用sca1-樣基因的rna幹擾控制線蟲的組合物和方法

2023-04-28 10:18:31 2

專利名稱：用sca1-樣基因的rna幹擾控制線蟲的組合物和方法
用SCAl-樣基因的RNA幹擾控制線蟲的組合物和方法 對相關申請的交叉引用線蟲破壞的徵兆包括葉的生長遲緩和黃化，以及植物在熱周 期中的萎蔫。然而，線蟲(包括SCN)可引起顯著的產量損失而沒有明顯 的地上症狀。另外，被SCN感染的根是短小的或發育遲緩的。線蟲感染可 減少根上固氮根瘤的數量，並可使得根對其他土壤帶有的植物病原體的攻 擊更加易感。[第6段線蟲生活周期有三個主要的階段卵、幼蟲(juvenile)和成蟲。 生活周期在線蟲物種之間變化。例如，在最適條件下SCN生活周期通常可 在24到30天內完成，而其他物種完成生活周期可耗時長達一年或更久。 在春天溫度和溼度水平變得適宜時，從土壤中的卵孵化出蠕蟲狀的幼蟲。 這些幼蟲是唯一能夠感染大豆根的線蟲生命階段。線蟲依賴其自身力量在土壤中每年只能穿行幾英寸。然而， 線蟲侵染可以以多種方式傳播相當遠的距離。可以移動受侵染土壤的任何 事物，包括農場機械、車輛和工具、風、水、動物和農場工人，都能夠傳 播這種侵染。種子大小的土壤顆粒往往汙染收穫的種子。因此，當來自受 侵染田地的汙染種子在非侵染田地中播種時，可以傳播線蟲侵染。甚至還
6存在某些線蟲種類可以通過鳥類傳播的證據。僅可以預防這些起因中的某 些起因。
笫10段]防治線蟲侵染的常規方法包括在線蟲侵染的土地中保持 合適的土壤養分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆蟲與雜草病 害；使用消毒措施，如僅在處理完成的非侵染田地後，才翻耕、播種和中 耕線蟲侵染的田地；在侵染的田地中工作後用高壓水或蒸汽徹底清潔設備； 不使用在侵染田地中生長的種子播種非侵染田地，除非這種種子已經得到 正確地清潔；輪作受侵染田地並且用非宿主作物替換宿主作物；使用殺線 蟲劑；和播種抗性植物品種。對於RNAi的作用已提出了許多模型。在哺乳動物系統中， 大於30個核苷酸的dsRNA以一種非序列特異性方式引發誘導幹擾素的合成以及蛋白質合成的總體停止。但是，美國專利號6,506,559揭示，在線蟲 中，對應於靶基因序列的dsRNA的長度可為至少25、 50、 100、 200、 300 或400鹼基，甚至更長的dsRNA也能有效誘導秀麗隱杆線蟲中的RNAi。 已知當用包含98~854個核苷酸的雙鏈區的髮夾RNA構建體轉化許多植物 品種時，能有效沉默粑植物基因。 一般認為在包括線蟲和植物的許多生物 中，大片的dsRNA在細胞內被切割成大約19-24個核苷酸的片段(siRNA )， 這些siRNA是RNAi現象的實際介質。圖4展示用於二元載體p(R)SA006的499核苷酸片段的序 列(SEQIDNO:ll)，所述二元載體p(R)SA006用於轉化大豆細胞，以在大 豆植物中產生本發明的dsRNA，由此抑制文中鑑定的大豆胞嚢線蟲seal -樣靶基因。本發明可以通過參考以下詳細描述的本發明優選實施方案 及本文所包含實施例而更容易地理解。除非另外說明，本文中所用術語將 根據相關領域普通技術人員的習慣用法加以理解。除了下文提供的術語定 義外，分子生物學中常用術語的定義也可以在Rieger等，1991 Glossary of genetics: classical和molecular,第五版,Berlin: Springer-Verlag; 和在 Current protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel等編著，Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.與John Wiley & Sons, Inc.的 合資企業(1998增刊)中找到。應當理解如本說明書及在權利要求書中所用， "一種(a)"或"一個(an)"可以意指一個或多個，這取決於該冠詞所用的上下 文。因此，對"單數細胞"的稱謂可以意指可以使用至少一個細胞。還應當 理解本文中使用的術語僅僅旨在描述具體實施方案而並非意味對其限制 性。如此處所用的術語"控制"當用於感染的上下文中時指感染 的降低或預防。減低或預防線蟲的感染會使植物具有對線蟲增加的抗性； 但是，這種增加的抗性並不意p未著植物必須100%地抗線蟲感染。在優選 實施方案中，在抗性植物中對線蟲感染的抗性比對線蟲無抗性的野生型植 物高10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或95%。 優選所述野生型植物是具有與線蟲抗性增加的植物相似或更優選相同的基 因型，但是不包含針對靶基因的dsRNA的植物。植物對線蟲感染的抗性 可以是由於當線蟲暴露於特異性針對必須基因的dsRNA時，線蟲的死亡、 不育、停止發育或移動性受損造成的。此處使用的術語"對線蟲感染的抗性" 或"具有線蟲抗性的植物"指與野生型植物相比，植物避免線蟲感染、殺死 線蟲或阻止、減少或停止線蟲的發育、生長或增殖的能力。這可以通過主 動過程達到，例如通過產出對線蟲有害的物質，或通過^^皮動過程達到，例 如含有降低的線蟲所需的營養價值或不形成由線蟲採食部位誘導的結構例 如合胞體或巨大細胞。植物的線蟲抗性水平可以以多種方法檢測，例如， 計數能夠在植物上建立寄生的線蟲數量，或測量線蟲發育時間、雌雄線蟲 的比例，或對於胞嚢線蟲計數在感染的植物的根部或植物分析系統中產生 的胞嚢數量或線蟲卵的數量。[第38段若非上下文中另外說明。術語"植物"涵蓋植物發育或成熟 的任何階段，以及取自任何這樣的植物的任何組織或器官(植物部分)。 植物部分包括，但不限於莖、根、花、胚珠、雄蕊、種子、葉、胚、分生 組織區、愈傷組織、花葯培養物、配子體、孢子體、花粉、微孢子、原生 質體、毛根培養物等等。本發明還包括用本發明的植物製備的種子。在一 個實施方案中，與植物種子的野生型變體相比，種子確實被育種為有提高 的抗線蟲感染的抗性。如此處所用，"植物細胞"包括但不限於，原生質體、 產生配子的細胞和再生為完整植林的細胞。植物多種組織的組織培養物和 從這些組織培養物的植物再生為本領域所公知且已經充分公開。.
第39段如此處使用的術語"轉基因"指含有至少一個重組多核苷酸 的全部或部分的任何植物、植物細胞、愈傷組織、植物組織或植物部分。 在許多情況下，重組多核苷酸的所有或部分被穩定整合入染色體中，或是 穩定的染色體外元件，從而能夠傳遞至下一代。出於本發明的目的，術語"重 組多核苷酸"指的是已經由遺傳工程改變、重排或修飾的多核苷酸。其實例 包括連接到或加入到異源序列的任何克隆多核苷酸。術語"重組"並非指天 然發生事件所導致的多核苷酸的改變，例如自發突變或通過選擇性育種導 致的非自發突變。對應本發明的scal-樣靶基因的完整cDNA可以用此處提 供的信息和生物技術領域技術人員已知的技術從寄生線蟲而不是大豆胞嚢 線蟲中分離。例如，在嚴格條件下與SEQIDNO: 1、 10或11的核苷^ 列雜交的來自寄生線蟲的核酸分子可以從寄生線蟲cDNA文庫中分離。或 者，可以從寄生線蟲細胞中分離mRNA， cDNA可以用反轉錄酶製備(例如 Moloney MLV反轉錄酶)。可以基於SEQ ID NO: 1、 10或11所示的核苷 ^列設計用於聚合,式反應擴增的合成寡核苷酸引物。此類引物的實 例由SEQIDNO:2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9給出。對應於本發明寄生線蟲 靶基因的核酸分子可以根據標準PCR擴增技術，使用cDNA或備選的基 因組DNA作為才莫板，以及適宜的寡核苷酸引物擴增。這樣擴增的核酸分 子可以克隆至合適的載體中，並通過DNA序列分析來表徵。在另一實施方案中，本發明提供分離的重組表達載體，其 包含編碼如上所述dsRNA的核酸，其中與宿主植物細胞的野生型品種相 比，該載體在宿主植物細胞中的表達導致對寄生線蟲的抗性增加。如此處 所用的術語"載體"指能夠轉運其已經連接的另一個核酸的核酸分子。 一種 類型的載體是"質粒"，指環狀雙鏈DNA環，附加的DNA片段可以連接其 中。另一種類型的載體是病毒載體，其中附加的DNA片段可以連接到病 毒基因組中。某些載體能夠在它們導入的宿主植物細胞中自主複製。其他 載體在導入宿主細胞時整合入宿主植物細胞的基因組中，從而隨著宿主基 因組一起複製。此外，某些載體能夠指導其有效連接的基因的表達。這樣 的載體在此稱為"表達載體"，用於重組DNA技術的表達栽體一般是質粒 的形式。在本說明書中，"質粒"和"載體"可互換使用，因為質粒是載體的 最常用形式。但是，本發明意欲包括具有相同功能的表達載體的其他形式， 例如病毒栽體(例如馬鈴薯病毒X，菸草rattle病毒和雙粒病毒組)。發育階段優先的啟動子在發育的特定階段優先表達。組織 個器官優先的啟動子包括那些在特定組織和器官優先表達的啟動子，例如 葉、根、種子或木質部。組織優先或器官優先啟動子的實例包括但不限於 果實優先、胚珠優先、雄性組織優先、種子優先、珠被優先、塊莖優先、 柄優先、果皮優先和葉子優先、柱頭優先、花粉優先、花葯優先、花瓣優 先、萼片優先、花梗優先、長角果優先、根優先、莖優先等等。種子優先 的啟動子在種子發育和/或萌發時優先表達。例如，種子優先啟動子可以是 胚優先、胚乳優先和種皮優先的。見Thompson等人，1989， BioEssays 10:108。種子優先的啟動子包括但不限於纖維素合酶(celA)、 Ciml、 y-玉米 醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(cZ19Bl)等。
第59段
其他適宜的組織優先或器官優先啟動子包括但不限於，油 菜籽napin-基因啟動子(美國專利號5，608，152)、蠶豆(KZc/"/Wtf ) USP-
啟動子(Baeumlein等人，1991， Mol Gen Genet. 225(3):459-67)、擬南芥油質 蛋白啟動子(PCT申請No. WO 98/45461)、菜豆(」P/iflMo/"s vw/gfln's )菜豆
素啟動子(美國專利號5,504,200)、芸莒Bce4-啟動子(PCT申請No. WO 91/13980)、或豆3求蛋白B4啟動子(LeB4; Baeumlein等人，1992， Plant Journal, 2(2):233-9),以及在像玉蜀黍、大麥、小麥、黑麥、稻等單子葉植 物中賦予種子特異性表達的啟動子。要關注的適宜啟動子是大麥的lpt2或 lptl-基因啟動子(PCT申請No. WO 95/15389和PCT申請No. WO 95/23230)，或在PCT申請No. WO 99/16890中描述的那些啟動子(大麥醇 溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的醇溶谷蛋白基因、 小麥的麥膠蛋白基因、小麥的谷蛋白基因、燕麥的谷蛋白基因、高粱的 kasirin基因和黑麥的黑麥鹼基因)。[第60段]用於本發明的表達盒的其他啟動子包括但不限於，主要葉 綠素a/b結合蛋白啟動子、組蛋白啟動子、Ap3啟動子、p-conglycin啟動 子、油菜籽蛋白啟動子、大豆凝集素啟動子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白 啟動子、22kD玉米醇溶蛋白啟動子、27kD玉米醇溶蛋白啟動子、g-玉米 醇溶蛋白啟動子、蠟質基因(waxy)啟動子、超甜基因(shrunken)l啟
動子、超甜基因2啟動子和bronze基因啟動子、Zml3啟動子、(美國專利 號5，086，169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶啟動子(PG)(美國專利號 5,412,085和5，545，546)和SGB6啟動子(美國專利號5,470,359),以及合成 的或其他天然啟動子。
第61段根據本發明，所述表達盒包括與核普酸序列有效連接的表 達控制序列，該核苷酸序列是所述dsRNA的一條或兩條鏈的;f莫板。該 dsRNA模板包括(a)具有下述序列的第一鏈，所述序列與SEQ ID NO:l 的大約19至大約400-500個或至多全長的連續核苷睃基本相同；和(b)具 有與第一鏈基本互補的序列的第二鏈。在另一的實施方案中，啟動子位於 所述模板核苷酸序列任一端的側翼，其中所述啟動子驅動各個單獨的DNA 鏈的表達，進而產生兩條互補的RNA，這兩條互補的RNA能夠雜交並形 成所述dsRNA。在備選的實施方案中，核苷酸序列在一個轉錄單元上被轉 錄成dsRNA的兩條鏈，其中，正義鏈從轉錄單元的5，端轉錄，而反義鏈 從3，端轉錄，其中這兩條鏈隔開大約3-500個鹼基對，並且轉錄之後，該 RNA轉錄物自身摺疊形成髮夾結構。在另一實施方案中，所述載體含有雙向啟動子，驅動兩個 核酸分子的表達，由此一個核酸分子編碼與seal-樣基因的部分基本相同的 序列，而另一個核酸分子編碼與第一鏈基本上互補的第二序列，並且當兩 個序列都轉錄時能夠形成dsRNA。雙向啟動子是能夠在兩個方向介導表達 的啟動子。在另一實施方案中，所述載體含有兩種啟動子， 一個介導 與scal-樣基因的部分基本相同的序列的轉錄，另一個啟動子介導與第一鏈基本上互補的第二序列的轉錄，並且當兩個序列都轉錄時能夠形成
dsRNA。第二啟動子可以是不同的啟動子。或者在一個實施方案中，植物是雙子葉植物，優選地是豆科(Fabaceae) 、 科(Solanaceae)、 十字花科(Brassicaceae)、 藜科(Chenopodiaceae)、 菊科(Asteraceae)、 錦蔡科(Malvaceae)、 亞麻科(Linaceae)、 大戟科(Euphorbiaceae)、 旋花科(Convolvulaceae)、 蕃蔽科(Rosaceae)、 葫,科(Cucurbitaceae)、 山茶科(Theaceae)、 萏草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或牙計橘科(Citrus)的植物。在一個實施方案中，植物是豆科、茄科或十字花科的植物。因此，在一個實施方案中，植物是豆科，優選地是大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、落花生屬(Arachis)、鷹嘴豆屬(Cicer)、蠶豆屬(Vicia)、菜豆屬(Phaseolus)、羽扇豆屬(Lupinus)、苜藉屬(Medicago)或兵豆屬(Lens)。優選的豆科物種是截形苜蓿(M. truncatula)、紫苜蓿(M， sativa)、大豆(G. max)、豌豆(P. sativum)、花生(A. hypogea)、鷹嘴豆(C. arietin腿)、蠶豆(V. faba)、菜豆(P. vulgaris)、白羽扇豆(Lupinus albus)、黃羽扇豆(Lupinus luteus)、狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)或兵豆(Lens culinaris)。 更優選的是大豆(G. max)、花生(A.hypogea)和紫苜蓿(M. sativa)物種。最優選的是大豆(G. max)。當植物是茄科(Solanaceae)時，優選的屬是痴屬(Solanum)、番痴屬(Lycopersicon)、菸草屬(Nicotiana)或辣椒屬(Capsicum)。優選的茄科物種是馬鈴薯(S.
26tuberosum)、番茄(L. esculentum)、菸草(N. tabaccum)或黃燈籠辣椒(C.chinense)。更優選的是馬鈴薯(S. tuberosum)。因此，在一個實施方案中，植物是十字花科(Brassicaceae)，優選的是芸苔屬(Brassica)或蘿蔔屬(Raphanus)。優選的十字花科(Brassicaceae)物種是歐洲油菜(B. napus)、甘藍(B. oleracea)、芥菜(B. juncea)或蕪青(B. rapa)物種。更優選的是歐洲油菜(B. napus)物種。當植物是藜科(Chenopodiaceae)時，優選的屬是甜菜屬(Beta),優選的物種是甜菜(B. vulgaris)。當植物是菊科(Asteraceae)時，優選的屬是向日葵屬(Helianthus),優選的物種是向日葵(H. annuus)。當植物是錦葵科(Malvaceae)時，優選的屬是棉屬(Gossypium)或秋葵屬(Abelmoschus)。當屬是棉屬(Gossypium)時，優選的物種是陸地棉(G.hirsutum)或海島棉(G. barbadense)，最優選的物種是陸地棉(G. hirsutum)。秋葵屬(Abelmoschus)的優選的物種是咖啡黃葵(A, esculentus)。當植物是亞麻科(Linaceae)時，優選的屬是亞麻屬(Linum),優選的物種是亞麻(L.usitatissimum)。當才直物是大戟科(Euphorbiaceae)時，優選的屬是木薯屬(Manihot)、麻風樹屬(Jatropa)或Rhizinus ,優選的物種是木薯(M.esculenta)、 麻風樹(J. curcas)或 R. comunis 。 當植物是旋花科(Convolvulaceae)時，優選的屬是番薯屬(Ipomea)，優選的物種是I. batatas。當植物是薔薇科(Rosaceae)時，優選的屬是薔薇屬(Rosa)、蘋果屬(Malus)、梨屬(Pyrus)、李屬(Prunus)、懸鉤子屬(Rubus)、茶薦子屬(Ribes)、越橘屬(Vaccinium)或草莓屬(Fragaria)，優選的物種是雜種荷蘭草莓(Fragaria xananassa)。當才直物是葫,科(Cucurbitaceae)時，優選的屬是香瓜屬(Cucumis)、西瓜屬(Citrullus)或南瓜屬(Cucurbita)，優選的物種是黃瓜(Cucumis sativus)、 西瓜(Citrullus lanatus)或西葫,(Cucurbita pepo)。 當植物是山茶科(Theaceae)時，優選的屬是山茶屬(Camellia)，優選的物種是茶(C. sinensis)。當植物是茜草科(Rubiaceae)時，優選的屬是咖啡屬(Coffea)，優選的物種是小果咖啡(C. arabica)或中果咖啡(C. canephora)。當植物是梧桐科(Sterculiaceae)時，優選的屬是可可樹屬(Theobroma)，優選的物種是可可樹(T. cacao)。當植物是柑橘屬(Citrus)時，優選的物種是甜橙(C. sinensis)、檸檬(C. limon)、桔(C. reticulata)、柚(C， maxima)和才計橘物種的雜種等等。在本發明的一個優選的實施方案中，植物是大豆、馬鈴薯或玉米植物。
l第68段
轉化或轉染包括植物細胞的宿主細胞的適當方法在植物生物生物技術領域內已知。任何方法都可以用於將重組表達載體轉化入植物細胞中以獲得本發明的轉基因植物。轉化雙子葉植物的一般方法公開於例如美國專利號4,940,838和5,464,763等中。轉化具體雙子葉植物(例如棉花)的方法在美國專利號5，004，863、 5，159，135和5，846，797中列出。大豆轉化方法於美國專利號4,992,375、 5,416,011、 5，569，834、 5,824,877和6,384,301中列出，也可以使用EP0301749B1中的方法。轉化方法可包括直接或間接轉化法。適當的直接方法包括聚乙二醇誘導的DNA攝取、月旨質體介導的轉化(US 4,536,475)、用基因槍的生物發射技術(Fromm ME等人，Bio/Technology. 8(9):833畫9， 1990; Gordon國Kamm等人Plant Cell2:603,1990)、電穿孔、在含DNA的溶液中孵育幹胚和微注入法。在直接轉化法的情況下，所用質粒不需要滿足任何特殊要求。可以使用簡單的質粒，例如pUC系列的質粒、pBR322、 M13mp系列和pACYC184等等。如果要從轉化的細胞再生完整的植物，優選在質粒中有一個附加的選擇性標記基因。直接轉化技術對雙子葉和單子葉植物都同等適用。還可以通過利用農桿菌(例如EP0 116"S)的細菌感染、利用病毒載體(EP 0 067 553、 US 4,407,956、 WO 95/34668、 WO 93/03161)的病毒感染來進行轉化或藉助花粉轉化(EP 0 270 356; WO 85/01856; US4,684,611)。農桿菌類轉化技術(尤其是對於雙子葉植物)為本領域>^知的技術。農桿菌菌林(例如才艮癌農桿菌或毛才艮農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes))包括質粒(Ti或Ri質粒)和用農桿菌感染之後轉移入植物的T-DNA元件。該T-DNA(轉移DNA)被整合到植物細胞的基因組中。T-DNA可定位在Ri-或Ti-質粒上，或者分開包括在所謂的雙元載體中。農桿菌介導的轉化方法記栽於例如Horsch RB等人(1985) Science 225:1229中。農桿菌介導的轉化最適用於雙子葉植物，也已經適用於單子葉植物。用農桿菌的轉化記載於下列文獻中，例如White FF， Vectors for Gene Transfer inHigher Plants, Transgenic Plants,第1巻，Engineering and Utilization, S.D.Kung和R. Wu編著，Academic Press, 1993，第15 38頁、Jenes B等人Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants,第1巻，Engineeringand Utilization, S.D. Kung和R. Wu編著，Academic Press, 1993，第128-143頁和Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225中。轉化可能會導致瞬時或穩定的轉化和表達。雖然本發明的核苷酸序列可以插入到屬於這些廣泛類別的任何植物和植物細胞中，但是它特別適用於作物植物細胞。利用植物育種中的已知方法，本發明的轉基因植物可以與相似的轉基因植物雜交，或與缺少本發明核酸的轉基因植物雜交，或與非轉基因植物雜交，來產生種子。此外，本發明的轉基因植物可包括、和/或與另一種含有一種或多種核酸的轉基因植物雜交，從而在該植物和/或其
後代中形成轉基因的"垛疊"。然後種植種子來得到雜交的能育的含有本發明核酸的轉基因植物。該雜交能育的轉基因植物可以具有特定的通過母本或通過父本遺傳的表達盒。第二代植物可以是近交植物。雜交的能育轉基因植物可以是雜交種。本發明還包括任何這些雜交能育轉基因植物的種子。本發明種子可從能育轉基因植物收穫，並用於生長包括含有所述DNA構建體的雜交植物系的本發明轉化植物的後代。3'cDNA端使用GeneRacer試劑盒(Invitrogen， Carlsbad,CA，目錄號L1500-01)擴增。cDNA的第一鏈使用總RNA和GeneRacerOligo dT引物(SEQ ID NO:12)通過反轉錄產生。3， RACE PCR使用GeneRacer 3，引物(SEQ ID NO:5)和基因特異性正向引物(SEQ ID NO:4)進行。巢式PCR反應隨後使用GeneRacer 3， Nested引物(SEQ ID NO:7)和基因特異性正向引物(SEQ ID NO:6)進行。PCR產物克隆入pCR4-TOPO (Invitrogen， Carlsbad, CA)並測序。使用PCR引物(圖2中的SEQ ID NO: 8和9)和秀麗隱杆線蟲基因組DNA作為模板從秀麗隱杆線蟲分離實施例l中鑑定的SCN靼基因的同源物。(參見K11D9.2, Genbank， National Center forBiotechnology Information, Bethesda， MD)此PCR產物(長度大約1 kb)克隆進入pLitmus28i (New England Biolabs， Beverly, MA)的多克隆位點，由此秀麗隱杆線蟲基因片段以頭對頭構型側接兩個T7啟動子。用於RNAi測試中的秀麗隱杆線蟲基因片段的DNA序列示於圖3 (SEQ ID NO: 10)。選擇和根誘導後2到3周，在外植體的切開末端上形成轉化的根。將外植體轉移至相同的選擇培養基(S-BS,0S培養基)中進行進一步選擇。在該培養基中， 一周內轉基因根良好增殖並適合進行繼代培養。將強壯的白色大豆根從生根的外植體上切下，並培養於六孔平板中的補充有200 mg/l特美汀的根生長培養基(S-MS-606培養基)中。暗處室溫維持培養物。S-MS-606培養基包括0.2 x MS鹽和維生素B5， 2%的蔗糖和200mg/l特美汀，pH為5.8。本領域技術人員會知曉，或僅僅通過常規的實驗就能夠確定此處描述的本發明具體實施方案的許多等同方案。所附權利要求書意在涵蓋這些等同物。
權利要求
1.dsRNA分子，其包含i)包含下述序列的第一鏈，所述序列與寄生線蟲sca1-樣靶基因的部分基本相同；和ii)包含與第一鏈基本互補的序列的第二鏈，其中所述靶基因是寄生線蟲sca1-樣基因。
2，權利要求1的dsRNA分子，其中所述靼基因的部分是選自以下的 序列a)包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸；(b)包含與 SEQIDNO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多核苷酸；和 (c)來自線蟲的多核苷酸，其在嚴格條件下與包含SEQIDNO:l、 10或11 所示的序列的多核苷酸雜交。
3，包含多個RNA分子的dsRNA分子庫，每個所述RNA分子包含具 有約19到24個核苷酸長度的雙鏈區，其中所述RNA分子衍生自選自以 下的多核苷酸a)包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸； (b)包含與SEQ ID NO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多 核苷酸；和(c)來自線蟲的多核苷酸，其在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸雜交。
4. 能夠表達下述dsRNA的轉基因植物，所述dsRNA與寄生線蟲scal-樣靶基因的部分基本相同。
5. 權利要求4的轉基因植物，其中所述耙基因包含選自以下的序列 a)包含SEQIDNO:1、10或11所示的序列的多核苷酸；(b)包含與SEQ ID NO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多核苷酸；和(c)來 自寄生線蟲的多核普酸，其在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:l、 10或11 所示的序列的多核苷酸雜交。
6. 權利要求4的轉基因植物，其中所述dsRNA包含大量RNA分子， 每個所述RNA分子包含具有大約19-24個核苷酸長度的雙鏈區，其中所述 RNA分子衍生自選自以下的多核苷酸'.a)包含SEQ ID NO:l、 10或11 所示的序列的多核苷酸；(b)包含與SEQIDNO:1、10或11具有至少80% 序列同一性的序列的多核苷酸；和(c)來自寄生線蟲的多核苷酸，其在嚴格條件下與包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序列的多核普酸雜交。
7. 權利要求4的轉基因植物，其中所述植物選自大豆、馬鈴薯、番 茄、花生、棉花、木薯、咖啡、椰子、鳳梨、柑橘樹、香蕉、玉米、油菜、 甜菜、向日葵、高粱、小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、四季豆(green bean)、 利馬豆、豌豆和菸草。
8. 權利要求4的轉基因植物，其中所述植物是大豆植物。
9，控制寄生線蟲對植物的感染的方法，其包括將線蟲暴露於下述 dsRNA分子的步驟，所述dsRNA分子與線蟲必需的耙基因的部分基^目 同，由此控制線蟲對植物的感染，其中所述粑基因是寄生線蟲scal-樣基因。
10.權利要求9的方法，其中所迷耙基因包含選自以下的序列a)包 含SEQ ID NO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸；(b)包含與SEQ ID NO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多核苷酸；和(c)來 自寄生線蟲的多核苦酸，其在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:l、 10或11 所示的序列的多核苦酸雜交。
11，製備能夠表達scal-樣dsRNA的轉基因植物的方法，所述scal-樣 dsRNA與寄生線蟲中耙基因的部分基本相同，所述方法包括步驟a)製備 具有下述區域的核酸序列，所述區域與寄生線蟲seal-樣靶基因的部分基本 相同，其中所述核酸在植物中表達時能夠形成scal-樣雙鏈轉錄物；b)用所 述核酸轉化受體植物；c)產生所述受體植物的一個或多個轉基因子代；和 d)選擇表達所述轉錄物的子代。
12. 權利要求11的方法，其中所述耙基因包含選自以下的序列a)包 含SEQ ID NO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸；(b)包含與SEQ ID NO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多核苷酸；和(c)來 自寄生線蟲的多核苷酸，其在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:l、 10或11 所示的序列的多核苷酸雜交。
13. 權利要求ll的方法，其中所述靶基因的部分是選自以下的序列的 大約19至大約400個核苷酸a)包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序 列的多核普酸；和(b)來自寄生線蟲的多核苷酸，其在嚴格條件下與包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸雜交。
14. 權利要求ll的方法，其中所述植物選自大豆、馬鈴薯、番茄、 花生、棉花、木薯、咖啡、椰子、鳳梨、柑橘樹、香蕉、玉米、油菜、甜 菜、向日葵、高粱、小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、四季豆、利馬豆、豌 豆和菸草。
15. 權利要求ll的方法，其中所述植物是大豆植物。
全文摘要
本發明涉及能夠抑制寄生線蟲中必需基因表達的雙鏈RNA組合物和轉基因植物，以及與之相關的方法。具體地，本發明涉及RNA幹擾在抑制線蟲必需靶基因表達中的用途，所述線蟲必需靶基因為線蟲sca1-樣基因，並且涉及對寄生線蟲具有增加的抗性的植物的產生。
文檔編號C12N15/82GK101605897SQ200880004547
公開日2009年12月16日 申請日期2008年2月7日 優先權日2007年2月9日
發明者S·希爾 申請人:巴斯福植物科學有限公司