山香圓葉及其製劑的質量控制方法

2023-04-28 08:07:36

專利名稱:山香圓葉及其製劑的質量控制方法
技術領域：
本發明涉及山香圓葉及其製劑的質量控制方法，尤其是以山香圓葉及其製劑中沒食子酸及一種以芹菜素為苷元的苷(CSP-A2)為檢測指標的定性和定量質量控制方法。
背景技術：
山香圓葉為省沽油科植物山香圓Turpinia arguta Seem.或Turpinia indochinensis的新鮮或乾燥葉，具有清熱洩火，利咽消腫的功效，到目前為止，研究文獻確切報導的其化學成分主要有2α-羥基熊果酸、2α、19α-二羥基熊果酸、19α-羥基熊果酸、2α-過氧羥基熊果酸、熊果酸、α-香樹脂醇、肉豆蔻酸、胡蘿蔔苷等(方乍浦，等，山香圓葉化學成分的研究，中草藥，1987.18(7)6)，多為小極性部分。已上市的山香圓葉製劑(如山香圓顆粒、山香圓片等)多採用以山香圓葉對照藥材薄層色譜鑑別的質量控制方法，研究文獻有對其熊果酸含量測定和薄層色譜鑑別及以蘆丁為對照的分光光度法測定總黃酮含量(毛友昌等，薄層掃描法測定山香圓葉中熊果酸的含量，1997，17(3)7；羅憲堂等，UV法測定山香圓葉中黃酮類成分含量，中醫藥研究，2002，18(5)48)，但上述方法均難以綜合反應和控制藥材及製劑質量，且在已上市的製劑中(如山香圓顆粒、山香圓片)，提取工藝為水提或稀乙醇醇沉提取工藝，熊果酸等脂溶性成分提取率很低。
所以建立一個能綜合反應藥材及製劑質量的質量控制方法，具有很重要的意義。

發明內容本發明的目的在於建立一種山香圓葉及其製劑的質量控制方法，該方法可綜合反應和控制藥材及製劑的質量。
本發明首先對山香圓葉藥材進行較系統的化學成分研究，具體而言，是不同於已知文獻所報導的低極性部分的化學成分研究，研究主要集中於山香圓葉以水或稀乙醇為溶劑採用冷提(如滲漉、浸泡等)或熱提(如煎煮、回流等)的提取物為基本，進一步採用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯、正丁醇部分分別通過矽膠反覆柱層析、凝膠層析、液相製備等純化手段，初步分離得到單體化合物22個，並進一步結構鑑定，其中含量較高的成分有CSP-A1、CSP-A2等，CSP-A1為白色針狀結晶，mp246℃，EI-MS m/z170(M+)，153，141，135，125，113，107，96，85，79，71；經鑑定為沒食子酸；CSP-A2為白色粉末，其1H-NMR譜(CD3OD)見附圖1、13C-NMR譜(CD3OD)見附圖2，其甲醇溶液於200～400nm掃描測定，可見在214nm、268nm、334nm附近有最大吸收，結構待進一步確定。
沒食子酸具有抗炎、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗病毒等的藥理活性，初步確定CSP-A2的苷元為芹菜素，而芹菜素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓、抗焦慮等多方面作用，與山香圓葉的功能主治相關，可見以水溶性較好的沒食子酸、CSP-A2作為質量控制指標，具有更好的合理性。
本發明是可以通過以下方式實現，包括但不僅限於一、供試品溶液的製備方法可以用甲醇，乙醇、丙酮等極性溶劑直接提取的方法，溶劑也可以用它們的水溶液，提取方法可以為超聲、回流、靜置浸泡等，也可以用水提取液(或濃縮液)直接用乙酸乙酯、正丁醇萃取提取的方法，由於被測指標為均為有機酚酸類，萃取的水溶液用酸調節pH在4.5以下效果更好，乙酸乙酯、正丁醇萃取液繼續回收溶劑，殘渣加甲醇溶解即得。具體的提取方法根據具體情況及劑型而不同，如對於液體製劑，調節pH到4，用適量正丁醇直接振搖提取更為簡單方便，而對於藥材及固體製劑，可以採用水提取(冷浸或回流等)成水提取液，然後採用液體製劑相同的方法製備，而更簡單方便為溶劑直接提取，如採用甲醇、乙醇、丙酮、及含水溶劑提取(回流、冷浸等)的方法，為儘量富集有效成分並減少雜質幹擾，一個更優化的方法為取藥材或製劑粉末適量，置索氏提取器中，加石油醚適量，回流提取1小時，棄去石油醚提取液，並揮去藥材或製劑粉末的剩餘石油醚，加甲醇，回流提取1小時，取甲醇提取液，濃縮，即得。或鹼溶液提取，如0.01％～0.1％的氫氧化鈉溶液、0.5％碳酸鈉溶液浸泡提取，提取液用稀鹽酸調節pH值至4，然後用乙酸乙酯、正丁醇振搖萃取；或採用大孔吸附樹脂或聚醯胺柱精製，即藥材或製劑提取水溶液，緩緩通過大孔吸附樹脂或聚醯胺柱，用水洗脫，棄去水洗脫液，繼續用20％～90％乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，殘渣加甲醇溶解，即得。
上述所述的供試品溶液製備具體操作方法，舉例如下，所述例子只是更直觀地說明供試品的製備方法，包括但不僅限於1、山香圓葉粉末1g或製劑適量(約相當於藥材1g)，加石油醚索氏提取1小時，棄去石油醚，殘渣揮去石油醚，加甲醇適量，回流提取1小時，取甲醇液，濃縮至2ml，即得。石油醚也可以用氯仿等小極性、非極性溶劑。
2、山香圓葉粉末1g或製劑適量(約相當於藥材1g)，加水30ml，回流煎煮1小時，濾過，合併濾液，濾液濃縮至10ml，稀鹽酸調節pH值至3～4，水飽和正丁醇萃取2～6次，每次10ml，合併正丁醇液，回收，殘渣加甲醇1ml使溶解，即得。
3、山香圓葉粉末1g或製劑適量(約相當於藥材1g)，加稀乙醇30ml，超聲提取30分鐘，濾過，濾液回收乙醇，殘渣加甲醇2ml使溶解。
4、如3所述的稀乙醇提取液，濃縮，殘渣加水5ml使溶解，稀鹽酸調節pH值至3～4，水飽和乙酸乙酯萃取2～6次，每次10ml，合併乙酸乙酯液，回收，殘渣加甲醇1ml使溶解，即得。
5、山香圓葉粉末1g或製劑適量(約相當於藥材1g)，加0.05％氫氧化鈉溶液30ml靜置過夜，濾過，稀鹽酸調節pH至3～4，濃縮至10ml，水飽和正丁醇萃取2～6次，每次10ml，合併正丁醇液，回收，殘渣加甲醇1ml使溶解，即得。
6、山香圓葉粉末1g或製劑適量(約相當於藥材1g)，加甲醇超聲提取30分鐘，濾過，即得。
7、如2得到的水提取濃縮液，與苯乙烯型大孔樹脂拌勻，加入苯乙烯型大孔樹脂柱(Φ2.5×12)，水洗脫除去雜質，60％乙醇洗脫並收集合併洗脫液，濃縮，殘渣加甲醇2ml使溶解。苯乙烯型大孔樹脂如D101型大孔吸附樹脂，AB-8型大孔吸附樹脂等。
8、如7，苯乙烯型大孔樹脂換為聚醯胺。
二、定性鑑別以沒食子酸、CSP-A2為定性質量控制指標，可以為薄層色譜鑑別方法，液相色譜鑑別方法等，以能達到良好分離並鑑別出沒食子酸、CSP-A2為宜。方法包括但不僅限於1、照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VI B)試驗，取供試品溶液、沒食子酸對照品溶液(取沒食子酸對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液。)各2μl，分別點於同一聚醯胺薄膜上，以36％醋酸為展開劑，展開，取出，涼幹，噴以0.5％三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。
2、照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VI B)試驗，取供試品溶液、沒食子酸對照品溶液(取沒食子酸對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液。)各2μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，以氯仿乙酸乙酯甲醇甲酸(3∶6∶1∶1)為展開劑，展開，取出，涼幹，噴以三氯化鐵試液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。
3、照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VI B)試驗，取供試品溶液、沒食子酸對照品溶液(取沒食子酸對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液。)各2μl，分別點於同一矽膠GF254薄層板上，以氯仿乙酸乙酯甲酸(6∶4∶1)為展開劑，展開，取出，涼幹，在紫外254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。
上述方法中，達到相同鑑別目的展開劑可以不同，如1展開劑可以為稀乙醇、95％乙醇等，2展開劑可以為甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)、氯仿-乙酸乙酯-甲酸(5∶5∶1)等，3展開劑可以為石油醚(60-90)℃-乙酸乙酯-冰醋酸-濃鹽酸(35∶10∶5∶0.1)等。
4、CSP-A2的鑑別方法CSP-A2為黃酮類化合物，鑑別方法條件可以為衛生部藥品標準11冊山香圓片(WS3-B-2085-96)或衛生部藥品17冊山香圓顆粒(WS3-B-3139-98)項下鑑別方法。供試品溶液優選上述供試品溶液製備方法7、8的溶液，另取CSP-A2對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液、對照品溶液各2μl，分別點於同一用0.5％氫氧化鈉溶液製備的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。或取上述供試品溶液、對照品溶液各2μl，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5.3∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以1％三氯化鋁乙醇溶液，晾乾，置紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
三、定量測定方法1、沒食子酸定量測定方法優選高效液相色譜法，當然也可以用其它可行的定量測定方法，如定性鑑別項下1的色譜斑點在λ＝615nm進行薄層色譜掃描測定，或2項下在λ＝530進行薄層色譜掃描測定，或3項下λR＝370nm，λS＝280進行薄層色譜掃描測定等等，但薄層色譜掃描法操作繁瑣，受影響因素較多，精密度和穩定性不如高效液相色譜法好，所以優選高效液相色譜法進行沒食子酸的含量測定。
波長選擇取沒食子酸適量，加甲醇溶解，於200～400nm掃描測定，可見在216nm、269nm左右均有最大吸收，理論上只要有吸收就可以作為其檢測波長，檢測波長在遠紫外區(＜220nm)時，由於很多雜質也有吸收而可能雜質測定，所以優選近紫外區，又由於CSP-A2在269nm附近也有最大吸收，所以可選擇檢測波長269nm。
流動相可以為有機溶劑水系統，包括但不僅限於甲醇-水(或酸水)、乙腈-水(或酸水)、甲醇-乙腈-水(或酸水)、甲醇-四氫呋喃-水(或酸水)等系統，其種類及其配比以能使供試品中沒食子酸達到良好分離檢測效果為宜，所述的酸水指pH值小於正常水的pH的水，如磷酸、冰醋酸的水溶液，也可以為緩衝液、酸和鹼的混合液等，如含0.1％三乙胺的0.1％磷酸水溶液，優選有機溶劑-酸水系統，如乙腈-0.1％磷酸溶液、甲醇-0.05％磷酸溶液、甲醇-0.2％冰醋酸溶液等。流動相配比如甲醇--0.05％磷酸溶液(5∶95)、乙腈-0.05％磷酸溶液(4∶95)，均可以達到良好的檢測效果。
檢測柱溫可以為室溫，較優選溫度25℃-35℃。
色譜條件可以為以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈-0.05％磷酸溶液(4∶96)為流動相；檢測波長269nm，柱溫30℃。
供試品溶液可以直接為上述供試品溶液的製備方法所得或用相同溶劑稀釋後得到的供試品溶液，優選供試品溶液製備方法為方法1、2、4、7、8，方法2、4正丁醇或乙酸乙酯溶劑萃取次數以4～6次較好，對於最後的供試品溶液的溶解溶劑，可以為提取溶劑，優選用流動相溶劑。
沒食子酸對照品溶液的製備取沒食子酸對照品，加流動相製成每1ml含50μg的溶液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
2、CSP-A2優選採用高效液相色譜法測定。
波長選擇取CSP-A2適量，加甲醇溶解，於200～400nm掃描測定，可見在214nm、268nm、334nm左右均有最大吸收，理論上只要有吸收就可以作為其檢測波長，檢測波長在遠紫外區(＜220nm)時，由於很多雜質也有吸收而可能雜質測定，所以優選近紫外區，可選擇檢測波長269nm。
流動相可以為上述沒食子酸高效液相測定項下任一有機溶劑-水(或酸水)系統，其種類及其配比以能使供試品中CSP-A2達到良好分離檢測效果為宜，如乙腈-0.1％磷酸溶液(15∶85)、甲醇-0.3％冰醋酸溶液(30∶70)，在一定條件下，還可以達到同時測定沒食子酸的目的，見指紋圖譜質量控制方法部分。
檢測柱溫可以為室溫，較優選溫度25℃-35℃。
色譜條件可以為以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈-0.05％磷酸溶液(4∶96)為流動相；檢測波長269nm，柱溫30℃。
供試品溶液可以直接為上述供試品溶液的製備方法所得或用相同溶劑稀釋後得到的供試品溶液，優選供試品溶液製備方法為方法1、2、4、7、8，方法2、4正丁醇或乙酸乙酯溶劑萃取次數以4-6次較好，對於最後的供試品溶液的溶解溶劑，可以為提取溶劑，優選用流動相溶劑。
對照品溶液的製備取CSP-A2對照品，加流動相製成每1ml含50μg的溶液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
四、指紋圖譜質量控制方法指紋圖譜是某種中藥材或製劑中共有的成分在一定檢測條件下所具有的明顯區別特徵的色譜或光譜圖譜，指紋圖譜可以對藥材或製劑進行同時定性和定量，可以有效控制藥材或製劑質量，是中藥現代化關鍵技術之一，對有效控制藥材和製劑質量，保證製劑安全、有效、質量穩定有非常重要的意義。
指紋圖譜技術採用高效液相色譜法，以沒食子酸、CSP-A2為對照，該方法也可以用於藥材及製劑中沒食子酸、CSP-A2的含量測定。
流動相採用梯度洗脫，系統可以同上述定量測定方法，優選乙腈-酸水系統，如乙腈-0.1％磷酸溶液。
供試品溶液的製備可以為上述供試品製備任一方法，優選的方法為供試品溶液的製備方法2、4，方法2、4正丁醇或乙酸乙酯溶劑萃取次數以4-6次較好，對於最後的供試品溶液的溶解溶劑，可以為提取溶劑，優選用流動相溶劑(初始梯度)。
檢測波長可以210～320nm，優選269nm；檢測柱溫可以為室溫，較優選溫度25℃～35℃對照品溶液的製備取沒食子酸、CSP-A2對照品，分別加流動相製成每1ml含50μg的溶液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
對採自江西、湖南、福建、廣東、廣西等地的10批山香圓葉進行測定，並測定山香圓顆粒、山香圓片指紋圖譜，參見實施例12、實施例13，表明不同產地山香圓葉指紋圖譜具有較大相似性，但含量略有差別，同時表明山香圓葉指紋圖譜與製劑的指紋圖譜具有相似性。
比較10批不同產地山香圓葉藥材、山香圓葉對照藥材(中國藥品生物製品檢定所)、山香圓顆粒及山香圓片指紋圖譜，可確定附圖3、附圖6可為山香圓葉標準指紋圖譜，附圖9可為山香圓葉製劑的標準指紋圖譜。
如實施例12、13，山香圓葉藥材指紋圖譜中，比較10批不同產地山香圓藥材，可確定山香圓葉藥材至少含6個共有色譜峰，並含沒食子酸、CSP-A2色譜峰，所述的6個藥材共有色譜峰如附圖3保留時間(min)為9.223(1，沒食子酸)、46.573(2)、48.607(3)、50.573(4)、55.940(5)、61.307(6，CSP-A2)等；如附圖6保留時間為5.432(1，沒食子酸)、37.632(2)、40.898(3)、41.832(4)、49.765(5)、55.698(6，CSP-A2)等。
比較山香圓顆粒及山香圓片指紋圖譜，確定山香圓顆粒、山香圓片等製劑指紋圖譜至少含有5個共有色譜峰，並含沒食子酸、CSP-A2色譜峰，所述的5個製劑共有色譜峰如附圖9保留時間為5.432(1，沒食子酸)、40.932(3)、41.865(4)、49.865(5)、55.765(6，CSP-A2)等。
比較山香圓葉藥材和製劑的指紋圖譜(如附圖9、附圖10)，可見製劑含有的峰，其5、6號峰峰面積及兩者配比與藥材的相吻合，也證明這兩成分相對比較穩定，其成分及配比可作為更進一步的質量控制指標，而沒食子酸等其他成分含量及其組分與製劑的比較產生有一定變化，原因為製劑製藥過程中提取、濃縮、乾燥、成型過程中化學成分產生變化，提示製藥過程中要儘可能採用先進合理工藝而儘可能的保留藥效成分，如低溫提取(如滲漉提取)、減壓濃縮、包合工藝、噴霧乾燥等。
具體實施方式以下實施例只是更具體地說明本發明，但本發明並不限於以下實施例的內容。
實施例1山香圓葉粉末1g或製劑適量(如山香圓降糖顆粒1g、山香圓片1片或約相當於藥材1g的製劑)，加石油醚索氏提取1小時，棄去石油醚，殘渣揮去石油醚，加甲醇適量，回流提取1小時，取甲醇液，濃縮至2ml，作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VIB)試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液各2μl，分別點於同一聚醯胺薄膜上，以36％醋酸為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以0.5％三氯化鐵乙醇溶液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。
實施例2山香圓葉粉末1g或製劑適量(如山香圓降糖顆粒1g山香圓片1片或約相當於藥材1g的製劑)，加水30ml，回流1小時，濾過，合併濾液，濾液濃縮至10ml，稀鹽酸調節pH值至3～4，水飽和正丁醇萃取4次，每次10ml，合併正丁醇液，回收正丁醇液，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VI B)試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液各2μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(3∶6∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以三氯化鐵試液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。
實施例3照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VI B)試驗，吸取實施例2項下供試品溶液、對照品溶液各2μl，分別點於同一矽膠GF254薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，在紫外254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。
實施例4取CSP-A2對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VI B)試驗，吸取實施例2項下供試品溶液、CSP-A2對照品溶液各2μl，分別點於同一用0.5％氫氧化鈉溶液製備的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點實施例5山香圓葉粉末1g或製劑適量(如山香圓降糖顆粒1g山香圓片1片或約相當於藥材1g的製劑)，加水30ml，回流1小時，濾過，合併濾液，通過聚醯胺柱(Φ2.5×12)，5％乙醇100ml緩緩洗脫，80％乙醇150ml洗脫，收集合併洗脫液，濃縮，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取CSP-A2對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VI B)試驗，吸取實施例2項下供試品溶液、CSP-A2對照品溶液各2μl，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5.3∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以1％三氯化鋁乙醇溶液，晾乾，置紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
實施例6照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈-0.1％磷酸溶液(4∶96)為流動相；檢測波長269nm。理論板數以沒食子酸峰計算應不低於2000，流速1ml/min，柱溫室溫。採用Agilent 1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
供試品溶液的製備 取山香圓葉粉末0.5g或製劑適量(山香圓降糖顆粒0.3g、山香圓片半片或約相當於藥材0.5g的製劑)，精密稱定，置索氏提取器中，加氯仿適量回流1小時，棄去氯仿液，殘渣揮去氯仿，加甲醇適量，回流提取1小時，取甲醇液，轉移並定容至50ml量瓶中，作為供試品溶液。
對照品溶液的製備取沒食子酸對照品，加甲醇製成每1ml含50μg的溶液，作為對照品溶液。
測定法精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得實施例7照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-0.1％冰醋酸(5∶95)為流動相；檢測波長220nm。理論板數以沒食子酸峰計算應不低於2000，流速1ml/min，柱溫30℃。採用Agilent 1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
供試品溶液的製備 取山香圓葉粉末0.5g或製劑適量(山香圓降糖顆粒0.3g、山香圓片半片或約相當於藥材0.5g的製劑)，精密稱定，加水30ml，回流1小時，濾過，合併濾液，濾液濃縮至約10ml，稀鹽酸調節pH值至3～4，水飽和正丁醇萃取6次，每次10ml，合併正丁醇液，回收，殘渣加甲醇使溶解，轉移並定容至50ml量瓶中，作為供試品溶液。
對照品溶液的製備 取沒食子酸對照品，加甲醇製成每1ml含50μg的溶液，作為對照品溶液。
測定法精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得實施例8同實施例6，檢測波長為220nm。
實施例9同實施例7，檢測波長為270nm。
實施例10照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈-0.1％磷酸溶液(15∶85)為流動相；檢測波長270nm。理論板數以CSP-A2峰計算應不低於2000，流速1ml/min，柱溫室溫。採用Agilent 1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
供試品溶液的製備 取山香圓葉粉末0.5g或製劑適量(山香圓降糖顆粒0.3g、山香圓片半片或約相當於藥材0.5g的製劑)，精密稱定，加水30ml，回流1小時，濾過，合併濾液，濾液濃縮至約10ml，稀鹽酸調節pH值至3～4，水飽和正丁醇萃取6次，每次10ml，合併正丁醇液，回收，殘渣加甲醇使溶解，轉移並定容至50ml量瓶中，作為供試品溶液。
對照品溶液的製備 取CSP-A2對照品，加甲醇製成每1ml含50μg的溶液，作為對照品溶液。
測定法精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得實施例11除檢測波長為330nm外，其他同實施例10。
實施例12
指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈為流動相A，0.1％磷酸水溶液為流動相B；按表1進行梯度洗脫，檢測波長為270nm。理論板數按沒食子酸峰計算應不低於2000，流速1ml/min，柱溫室溫。採用Agilent 1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
表1 流動相梯度洗脫分配表
供試品溶液的製備 取山香圓葉粉末0.5g或製劑適量(山香圓降糖顆粒0.3g、山香圓片半片或約相當於藥材0.5g的製劑)，精密稱定，加水30ml，回流1小時，濾過，合併濾液，濾液濃縮至約10ml，稀鹽酸調節pH值至3-4，水飽和正丁醇萃取6次，每次10ml，合併正丁醇液，回收，殘渣加甲醇使溶解，轉移並定容至量瓶中，作為供試品溶液。
對照品溶液的製備 取沒食子酸、CSP-A2對照品，分別加甲醇製成每1ml含25～500μg的溶液，作為對照品溶液。
測定法 精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
色譜圖如附圖3、附圖4、附圖5。
附圖3為山香圓葉藥材1(山香圓葉對照藥材，中國藥品生物製品檢定所)的HPLC指紋色譜圖譜；附圖4為沒食子酸的HPLC色譜圖；附圖5為CSP-A2的HPLC色譜圖。
實施例13指紋圖譜照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈為流動相A，0.1％磷酸水溶液為流動相B；按表2進行梯度洗脫，檢測波長為270nm。理論板數按沒食子酸峰計算應不低於2000，流速1ml/min，柱溫室溫。採用Agilent 1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
表2 流動相梯度洗脫分配表
測定法 精密吸取上述實施例12項下供試品溶液、對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。
色譜圖如附圖6、附圖7、附圖8、附圖9、附圖10。
附圖6為山香圓葉藥材1(山香圓葉對照藥材，中國藥品生物製品檢定所)的HPLC指紋色譜圖譜；附圖7為山香圓葉藥材2的HPLC指紋色譜圖譜；附圖8為山香圓葉藥材6的HPLC指紋色譜圖譜；附圖9為山香圓顆粒(江西山香藥業有限公司)的HPLC指紋色譜圖。
附圖10為山香圓片(江西山香藥業有限公司)的HPLC指紋色譜圖譜。
實施例14複方山香圓含片(見發明專利「一種防治病毒性感冒及咽喉疾病的中藥組合物及其製備方法」具體實施方式
實施例1，發明專利申請申請號200610200334.9)山香圓葉的質量控制方法。
1、取本品1片，研細，加熱水30ml使溶解，濾過，合併濾液，濃縮至10ml，稀鹽酸調節pH值至3.6，水飽和正丁醇萃取4次，每次10ml，合併正丁醇液，回收正丁醇液，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VI B)試驗，吸取上述供試品溶液、對照品溶液各2μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(3∶6∶1∶1)為展開劑，展開，取出，涼幹，噴以三氯化鐵試液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。
2、取本品1片，研細，加熱水30ml使溶解，放冷，濾過，通過聚醯胺柱(Φ2.5×12)，5％乙醇100ml緩緩洗脫，80％乙醇150ml洗脫，收集合併洗脫液，濃縮，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取CSP-A2對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法(《中國藥典》2005版一部附錄VI B)試驗，吸取供試品溶液、CSP-A2對照品溶液各2μl，分別點於同一用0.5％氫氧化鈉溶液製備的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
3、照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈為流動相A，0.1％磷酸水溶液為流動相B；按表3進行梯度洗脫，檢測波長為270nm。理論板數按沒食子酸峰計算應不低於2000，流速1ml/min，柱溫30℃。
表3 流動相梯度洗脫分配表
供試品溶液的製備 取本品1片，研細，加熱水30ml使溶解，放冷，濾過，濃縮至約10ml，稀鹽酸調節pH值至3.6，水飽和正丁醇萃取6次，每次10ml，合併正丁醇液，回收，殘渣加甲醇使溶解，轉移並定容至量瓶中，作為供試品溶液。
對照藥材溶液的製備取山香圓葉對照藥材(中國藥品生物製品檢定所)1g，同供試品溶液製備方法，同法製成對照藥材溶液。
對照品溶液的製備取沒食子酸、CSP-A2對照品，分別加甲醇製成每1ml含50μg的溶液，作為對照品溶液。
測定法精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，並計算沒食子酸、CSP-A2含量，即得。
本品指紋圖譜色譜圖與對照藥材色譜圖譜比較，至少含5個相應色譜峰，應含沒食子酸、CSP-A2色譜峰。
測定法精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得

附圖1為化合物CSP-A2的1H-NMR譜；附圖2為化合物CSP-A2的13C-NMR譜；附圖3為實施例12山香圓葉藥材1的HPLC指紋色譜圖譜；附圖4為實施例12沒食子酸的HPLC色譜圖；附圖5為實施例12CSP-A2的HPLC色譜圖；附圖6為實施例13山香圓葉藥材1的HPLC指紋色譜圖譜；附圖7為實施例13山香圓葉藥材2的HPLC指紋色譜圖譜；附圖8為實施例13山香圓葉藥材6的HPLC指紋色譜圖譜；
附圖9為實施例13山香圓顆粒的HPLC指紋色譜圖；附圖10為實施例13山香圓片的HPLC指紋色譜圖譜。
權利要求
1.山香圓葉及其製劑的的質量控制方法，其特徵在於至少含有以沒食子酸作為指標成分之一的檢測。
2.根據權利要求
1所述的山香圓葉及其製劑的的質量控制方法，其特徵在於以沒食子酸為特徵指標成分之一的指紋圖譜控制方法。
3.根據權利要求
2所述的山香圓葉及其製劑的的指紋圖譜質量控制方法，其特徵在於是高效液相色譜法，採用梯度洗脫，以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以有機溶劑酸水溶液為流動相；檢測波長210～340nm。
4.根據權利要求
3所述的山香圓葉及其製劑的的指紋圖譜質量控制方法，其特徵在於照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VI D)測定，以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.1％磷酸水溶液為流動相B；在0～70分鐘，流動相A從10％～25％，流動相B從90％～75％；檢測波長269±1nm。供試品溶液的製備取山香圓葉粉末1g或製劑適量(相當於山香圓葉藥材1～2g)，加熱水適量，振搖，超聲提取45分鐘，濾過，收集濾液，用稀鹽酸調節pH值3～4，用水飽和正丁醇提取2～6次，合併正丁醇提取液，減壓回收正丁醇，殘渣加甲醇適量使溶解，作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品對照品，加甲醇適量使溶解，得對照品溶液；分別吸取供試品溶液和對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀器，檢測，並與藥材標準圖譜對照，山香圓葉藥材至少有6個相應特徵峰，山香圓葉製劑至少有5個相應特徵峰，均應含沒食子酸色譜峰。
5.根據權利要求
3所述的山香圓葉的指紋圖譜質量控制方法，其特徵在於照高效液相色譜法(中國藥典2005版一部附錄VI D)測定，以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.1％磷酸水溶液為流動相B；在0～30分鐘，流動相A從5％～15％，流動相B從95％～85％，在30～70分鐘，流動相A從15％～25％，流動相B從85％～75％；或在0～30分鐘，流動相A從5％～15％，流動相B從95％～85％，在30～90分鐘，流動相A從15％～25％，流動相B從85％～75％；檢測波長269±1nm。分別吸取權利要求
4項下供試品溶液和對照品溶液各10μl，注入液相色譜儀器，檢測，並與藥材標準圖譜比較，山香圓葉藥材至少有6個相應特徵峰，山香圓葉製劑至少有5個相應特徵峰，均應含沒食子酸色譜峰。
6.根據權利要求
1所述的山香圓葉及其製劑的質量控制方法，其特徵在於以沒食子酸為指標成分的定量控制方法。
7.根據權利要求
6所述的山香圓葉及其製劑的定量控制方法，其特徵在於是高效液相色譜法。
8.根據權利要求
1所述的山香圓葉及其製劑的定性質量控制方法，其特徵在於以沒食子酸為指標成分的薄層色譜鑑別法。
9.根據權利要求
1～8山香圓葉及其製劑的質量控制方法，在含山香圓葉的複方製劑中的應用。
專利摘要
本發明涉及山香圓葉及其製劑的質量控制方法，通過對山香圓葉化學成分的系統研究和分析方法的研究，公開了以沒食子酸等成分為檢測指標的定性和定量質量控制方法，尤其是山香圓葉及其製劑的指紋圖譜質量控制方法，與以前的質量控制技術相比，可以更綜合評價山香圓葉藥材及其製劑的質量，能更好保證製劑的安全有效，具有非常顯著的意義。
文檔編號A61P11/00GK1994340SQ200610201094
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月16日
發明者胡軍 申請人:胡軍導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan