一種新組織血管生成方法
2023-04-28 20:34:11 2
專利名稱：一種新組織血管生成方法
技術領域：
本發明屬於化合物藥理作用和分子生物技術領域，具體涉及一種新組織血管生成方法。
背景技術：
血管生成(angiogenesis)是指在原有血管床的基礎上再生成新血管，是一個複雜的受多因素調控的過程，它有別於血管發生過程。血管生成是一個由多種細胞因子和多種細胞成分參與的、動態的、協調的複雜過程，其起始的中心環節是血管內皮細胞或基質幹細胞的遷移、分裂、分化，以及隨後的管腔化，受到血管生成誘導因子和抑制因子的精密調節。生理學上的血管生成多見於傷口癒合，或月經周期中子宮內膜的血管生成，但在腫瘤、 動脈硬化、銀屑病、糖尿病性視網膜病及子宮內膜異位症等一些過程中則是一種病理性現象。血管生成在腫瘤的發生和轉移過程中是必不可少的，絕大多數惡性腫瘤的生長和轉移都是血管依賴的，即腫瘤組織在其生長過程中會誘導新血管的生成。這個在腫瘤生長過程中被誘發的血管生成現象，稱之為腫瘤新生血管生成。阻斷血管生成是一種新治療腫瘤的手段和途徑。破壞或者抑制腫瘤的新生血管生成，有效地阻止腫瘤的生長和轉移的藥物稱之為腫瘤新生血管生成抑制劑(tumorangiogenesis inhibitor, TAI)。血管生成模型的建立是篩選抗血管生成藥物的前提，已經報導的模型有鼠耳模型、雞胚尿囊膜模型等，但這些模型都有其缺點，普遍具有定量繁瑣，成活率不高的缺點。因此建立一種簡單、方便而又能夠被廣泛應用的新組織血管生成的模型是十分必要的。
發明內容
為了克服上述現有技術存在的不足，本發明的目的在於提供一種新組織血管生成方法，克服了定量繁瑣和成活率不高的缺點，建立了一種簡單、方便而又能夠被廣泛應用的新組織血管生成的模型，該方法還能應用於腫瘤血管生成抑制劑的篩選研究。為了達到上述目的，本發明所採用的技術方案是一種新組織血管生成方法，無菌條件下取小鼠或大鼠胸主動脈、心、肝、脾、肺、血管、腎和結腸組織，隨即放入預冷的PBS液中清洗，胸主動脈的處理方法為用眼科手術剪及鑷子去除動脈管外的纖維和脂肪組織，用PBS液清洗後，在放大鏡下，於預冷的DMEM培養基中切取成長度為0. 3mm的動脈環或者剪成長度為0. 3mm的動脈塊，而心、肝、脾、肺、腎和結腸組織的處理方法為用眼科手術剪及鑷子去除組織周邊的粘連組織後剪成Imm3大小的組織塊，取纖維蛋白原溶液平鋪於培養板中，培養板的每孔容量為200 μ L，培養板的每孔中加凝血酶1 μ L，搖勻後形成凝膠，將切取的組織塊植於培養板的凝膠上，再往培養板的每孔中加纖維蛋白原溶劑200 μ L和凝血酶1 μ L，搖勻後形成凝膠，這樣就形成了三明治式的夾層結構，於該夾層結構上加含質量濃度3-10%胎牛血清的DMEM培養基lmL，放入體積濃度為 5%的(X)2和溫度為37°C的培養箱中培養，以此就能生成主動脈、心、肝、脾、肺、腎和結腸組織各自對應的新組織血管。
所述的生成主動脈、心、肝、脾、肺、腎和結腸組織各自對應的新組織血管的速度快慢依次為肺的新組織血管>脾的新組織血管>肝的新組織血管>心的新組織血管>腎的新組織血管 > 結腸的新組織血管 > 血管的新組織血管，其中結腸的新組織血管生成的過程分為內皮細胞遷出形成血管和血管生成兩種。所述的DMEM培養基中包括VEGF或者bFGF生長因子。所述的肺的新組織血管生成後加入塔斯品鹼，能對於肺的新組織血管具有抑制作用，而所述的結腸的新組織血管生成後加入塔斯品鹼衍生物1822對結腸組織血管生成具有抑制作用。通過一種新組織血管生成方法，通過在無菌條件下取小鼠或大鼠胸主動脈、心、 肝、脾、肺、腎和結腸組織結合培養板生成主動脈、心、肝、脾、肺、腎和結腸組織各自對應的新組織血管，克服了定量繁瑣和成活率不高的缺點，建立了一種簡單、方便而又能夠被廣泛應用的新組織血管生成的模型，該方法還能應用於腫瘤血管生成抑制劑的篩選研究。
圖1各種組織的血管生長速度對比坐標圖；圖2塔斯品鹼對肺組織血管生成的影響坐標圖；圖3塔斯品鹼衍生物1822對結腸組織血管生成的影響坐標圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作更詳細的說明。新組織血管生成方法，無菌條件下取小鼠或大鼠胸主動脈、心、肝、脾、肺、腎和結腸組織，隨即放入預冷的PBS液中清洗，胸主動脈的處理方法為用眼科手術剪及鑷子去除動脈管外的纖維和脂肪組織，用PBS液清洗後，在放大鏡下，於預冷的DMEM培養基中切取成長度為0. 3mm的動脈環或者剪成長度為0. 3mm的動脈塊，而心、肝、脾、肺、血管、腎和結腸組織的處理方法為用眼科手術剪及鑷子去除組織周邊的粘連組織後剪成Imm3大小的組織塊， 取纖維蛋白原溶液平鋪於48孔培養板中，48孔培養板的每孔容量為200 μ L，48孔培養孔的每孔中加凝血酶1 μ L，搖勻後形成凝膠，將切取的組織塊植於48孔培養孔的凝膠上，再往 48孔培養孔的每孔中加纖維蛋白原溶劑200 μ L和凝血酶1 μ L，搖勻後形成凝膠，這樣就形成了三明治式的夾層結構，於該夾層結構上加含3-10%胎牛血清的DMEM培養基lmL，放入濃度為5%的CO2和溫度為37°C的培養箱中培養，以此就能生成主動脈、心、肝、脾、肺、腎和結腸組織各自對應的新組織血管。所述的DMEM培養基中包括VEGF或者bFGF生長因子。3天後顯微鏡下觀察各種組織血管生成情況，隔天觀察一次，根據血管生成情況對比各種組織的血管生長速度並形成如圖1所示的對比圖，圖示表明所述的生成主動脈、心、肝、脾、肺、 腎和結腸組織各自對應的新組織血管的速度快慢依次為肺的新組織血管>脾的新組織血管>肝的新組織血管>心的新組織血管>腎的新組織血管>結腸的新組織血管>血管的新組織血管，其中結腸的新組織血管生成的過程分為內皮細胞遷出形成血管和血管生成兩種。另外在肺的新組織血管培養的第3天加入塔斯品鹼，以含質量濃度3-10%胎牛血清的 DMEM培養液為空白對照組，塔斯品鹼組的低、中和高濃度分別為2. 32，4. 63和9. 25ymol/ L，隔3天換液，每組設5個復孔，在第9天進行組織血管計數，以時間為橫坐標，肺的新組織血管條數為縱坐標分別作圖，比較結果見圖2，另外在結腸的新組織血管培養的第3天加入塔斯品鹼衍生物1822，以含質量濃度3-10%胎牛血清的DMEM培養液為空白對照組，塔斯品鹼衍生物1822的低、中和高濃度分別為4，12和36 μ mol/L,隔3天換液，每組設5個復孔， 在第9天進行組織血管計數，以時間為橫坐標，結腸的新組織血管條數為縱坐標分別作圖， 比較結果見圖3，這樣綜合圖2和圖3的比較結果，可知所述的肺的新組織血管生成後加入塔斯品鹼，能對於肺的新組織血管具有抑制作用，而所述的結腸的新組織血管生成後加入塔斯品鹼衍生物1822對結腸組織血管生成具有抑制作用。
權利要求
1.一種新組織血管生成方法，其特徵在於無菌條件下取小鼠或大鼠胸主動脈、心、 肝、脾、肺、腎和結腸組織，隨即放入預冷的PBS液中清洗，胸主動脈的處理方法為用眼科手術剪及鑷子去除動脈管外的纖維和脂肪組織，用PBS液清洗後，在放大鏡下，於預冷的DMEM 培養基中切取成長度為0. 3mm的動脈環或者剪成長度為0. 3mm的動脈塊，而心、肝、脾、肺、 腎和結腸組織的處理方法為用眼科手術剪及鑷子去除組織周邊的粘連組織後剪成Imm3大小的組織塊，取纖維蛋白原溶液平鋪於培養板中，培養板的每孔容量為200μ L，培養板的每孔中加凝血酶1 μ L，搖勻後形成凝膠，將切取的組織塊植於培養板的凝膠上，再往培養板的每孔中加纖維蛋白原溶劑200 μ L和凝血酶1 μ L，搖勻後形成凝膠，這樣就形成了三明治式的夾層結構，於該夾層結構上加含質量濃度3-10%胎牛血清的DMEM培養基lmL，放入體積濃度為5%的(X)2和溫度為37°C的培養箱中培養，以此就能生成主動脈、心、肝、脾、肺、腎和結腸組織各自對應的新組織血管。
2.根據權利要求1所述的新組織血管生成方法，其特徵在於所述的生成主動脈、心、 肝、脾、肺、腎和結腸組織各自對應的新組織血管的速度快慢依次為肺的新組織血管>脾的新組織血管>肝的新組織血管>心的新組織血管>腎的新組織血管>結腸的新組織血管>血管的新組織血管，其中結腸的新組織血管生成的過程分為內皮細胞遷出形成血管和血管生成兩種。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的新組織血管生成方法，其特徵在於所述的 DMEM培養基中可包括VEGF或者bFGF生長因子。
4.根據權利要求1或權利要求2所述的新組織血管生成方法，其特徵在於所述的肺的新組織血管生成後加入塔斯品鹼，能對於肺的新組織血管具有抑制作用，而所述的結腸的新組織血管生成後加入塔斯品鹼衍生物1822對結腸組織血管生成具有抑制作用。
全文摘要
一種新組織血管生成方法，通過在無菌條件下取小鼠或大鼠胸主動脈、心、肝、脾、肺、腎和結腸組織結合培養板生成主動脈、心、肝、脾、肺、腎和結腸組織各自對應的新組織血管，克服了定量繁瑣和成活率不高的缺點，建立了一種簡單、方便而又能夠被廣泛應用的新組織血管生成的模型，該方法還能應用於腫瘤血管生成抑制劑的篩選研究。
文檔編號C12N5/071GK102321568SQ20111023159
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月12日 優先權日2011年8月12日
發明者代秉玲, 張彥民, 張 傑, 王嗣岑, 王楠, 賀浪衝, 鄭蕾 申請人:西安交通大學