用於微生物分析的裝置的製作方法

2023-04-28 19:38:01 2

專利名稱：用於微生物分析的裝置的製作方法
用於微生物分析的裝置 本發明涉及一種用於對可能含有微生物的載體進行微生物分析的裝置，以便檢測
是否存在那些微生物。 —種分析這樣的載體的方法由如下操作構成在用所謂的螢光團(flurogen)或 螢光團標記物標記了微生物之後，通過分析那些微生物發出的螢光來檢測微生物的存在。
這些標記物僅在它們事先被微生物中包含的化學酶激活時才具有發螢光的特性。
這些標記物一般包括螢光團基團以及能夠隱蔽或防止螢光團基團的螢光顯示出 來的基團。在微生物存在時，其酶的效果是使該第二基團改性，從而可以檢測到第一基團的 螢光。 於是，如圖7的光譜53和54所示，當被這樣標記的微生物受到適當的激發光作用
時，螢光基團可以以吸收光譜53吸收光能並以特徵螢光發射光譜54釋放能量，其中所述光
譜53的頂點53'在波長A 2處，所述光譜54的頂點54'在波長A 3處，不同於入2。 為了觀察到具有這種標記物的微生物發射的螢光，已知的用於微生物分析的裝置
(與顯微鏡一體，例如在美國申請US 2007/0153372中)包括為了藉助螢光檢測由螢光試劑
標記的微生物的存在而適於照明分析載體的照明裝置，和用於觀察對照明裝置發射的光響
應的來自載體的光的窗口。 本發明涉及提供用於檢測螢光的裝置，相對於現有技術的裝置，具有更好的性能 並且更實用。 為此，提供一種用於載體的微生物分析的裝置，載體適於含有由螢光試劑標記的
微生物，其包括為了通過螢光檢測所述標記的微生物的存在而適於照明所述載體的照明設
備以及用於觀察響應於由所述照明設備產生的激發光而由所述載體發射的光的窗口 ；其特
徵在於所述照明設備包括兩個基板，每個基板上安裝至少一組光源，該組中的所述光源彼
此規則地間隔開從而形成照明所述載體的陣列，所述基板被固定到所述裝置的框架上，所
述框架中形成的開口的每邊上各有一個以便允許由所述載體發射的光透過所述觀察窗，所
述基板在所述裝置中用於接收所述載體的預定位置的方向上向彼此傾斜。 根據本發明的具有裝置的光源的兩個基板，相對彼此傾斜並朝著分析載體指向
(當它被放置於裝置上時)，這使得有可能在被照明載體的整個表面上獲得對稱和均勻的
照明，因為光源產生的激發光從開口的兩邊都發射，其中提供開口是為了觀測響應激發光
而發射的光。 那兩個基板每一個都具有以規則陣列排列的光源組，這個事實有助於在載體的整 個表面形成特別均勻的照明。 由此，這種結構使得能夠照明比對於現有技術中與顯微鏡成為一體的裝置的更大 尺寸的載體，同時以這樣的對比度維持均勻照明，即能很容易地用肉眼或其它圖像傳感器 確定微生物的存在。 特別地，這使得當保持在可以觀察到對光源產生的激發光響應而發射的光的開口 的最佳和中央位置時照明例如微孔膜成為可能。 根據對於製造和使用來說由於簡化和方便而優選的特徵
3
_每個所述光源具有在以預定波長為中心的相同光譜；和/或
_所述光源是發光二極體。 根據其它優選特徵，每個所述基板相對於用於接收所述載體的所述預定位置傾斜 40° -50°的角度。 意外地，這證明了一個事實，即板相對於載體傾斜[40° -50° ]的值的範圍導致 對於微生物檢測中讀取便利性而言的最佳性能。 更特別的，在這個值的範圍中，屏蔽效應現象(來自通過觀察窗的外部光線的散 射)和反射現象(來自分析載體上的光的反射)明顯被最小化。 換句話說，就對比度、均一性和明亮度而言，在這個值的範圍中得到最佳圖象繪 制。 根據另一個優選特徵，每個陣列中心和在所述裝置中用來接收所述載體的所述預 定位置之間的高度隨所述載體而變。 根據另一個優選特徵，每個所述陣列的中心位於距離用來接收所述載體的所述預 定位置39. 75mm-69. 75mm的高度處。 這證明了一個事實，假定特別是對試劑分析載體中理想的尺寸即這個高度範圍提 供了很好的平衡，使得在微生物簡易檢測讀取的對比度和便利性方面保持良好的性能的同 時，還獲得了緊湊裝置。
根據其它優選特徵-除了所述光源組，被指定為第一組，以外，每個基板上還安裝了另一組光源，被指 定為第二組，所述第二組的所述光源同樣彼此規則地間隔開，以形成用於照明所述載體的 第二陣列。-對於每個基板，所述第一和第二陣列的中心重合；
-所述第一和第二陣列在彼此內部交錯；-對於每個基板，所述照明設備包括用於所述光源發射的光的漫射體。
-每個漫射體都是其上一個面被噴砂的玻璃板；
-所述觀察窗包括適於允許最長波長通過的濾波器；
-所述觀察窗包括多個濾波器；-所述濾波器屬於滑動地安裝在所述框架上的滑塊；-所述照明設備適於照明整個用於接收所述載體的所述預定位置；和/或
-所述分析載體是微孔薄膜。 參考附圖，從通過優選但非限制性範例的方式給出的以下描述中將明了本發明的 特徵和優點，附圖中 _

圖1是根據本發明的裝置的圖示；-圖2是該裝置的透視圖，在其旁邊示出了裝置中用於分析的濾波器單元；
-圖3和4分別是從下方獲得的透視圖以及從該裝置的對稱正中平面截取的正截 面圖；-圖5是該裝置兩個印刷電路板之一的透視圖，其上固定了兩組發光二極體，每組 發光二極體都以預定波長發射光；-圖6是根據本發明的裝置的另一個實施例的透視-圖7示出了根據本發明的裝置的不同光學構件的光譜圖以及該裝置用於標記微生物的螢光團試劑的光譜圖，沿x軸線為共同比例的波長，沿y軸線為共同比例的相對光強； 在藉助圖7所示光譜圖詳述其工作模式之前，現在將藉助圖1到5給出根據本發明的裝置的優選實施例的描述。 圖1到5所示的裝置1包括外殼2、由兩個照明構件4形成的照明設備3、滑動牽引器5和觀察窗口 7。 外殼是大致平行六面體形狀，具有上壁10和四個側壁11到14，故意沒有示出壁14的一部分，以便示出裝置的內部。 在這裡，觀察窗口 7由低通濾波器6構成(即，其允許最低頻率，即最長的波長通過)，外殼2的上壁10中形成開口 9，以在其中接收濾波器6。 在下面將會看到，由壁10到14和30界定的該外殼2的內部形成分析室，分析室與環境光隔離，其中容納要分析的載體。 這裡，要分析的載體是屬於濾波器單元40的微孔濾膜41，這裡是由Millipore。以Milliflex⑨為商標出售的單元。這個膜41直徑為55mm，被濾波器單元的主體42所圍繞。 這裡使用的膜41是纖維素酯，其孔徑尺寸適於維持期望檢測其存在的微生物，大
部分常常在0. 10和100微米之間。 牽引器5具有主體30、軸環31和握柄32。 在主體30中，形成柱形腔33，用於接收濾波器單元40。 現在將藉助圖3到5描述照明設備3 。 這些設備3包括兩個獨立的照明構件4。 每個構件4包括梯形截面的底座20、其上設置有兩組27和28 二極體22和23的印刷電路板21 、覆蓋那些二極體的漫射體24以及在電路板21的邊緣和漫射體24邊緣之間的兩個黑屏26。 底座20固定於外殼2內部的外殼壁10上，而電路板21固定到底座20遠離靠著壁10設置的那些面的其傾斜面上，使得那些電路板沿著載體41的接收區域33的方向朝向彼此傾斜。 於是這樣提供了每個底座20，使得當單元40處於裝置外殼33中時(圖1)，每個
板21相對於壁10和膜41所佔據的預定位置具有45°的傾角A(圖1)。 電路板21的上邊緣25彼此相距100mm的距離，而那些邊緣25距壁1023mm的距離。 發光二極體22和23的頂點位於距漫射體24為15mm的距離處。 這裡，這些漫射體24是由玻璃板製成的，玻璃板的一面(轉向二極體的面)經噴
沙處理。 在每個印刷電路板上，如圖5所示，設置由十六個二極體22構成的第一組二極體27以及由四個二極體23構成的第二組二極體28。 二極體22彼此規則地間隔並設置成四個二極體一排等間距的四排，使得每個二極體22距與其直接相鄰的二極體22為16mm的距離。於是這一組27形成二極體陣列，使得在將其置於外殼2中其預定位置時能夠均勻地對膜41進行照明，陣列的中心29位於距離該預定位置54. 75mm的高度H處(圖1)。 二極體23分布於在二極體22的陣列中心交錯的正方形的四個角中，每個二極體23位於距與其相鄰的兩個二極體23為32mm的距離處並處於正方形的中心處，在正方形的角部有四個二極體22(圖5)。這個陣列的中心與二極體22構成的陣列中心29重合。
二極體22是來自LUMILED"公司以LXHL-PB01作為參考銷售的二極體，圖7中示出了其發射譜55，該高斯分布形式的光譜在470nm的波長A工處具有頂點55'，於是發射藍光。 二極體23是來自同一公司以參考LXHL-PD01銷售的二極體，圖中未示出其發射光譜，其發射光譜也是高斯分布形式，在625nm的波長處具有峰值，於是發射紅光。
對於25%的相對強度值而言，這些二極體具有140°的發射立體角，對於60%的相對強度值，具有90。的發射立體角。 二極體23具有基本為二極體22四倍的發射功率，從而它們的數量是二極體22的1/4。 交錯設置二極體22和23的陣列(即彼此嵌套)，從而在要照明的濾波器單元那裡獲得可能最均勻的光，無論光是來自二極體22還是來自二極體23 。 每組二極體都產生以預定波長為中心的光譜，以便能夠激發不同預定類型的螢光團。 每個電路板21上的導電跡線電連接到用於裝置的命令和控制單元(未示出)。
現在將簡要介紹要分析樣本的製備。 在實際檢測步驟之前，操作員通過單元40的膜41進行過濾，以採集要分析的樣品(可能含有微生物)。 —旦微生物被過濾並保留在膜上，可以包括任選步驟，S卩，使與適當生長培養基接
觸的微生物生長。生長培養基優選為凝膠介質，在過濾之後在其上沉積膜。該步驟是任選
的，使得能夠獲得最初過濾的每種微生物菌落，這增大了要檢測的細胞數量。 然後使膜及其包含的微生物與使微生物細胞壁可滲透的成分接觸，隨後將螢光團
標記物加入實現可滲透的成分中，以便進入要檢測的微生物內部。 現在將介紹基於根據本發明的裝置判斷如此製備的樣品上是否存在微生物的實施方式。 在第一階段中，拉出牽引器5，操作員在該牽引器的腔33中放入濾波器單元40(其可能被未示出的透明蓋板覆蓋以保護膜不受外部汙染物影響)。然後推入牽引器5，直到軸環31抵靠壁13為止，使得膜41置於外殼2中其預定位置，以便被照明。
根據用於標記微生物的螢光團，操作員接下來選擇(例如通過圖中未示出的開關)對應的二極體22或23以將其導通(在圖示的範例中為二極體22)，以便均勻地照明膜41的整個表面，並以合適的波長激發用於進行標記的螢光團。 漫射體24以及二極體在電路板21上的空間分布使得無論使用哪組二極體，都能夠對膜41的整個表面進行特別均勻的照明。 由於電路板21置於接收濾波器6的開口 9的每個邊上，因此響應於來自二極體的激發光而從濾波器單元40發射的光如圖1所示通過該濾波器，從而能夠用肉眼或經由攝像機通過濾波器6觀察膜41的光響應。 現在將描述利用圖7所示不同光譜圖在存在微生物的情況下獲得的光響應。
在圖7中，光譜55是高斯形式的，對應於激發光的光譜(這裡為二極體22產生的光譜)，並具有一峰，其對應於最大光強值的峰值55'處於等於470nm的波長A工處。
光譜53和54分別對應於這裡選擇用於標記膜上存在的微生物的螢光團的吸收光譜和發射光譜。 這裡描述的螢光團是5-6CFDA(羧基-螢光素-二 -醋酸鹽)。 吸收光譜53在大於A工的波長A 2處具有峰值53'，發射光譜54在大於A 2的波
長、處具有峰值54'。 在圖示的範例中，、等於492nm，、等於517nm，這裡、和、之間的差小於入2和、之間的差。 有意識地選擇激發波長A工，使其小於A 2，使得光譜55的峰值55'相對於光譜53的峰值53'在光譜54的相對側上偏移。選擇這一偏移，以便使來自照明設備的光具有足夠高能量來激發螢光團，而光不會與由螢光團響應於激發光而發射的光產生嚴重的寄生幹擾。 光譜56是觀察窗口的濾波器6的光譜，選擇其截止頻率(這裡大約為550nm)以使螢光團發射的光(光譜54)基本通過，並阻擋更短波長的光，尤其是來自二極體22的在單元40上反射之後的光。 這一輸出濾波器(濾色鏡)有弱選擇性，以允許充分多的光返回用戶眼睛，給出大致明亮的景色，於是觀察起來讓人舒適，同時確保對比度水平適於用肉眼觀察。
當來自照明設備3的激發光照射濾波器單元40的膜41時，使得具有被螢光團標記的微生物的該膜的每個位置以小尺寸(幾百微米)亮斑的形式變得可見，亮斑可以直接由濾波器6之外的肉眼觀察到。 角度A和高度H的值為無論用肉眼或通過攝像機讀取膜41上的亮斑提供了最佳表現。 這些值是通過以下操作確定的向控制膜施加黑色標記和螢光黃標記，並針對角度A和高度H的不同值尋找螢光頻帶亮度最大同時使黑色標記上的寄生亮度最小的配置A、H。 這樣做已經令人驚訝地證實，範圍[40° -50° ]的角度A給出了螢光標記的最大光強度並且幾乎沒有對於黑色標記的寄生光，從而對應於閱讀舒適度方面的最佳值。
因此，為了相對於安裝裝置的間隙具有特定安全餘量，從而在此選擇了平均值45° 。 至於高度值H，這是被照明對象尺寸的函數，已測試的不同配置表明，對於直徑為55mm的膜以及角度A的值範圍在40。到50°而言，在39. 75mm和69. 75mm的高度範圍上獲得了最佳結果。在此，類似地，在該範例中選擇的是平均值54. 75mm。 通過調節高度H，該裝置還適於照明除膜之外的其他類型樣品以及基本任何適於(無論是在表面上或是在體積中)包含微生物且希望通過螢光性檢測其存在的載體。
圖6中示出了該裝置的另一個實施例。
—般而言，將增加了 100的相同附圖標記用於類似部分。
7
裝置101與裝置1具有相同特徵，只是其缺少牽引器5 (例如這裡，濾波器單元40直接放在例如臺上)，並且這裡觀察窗口 107是由靠著外殼102的壁110設置的矩形形式滑塊108以及四個濾波器106到106"'形成的，每個濾波器都容納在滑塊108的對應開口中。
每個光學濾波器都是低通濾波器，從而允許低頻(最長的波長)通過，其截止頻率與其他截止頻率不同。 滑塊108接合在該裝置的導軌(未示出)中，從而能夠將四個濾波器106到106"'中任何選定的一個放置成與壁110的開口 109對準。 於是，根據所選的螢光團以及導通的二極體，能夠從四個可用濾波器中選擇具有最適合截止頻率的一個(例如，以獲得最佳對比度)。 在一個未示出的實施例中，濾波器6不是低通濾波器，而是帶通濾波器，其中通帶以波長人2為中心。 在另一個未示出的實施例中，印刷電路板21具有單個規則間隔二極體組，或者多於兩個的二極體組，每組二極體適於以不同波長照明載體41，每個二極體組陣列具有規則形狀，例如正方形，菱形，三角形，等等。 在另一個未示出的實施例中，二極體以任意其它類型的局部和單一光源，例如化學發光光斑代替，和/或印刷電路板由任意其它類型的可以支撐光源的基板例如玻璃或陶瓷板代替。 最後，要指出的是，也可以針對很多其他應用按照不同版本生產這種照明系統，其他應用例如是通過顯微鏡分析、生物晶片掃描、藉助螢光的板的讀取、血細胞計數、透照器、PCR實時讀取，對於這些應用的每一個，裝置的幾何構型成為討論的應用的特殊方案。基座21固定於其上的裝置框架未必是像圖示外殼2的外殼；例如它可以是圍繞顯微鏡光學裝置的箍狀物。 本發明不限於所述和圖示的實施例，而是涵蓋其任何變體。
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權利要求
一種用於載體(41)的微生物分析的裝置，該載體適於含有由螢光試劑標記的微生物，其包括為了通過螢光來檢測所述標記的微生物的存在而適於照明所述載體(41)的照明設備(3)，以及用於觀察響應於由所述照明設備(3)產生的激發光而由所述載體(41)發射的光的窗口(7；107)；其特徵在於所述照明設備(3)包括兩個基板(21)，每個基板上安裝至少一組(27)光源(22)，該組(27)中的所述光源(22)彼此規則地間隔開從而形成照明所述載體(41)的陣列，所述基板(21)被固定到所述裝置的框架(2；102)上，在所述框架(2；102)中形成的開口(9；109)的每邊上各有一個，以便允許由所述載體(41)發射的光透過所述觀察窗(7；107)，所述基板(21)在所述裝置中用於接收所述載體(41)的預定位置的方向上向彼此傾斜。
2. 如權利要求l所述的裝置，其特徵在於每個所述光源(22)具有以預定波長(A》為中心的相同的光譜(55)。
3. 如權利要求2所述的裝置，其特徵在於所述光源是發光二極體(22)。
4. 如權利要求l-3任一項所述的裝置，其特徵在於每個所述基板(21)相對於用於接收所述載體(41)的所述預定位置傾斜40。
-50°的角度(A)。
5. 如權利要求l-4任一項所述的裝置，其特徵在於在每個陣列(27)的中心(29)和在所述裝置中用於接收所述載體(41)的所述預定位置之間的高度(H)隨所述載體(41)變化。
6. 如權利要求5所述的裝置，其特徵在於每個所述陣列(27,28)的中心(29)位於距離用於接收所述載體(41)的所述預定位置39. 75mm-69. 75mm的高度(H)處。
7. 如權利要求l-6任一項所述的裝置，其特徵在於除了被指定為第一組(27)的所述光源(22)的組(27)以外，在每個基板(21)上還有被指定為第二組的另一組(28)光源(23)，所述第二組的所述光源(23)也是彼此規則地間隔開以形成照明所述載體(41)的第二陣列。
8. 如權利要求7所述的裝置，其特徵在於對於每個基板(21)，所述第一和第二陣列(27,28)的中心(29)重合。
9. 如權利要求8所述的裝置，其特徵在於所述第一和第二陣列(27,28)在彼此內部交錯。
10. 如權利要求l-9任一項所述的裝置，其特徵在於對於每個基板(21)，所述照明設備(3)包括用於由所述光源(22,23)發射的光的漫射體(24)。
11. 如權利要求10所述的裝置，其特徵在於每個漫射體(24)是其上一個面被噴砂的玻璃板。
12. 如權利要求l-ll任一項所述的裝置，其特徵在於所述觀察窗(7 ;107)包括適於允許最長波長通過的濾波器(6 ;106)。
13. 如權利要求12所述的裝置，其特徵在於所述觀察窗(107)包括多個濾波器(106，106'， 106"， 106"')。
14. 如權利要求13所述的裝置，其特徵在於所述濾波器(106， 106， ，106"， 106"，)屬於滑動地安裝在所述框架(102)上的滑塊(108)。
15. 如權利要求l-14任一項所述的裝置，其特徵在於所述照明設備(3)適於照明整個用於接收所述載體(41)的預定位置。
16. 如權利要求15所述的裝置，其特徵在於所述分析載體是微孔薄膜(41)。
全文摘要
一種用於載體(41)的微生物分析的裝置，該載體適於含有由螢光試劑標記的微生物，其包括具有兩個基板(21)的適於照明所述載體(41)的照明設備，每個基板上安裝至少一組光源(22)，該組中的所述光源(22)彼此規則地間隔開從而形成照明所述載體(41)的陣列，所述基板(21)被固定到所述裝置的框架上，所述框架上形成的開口(9)的每邊各有一個，所述基板(21)在所述裝置上用於接納所述載體(41)的預定位置的方向上向彼此傾斜。
文檔編號G02B7/00GK101724683SQ20091025307
公開日2010年6月9日 申請日期2009年9月23日 優先權日2008年9月23日
發明者G·魏茨, S·裡博 申請人:米利波爾公司