1)〔H.Loppnow和P.Libby，「增殖或白細胞介素-1激活的人血管平滑肌細胞分泌大量白細胞介素-6，」J.Clin.Invest.，85卷，731-738頁(1990)〕。巨噬細胞和血小板也釋放消化各種ECM中組分的酶，釋放bFGF並可釋放其它貯存在基膜和ECM中的生長因子(TGFB)〔I.Vlodavsky等人，「與細胞外基質結合的生長因子，酶和血漿蛋白質，」inMolecular and Cellular Aspects of Basement Membranes，Monographs in Cell Biology，D.H.Rohrbach和R.Timpl，Eds.，AcadmicPress，New York，U.S.A.324-246頁(1993)〕。可能的促SMCs生長活性也由在某些情況下可由存在於血管壁中的凝血酶產生〔R.Bar-Shavit等人，「固定在細胞外基質中的凝血酶是粗血管平滑肌細胞分裂的促細胞分裂素非酶作用方式，」Cell Reg.，1卷，453-463頁(1990)；S.M.Schwartz，「血清衍生的生長因子是凝血酶嗎？」J.Clin.Invest.，91卷，4頁(1993)〕。幹擾這些生長因子促生長活性的分子可抑制致動脈粥樣硬化過程的進程。
在經皮腔冠狀動脈血管成形術(PTCA)后冠狀動脈再狹窄過程中，作為對內皮損害的反應，動脈平滑肌細胞增殖是基本反應〔V.Fuster等，ibid.〕。冠狀動脈分流術或成形術用於因心臟病引起狹窄的冠狀動脈的再擴張。兩種方法的主要問題是大約30％經過血管成形術的病人和大約10％分流術的病人很快發生動脈再栓塞。通常，通過由血管內皮細胞構成的平滑的動脈內壁來保護血管SMC。然而，分流術或血管成形術後，通常將SMC暴露出來。在修復傷口無效的情況下，細胞增殖並栓塞動脈。
本發明提供藥用組合物，它包含通過抑制血管平滑肌細胞增殖來抑制再栓塞時藥用有效量的上述定義的式I化合物和可藥用載體。
在優選的本發明組合物中，所述化合物為滷夫酮。
本發明進一步包含上述藥用組合物，其中載體為液體並且組合物為溶液。
在實施本發明中，藥用組合物中所加入滷夫酮的量可以廣泛變化。在測定精確量時所考慮的因素是本領域技術人員已知的。這些因素的實例包括但不限制於所治療的受試者，特定的藥用載體，所使用的給藥途徑和給予組合物的次數。
如上所述，以包含化合物和藥用載體的組合物的形式來給予本發明組合物。本文所使用的術語「藥用載體」包含任何標準藥用載體，如磷酸鹽緩衝的鹽水溶液，水，乳濁液如油/水乳濁液或甘油三酯乳濁液和各種溼潤劑。在通過靜脈和腹膜內給予化合物中所使用的適宜的甘油三酯乳濁液的實例為已知在商業上稱作脂肪乳劑(intralipid)的甘油三酯乳濁液。
在實施本發明中，給予藥用組合物受任何已知的給藥方法的影響，所述給藥方法包括但不限制於靜脈，腹膜，肌肉或皮下給藥。
用下列實施例中的某些優選實例並參考附圖來描述本發明，這樣可以更完全地了解和評價本發明，但這並不表示將本發明限定在這些特定實例中。相反，如權利要求中所述，所有替換，修改和相當本發明的部分都包括在本發明範圍內。因此，包括優選實例的下列實施例用於說明本發明的實施，應該知道，所描述的特例是作為實施例和僅用於說明性討論本發明優選實例，描述的原因是為了提供被認為是最有用的和容易理解的說明本發明方法，原則和概念的方法，在圖中


圖1是顯示滷夫酮對SMC增殖抑制作用的特徵曲線；圖2是顯示滷夫酮抗SMC增殖作用逆轉的特徵曲線；圖3a和3b分別是顯示滷夫酮對3H-胸苷加入血管SMCs中作用的條形圖和特徵曲線；圖4是顯示滷夫酮對血管內皮細胞增殖作用的特徵曲線；圖5a和5b分別是顯示滷夫酮對3H-胸苷加入血管內皮細胞中作用的條形圖和特徵曲線；圖6是顯示滷夫酮抗3T3成纖維細胞增殖作用的條形圖；圖7是顯示滷夫酮對bFGF促有絲分裂活性抑制作用的條形圖；圖8a和8b是在粉碎性損傷後，兔子耳中心動脈的彩色光學顯微攝影，它們分別顯示未處理的動脈和按照本發明處理的動脈；並且圖9是顯示滷夫酮對損傷引起的動脈狹窄作用的圖。
實施例1)、試驗方法細胞如上所述從牛主動脈的血管介質中分離出SMC〔例如，見J.J.Castellot等人，「肝素抑制血管平滑肌細胞增殖能力的結構測定證明是含3-O-硫酸根基的五糖序列，」J.Ceu Biol.，102卷；1979-1984頁(1986)；和A.Schmidt等人，「在富含2-O-硫酸化糖醛酸殘基的區域中，動脈的硫酸乙醯肝素殘基的抗增殖活性，」J.Biol.Chem.，267卷，19242-19247頁(1992)〕。
簡單地說，取出腹主動脈並在解剖顯微鏡下將筋膜清除。將主動脈縱向切開，將一小段介質小心地從血管壁上剝離下來。將平均直徑為2-3mm的2或3個該小條放到100mm含DMEM(4.5g葡萄糖/升)，10％FCS，100U/ml青黴素和100μl/ml鏈黴素組織培養皿中。在7-14天內，大片的多層細胞從組織培養塊中遷移出來。大約一周後，將細胞傳代培養到100mm組織培養盤(4-6×105細胞/盤)中。培養物(3-8代)表現出典型的血管SMC形態學特徵並且將細胞與選擇性識別肌動蛋白(HF-35)肌形態的單克隆抗體一起染色。該抗體不識別內皮細胞和成纖維細胞。
如上D.Gospodarowicz等人所述，從牛主動脈製備血管內皮細胞培養物〔「牛內皮細胞的克隆生長成纖維細胞生長因子作為存活劑，」Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，73卷，4120頁(1979)〕。在10％CO2溼潤的37℃保溫箱中，將原培養物保持在含10％小牛血清，50U/ml青黴素和50μg/ml鏈黴素的DMEM(1g葡萄糖/升)中。在活性細胞生長階段，每隔一天加入部分純化的腦產生的bFGF(100ng/ml)〔D.Gospodarowicz等人，ibid.，和I.Vlodavsky等人，「在不含成纖維細胞因子下保存的血管內皮細胞經歷結構和功能的改變。這與它們體內分化性質是不相容的，」J.Cell Biol.83卷，468-486頁(1979)〕。細胞增殖混入3H-胸苷將SMCs放在(4×104個細胞/16mm孔)含10％FCS的DMEM中。接種24小時後，將該培養基再放到含0.2％FCS的基質中，並在48小時後將細胞暴露到生長興奮劑和3H-胸苷(1μCi/孔)中24-48小時。通過測定混入三氯乙酸不溶物的放射活性來測定DNA的合成〔M.Benezra等人，「Reversal of bFGF Autocrine CellTransformation by Aromatic Compound，」Cancer Res.，52卷，5656-5662頁(1992)〕。生長速度將SMCs(1.5×104個細胞/孔)接種在24孔的培養板中並如上所述暴露到生長興奮劑中。接種1-6天後，用在PBS中的2.5％甲醛固定細胞。將培養板浸在0.1M硼酸鹽緩衝液(PH8.5)中，用亞甲蘭(1％，在0.1M硼酸鹽緩衝液中，PH8.5)染色(1h，24℃)並用水洗滌4次。實際上，該過程除掉所有未結合細胞的染料。用0.5ml 0.1N HCl(1h，25℃)將與特異性細胞結合的亞甲蘭溶解並通過測定在620nm下的吸收度來測定(Bar-Shavit等人，ibid.)。選擇開始放置的細胞量來確定試驗結束時細胞數目和吸收度之間的關係。在每個試驗中，在加入試驗化合物前固定3個孔來測定開始的吸收度。用該值和下列等式來計算對照和藥物處理細胞的倍增時間(DT)
DT＝In2/IN[(ODt/ODc)/h]其中DT＝倍增時間，小時；ODt＝試驗結束時試驗孔的光學密度；ODC＝試驗開始時試驗孔的光學密度；h＝孵育時間，小時通過用藥物處理細胞的倍增時間來除以對照細胞的倍增時間來計算生長速率〔A.Horowitz等人「脂質體包裹的阿黴素的體外細胞毒性依賴於脂質體組合物和藥物釋放，」1109卷，203-209頁(1992)〕。細胞數目將SMCs接種(2.5×103個細胞/孔)到24-孔板中含10％FCS的DMEM(4.5g葡萄糖/升)中並孵育6小時〔A.Schmidt等人「在富含2-O-磺化糖醛酸殘基區域中，動脈的硫酸乙醯肝素的抗組織活性，」J.Biol.Chem.，267卷，19242-19247頁(1992)〕。除掉培養基並將含10％FCS的試驗培養基(含或不含滷夫酮)加到四倍的孔中。孵育4天後，用Counter計數器來測定細胞數目(Schmidt等人，ibid.)。通過下式計算抑制程度％抑制＝1-在滷夫酮中的淨生長/在對照中的淨生長×100通過用最終細胞數目減去開始細胞數目來測定淨生長。2)、試驗結果i)、滷夫酮抗SMC增殖的作用生長速度將稀疏接種的血管SMC暴露到不含和含濃度遞增的滷夫酮的10％FCS中。將細胞用STV分離並且每天計數。如圖1所示，在含75ng/ml滷夫酮下，80-90％抑制SMC增殖，在125ng/ml下幾乎完全抑制。
在另一試驗中，將SMCs暴露到滷夫酮中48小時，除掉藥物並隨後在正規的生長培養基中生長。如圖2所證明的，除掉藥物使生長速度加快，與未處理SMCs的生長速度類似。混入3H-胸甙將保持在含10％FCS培養基中的分支血管下(subconfluentvascular)SMCs暴露到不含和含濃度遞增的滷夫酮的3H-胸甙中。如圖3a所示，在0.15μg/ml滷夫酮下完全抑制NA合成，而在0.05μg/ml濃度下獲得65％抑制(圖3b)。ii)、抗血管內皮細胞和3T3成纖維細胞增殖的作用血管內皮細胞將稀疏接種的牛主動脈內皮細胞暴露到不含和含濃度遞增的滷夫酮的10％FCS培養基中。將細胞用0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA分離並且每天計數。
主要在最初4天，在用相對高濃度(0.1-0.125μg/ml)的藥物處理的細胞中(圖4)觀察到內皮細胞增殖的抑制作用。與SMCs的結果不同，從第5天開始(圖5)，內皮細胞重新獲得幾乎正常的生長速度(倍增時間)，這表明，與血管SMCs相比，血管EC對滷夫酮的抑制作用不太敏感。混入胸苷的研究表明，在0.05μg/ml滷夫酮下，50％抑制DNA合成(圖5)。3T3成纖維細胞圖6表明，混入3H-胸苷時，在0.025μg/ml滷夫酮下即可完全抑制保持在含10％FCS培養基中的3T3成纖維細胞的生長，這說明與SMCs相比，成纖維細胞對藥物更敏感。bFGF誘導的細胞增殖作用在低濃度鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)存在下，可以很容易地刺激保持在含0.5％FCS培養基中的靜止期，生長停止的3T3成纖維細胞的生長。暴露到滷夫酮(0.025μg/ml)中幾乎完全抑制bFGF刺激的、在生長停止期3T3成纖維細胞中混入胸苷(圖7)。這說明，滷夫酮可有效的拮抗bFGF的促生長活性。iii)、由物理性損傷引起的動脈狹窄通過靜脈注射氯胺酮(50mg/kg)將紐西蘭白兔麻醉。將每個兔耳的中心動脈施以物理性損傷30分鐘〔Bahai等人，Circulation Res.，69卷，748-756頁(1992)〕。然後，按照動物福利條例的規定，將兔子安置在兔籠中。在擠壓後1小時和最初4天每隔24小時，通過皮下注射，將滷夫酮給予到物理性損傷區域。在第14天，將動物處死並將兔耳固定在10％緩衝的甲醛中72小時。將1mm長的擠壓部位進一步整理，在乙醇和二甲苯中脫水，並包埋在石蠟中。通過Movat五鉻(pentachrome)方法，將一系列(5μm)切片染色。在損傷部位和在距離損傷部位2mm處取下的相鄰正常動脈部分通過計算機法測面積。選擇正常部位是隨機的；幾乎一半接近和一半遠離損傷部位。描記由內部有彈力的薄層所限定的腔和區域(「原腔」)和由外部血管中層邊緣所限定的區域(總血管區域)，並計算新內皮和血管中層之間的比率。在所有情況下，選擇顯示新內皮增殖程度最大的信號區域測定面積。
參照圖8a和8，可以看到在外部擠壓損傷後14天時兔耳這些動脈的關係顯微圖(Movat染色的有代表性的截面)。
在圖8a中，SMCs通過破裂的內部彈性薄層，從血管中層遊走到新內皮中並且由於使未處理動脈的新內皮突出而使得動脈腔狹窄。如圖可見明顯的內皮形成並且幾乎使動脈腔完全消失，作為對比，在圖8b中，可見經過擠壓損傷並用滷夫酮處理的兔耳動脈。並看到滷夫酮幾乎完全抑制了新內皮形成。
圖9顯示，在對照兔和用滷夫酮(H)或合成的模擬(mimicking)肝素化合物(M)處理的兔中進行的，新內皮和血管中層之間比率的定量分析。每個點代表一隻兔子。結論目前抑制血管SMC增殖的方法利用了肝素，蘇拉明，各種促生長因子抗體，抗凝血酶劑，並且最近又利用了反意義DNA技術。肝素是有效的抗凝血劑，其抗增殖活性相對小並且根據來源和生產公司不同，該活性發生很大改變。蘇拉明在有效劑量下毒性很高，而抗體價格昂貴，半衰期短並且可誘發免疫反應。關於反意義方法的信息是新的並且目前其應用受到一定限制。
本發明在其最優選實例中，利用了高效，花費不多和無毒的化合物，該化合物可抑制各種生長因子，包括bFGF的活性，並且可抑制血管SMC和成纖維細胞的autocrine生長。此外，滷夫酮是低分子量的化合物，它可以通過口服給予。F.D.A.已經提出將該化合物用於農場的動物中。這些特性使得滷夫酮最有希望成為臨床用於抑制再狹窄的藥物。
因此，本發明提供利用滷夫酮作為有效地抑制SMC增殖的無毒化合物，由此提供有效的方法來抑制動脈粥樣硬化，冠狀動脈血管成形術後再狹窄和在隱靜脈移植物中新內皮增殖等病理生理改變。
很明顯，對於本領域技術人員來說，本發明並非限制於上述說明性實例的敘述中並且本發明可以包括在不離開其基本特徵的其它特定形式中，因此，應該知道，本發明實例和實施例在各個方面都是說明性的而並非限定性的，參見權利要求而並非上述說明書，因此，任何在權利要求含義和範圍內的改變都包括在本發明範圍內。
權利要求
1.通過抑制血管平滑肌細胞增殖來抑制再狹窄的藥用組合物，它包括作為其中活性組分的式I化合物
其中R1為下列基團氫，滷素，硝基，苯並，低級烷基，苯基和低級烷氧基；R2為下列基團羥基，乙醯氧基，和低級烷氧基，並且R3為下列基團氫和低級鏈烯氧基-羰基；和可藥用載體。
2.權利要求1組合物，其中，所述化合物為滷夫酮。
3.抑制病人再狹窄的方法，它包括給予該病人一定量的權利要求1藥用組合物，通過抑制所述病人血管平滑肌細胞增殖來有效地抑制再狹窄。
全文摘要
本發明提供通過抑制血管平滑肌細胞增殖來抑制再狹窄的藥用組合物，它包含作為其中活性組分的式I化合物，其中R
文檔編號A61P9/00GK1163566SQ95195353
公開日1997年10月29日 申請日期1995年8月29日 優先權日1994年8月31日
發明者A·鈉格勒, S·斯拉溫, I·夫勞達斯基, M·比尼斯 申請人:C·M·戴維德桑, 以色列農業部農業研究組織, 基爾亞特·哈達薩·哈達希特醫學研究服務與開發有限公司