一種高通量篩選β-葡聚糖酶熱穩定性提高突變體的方法

2023-04-28 16:13:36 1

專利名稱：一種高通量篩選β-葡聚糖酶熱穩定性提高突變體的方法
技術領域：
一種基於96微孔板及酶標儀高通量篩選β 「葡聚糖酶熱穩定性提高突變體的方 法，屬於發酵工程領域。
背景技術：
作為可以工業化生產和應用的β-葡聚糖酶，對酶特性的要求是產酶水平高、 耐熱性好、ρΗ穩定、培養條件簡單等，其中耐熱性和產酶水平是酶工業化生產和應用的 主要問題。目前國內應用的商品酶製劑除少部分飼用酶製劑屬國內生產，其餘基本是通過 進口或由獨資外資企業生產，生產技術都是商業機密。加快進行具有獨立自主智慧財產權 的葡聚糖酶酶製劑的研究和生產，對當前政府號召大力發展生豬養殖，降低老百的 生活消費指數，解決「三農」問題都具有促進作用，降低糧耗，提高料肉比，對應對當 前世界糧食緊缺狀況具有重大的戰略意義。而國產的酶單位活力和耐熱性普遍低於國外 產品，因而限制了在實際生產中的運用。利用定向進化技術提高酶的熱穩定性不僅可拓寬酶的工業應用範圍，而且可以 研究酶結構與穩定性的關係。定向進化技術的關鍵是建立合適的突變體庫和建立有效的 篩選方法。本發明在建立了突變體庫的基礎上，通過對細菌生長、酶表達量和酶活性等影 響因素的探索，建立了基於酶標儀、96微孔板和環境壓力的熱穩定性提高突變體高通量 篩選模型。

發明內容
本發明基於酶標儀、96微孔板和環境壓力，建立高通量篩選β-葡聚糖酶熱穩 定性提高突變體的方法。1.突變體庫的複製1.1從平板上挑選單個克隆子菌落接種於含有IOOOmL LB培養基(內含30 μ g/ mL卡那黴素)的96深孔板中，每孔對應一特定轉化子。每塊深孔板同時接種野生型克 隆，作為陽性對照。37°C，200r/min振搖培養12h。1.2在無菌條件下，從96深孔板中取出20 μ L菌液，對應接入含IOOOuL新鮮LB 培養基的另一 96深孔板中，並進行37°C，200r/min振搖培養。4°C臨時冷藏種子96深 孔板。2.文庫的誘導表達2.137°C，200r/min振搖培養重組菌4h後，每孔加入2g/L IPTG 40 μ L以及 180g/L乳糖100 μ L,混勻後於24°C，200r/min振搖培養6h。在酶標儀上測定OD6tltl並 保存數據後於3000r/min，4°C,離心20min。2.2以每孔一一對應為原則，利用排槍快速移取20 μ L上清粗酶液至兩塊96PCR反應板中。3.文庫上清粗酶液的高溫熱鈍化3.1將其中一塊含有粗酶液的96PCR反應板經過80°C金屬浴處理0.5h，另一對應 板4°C冷藏。4.文庫的酶活表徵4.1將兩快96PCR反應板40°C預熱IOmin後(利用酶標儀加熱模塊)，每孔 中加入40 °C藍色葡聚糖底物(使用前和pH 6.5的20mmol/L的磷酸緩衝液1 19混 合)80μ ，混勻後40°C反應lOmin。每孔中加入300 μ L沉澱液，利用低溫離心機，於 3000r/min, 4°C,離心20min，利用排槍移上清至兩塊96反應板中並測定OD59tl吸光值。4.2利用酶標儀軟體計算每個克隆(OD59tl,未鈍化-OD59tl,熱鈍化VOD6tltl的數值，以陽 性對照為參考，將結果高於陽性對照的克隆挑出並進行斜面保藏。4.3粗篩陽性突變體用於下一輪復篩。以下對本發明方法作穩定性考察說明利用建立的高通量篩選方法對本研究室構建的工程菌(野生菌)進行篩選，共篩選了 192株重組菌(共8個孔板，每個孔板利用24孔)，篩選一塊板按一次實 驗計，共計8次實驗，其中4次實驗(共96個菌落)中的粗酶液經80°C，0.5h處理，另 外4次實驗未經高溫處理。記下最終OD6tltl在所有未經高溫處理孔樣OD6tltl平均值士 10% 之內菌株數。利用下列公式計算該方法的穩定性指標(a).精密度未經高溫處理四組實驗的相對標準偏差RSD(b).重現率=實驗成功次數/總實驗次數X 100%(c).假陰性率=1-(未經高溫處理0D_落在平均值士 10%之內菌落數 /96) X 100%(d).假陽性率=經高溫處理後OD6tltl落在平均值士 10%之內菌落數/96X 100%(1)以96微孔板為基礎高通量篩選方法精密度表1以96微孔板為基礎高通量篩選方法精密度
權利要求
1. 一種高通量篩選β-葡聚糖酶熱穩定性突變體的方法，其特徵是方法步驟為1.突變體庫的複製1.1從平板上挑選單個克隆子菌落接種於含有1000 μ L LB培養基(內含30 μ g/mL卡 那黴素)的96深孔板中，每孔對應一特定轉化子。每塊深孔板同時接種野生型克隆，作 為陽性對照。37°C，200r/min振搖培養12h。1.2在無菌條件下，從96深孔板中取出20 μ L菌液，對應接入含IOOOuL新鮮LB培 養基的另一 96深孔板中，並進行37°C，200r/min振搖培養。4°C臨時冷藏種子96深孔 板。
2.文庫的誘導表達2.137°C，200r/min振搖培養重組菌4h後，每孔加入2g/L IPTG 40 μ L以及180g/L 乳糖100 μ L，混勻後於24°C，200r/min振搖培養6h。在酶標儀上測定OD_並保存數 據後於 3000r/min，4°C,離心 20min。2.2以每孔一一對應為原則，利用排槍快速移取20 μ L上清粗酶液至兩塊96PCR反應 板中。
3.文庫上清粗酶液的高溫熱鈍化3.1將其中一塊含有粗酶液的96PCR反應板經過80°C金屬浴處理0.5h，另一對應板 4°C冷藏。
4.文庫的酶活表徵4.1將兩快96PCR反應板40°C預熱IOmin後(利用酶標儀加熱模塊)，每孔中加入 40°C藍色葡聚糖底物(使用前和pH6.5的20mmol/L的磷酸緩衝液1 19混合)80 μ L， 混勻後40°C反應IOmin。每孔中加入300 μ Ll沉澱液，利用低溫離心機，於3000r/min，4°C,離心20min，利用排槍移上清至兩塊96反應板中並測定OD59tl吸光值。4.2利用酶標儀軟體計算每個克隆(OD59tl,未鈍化-OD59tl,熱鈍化)/OD6QQ的數值，以陽性對 照為參考，將結果高於陽性對照的克隆挑出並進行斜面保藏。 4.3粗篩陽性突變體用於下一輪復篩。
全文摘要
高通量篩選是一種同時分析多個樣本的方式，從大量樣本中挑選出符合目標的個體，目前廣泛應用於藥物開發、酶的發現和改造方面。體外定向進化作為後基因組時代一個重要的技術平臺正得到日益廣泛的應用。定向進化技術在改造酶的熱穩定性方面已表現出一定的優越性，而將這一技術應用在β-葡聚糖酶熱穩定性定向進化上國內外尚未有相關報導。採用定向進化技術對β-葡聚糖酶的熱穩定性改造過程中，如何快速有效地篩選得到目標突變體是其瓶頸問題之一。本發明建立了基於酶標儀、96微孔板和環境壓力的熱穩定性提高突變體高通量篩選模型，見附

圖1。該發明將96微孔板菌落的誘導表達與菌落的原位複製技術有機結合起來，以β-葡聚糖酶與藍色葡聚糖底物作用後釋放藍色基團特性為基礎，以各孔酶反應液的吸光值大小為指標建立了直觀、快速簡易的高通量篩選方法。通過該方法可以篩選到熱穩定性和催化活性同時提高的變異體且穩定性良好。對該方法的篩選穩定性考察結果顯示，其精密度良好，RSD為8.1％，重現性達到100％，假陽性率及假陰性較低，分別為6.25％及2.1％。
文檔編號C12Q1/34GK102010887SQ200910264848
公開日2011年4月13日 申請日期2009年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者劉春鳳, 李崎, 李永仙, 秦久福, 鄭飛雲, 顧國賢 申請人:江南大學