一種鏈黴親和素預包被酶標板的製備方法與應用的製作方法

2023-04-28 05:55:21

專利名稱：：一種鏈黴親和素預包被酶標板的製備方法與應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於體外免疫檢測
技術領域：
，特別涉及一種鏈黴親和素預包被酶標板及其製備方法與應用。
背景技術：
：鏈黴親和素(streptavidin)是由鏈黴菌streptomyces分泌的一種鹼性糖蛋白，易於與聚苯乙烯塑料微孔板結合。一個鏈黴親和素分子能結合4個生物素分子，二者親和常數(K)為1015L/mol。由於生物素與親和素有極高的結合力，生物素-親合素系統(biotin-avidinsystem,BAS)已被廣泛應用於酶聯免疫檢測中。將鏈黴親和素固定到固相載體上，利用BAS固定難包被的小分子抗原抗體或核酸的方法已得到廣泛應用。鏈黴親和素預包被酶標板在酶聯免疫、PCR-ELISA等領域均有應用。BAS固定作用的廣泛應用取決於鏈黴親和素固相包被的良好效果。目前報導的鏈黴親和素包被為通過常規的溼法包被方法實現。溼法包被方法通過調節鏈黴親和素的濃度和包被緩衝液優化包被效果，其過程繁瑣，所需時間長，孔間差、批間差較大，穩定性差，生物素結合力低，包被的鏈黴親和素固定不穩定，洗板過程易洗去。而且，溼法包被方法對酶標板的吸附力要求高，包被結束後要甩掉大部分包被液，鏈黴親和素的利用率低，成本高。幹法包被方法由於會影響抗原抗體等的活性和空間結構，因此在酶聯免疫包被中應用很少。至今為止，尚未有幹法包被方法製備的鏈黴親和素預包被酶標板的報導。
發明內容本發明的首要目的在於克服目前常規的溼法包被製備鏈黴親和素預包被酶標板的不足之處，提供一種鏈黴親和素預包被酶標板的製備方法。本發明的另一目的在於提供由所述製備方法製備的鏈黴親和素預包被酶標板。本發明的再一目的在於提供所述鏈黴親和素預包被酶標板的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種鏈黴親和素預包被酶標板的製備方法，包括以下步驟用pH9.09.8、0.010.07mol/L的碳酸鹽緩衝液或pH4.55.5、(U0.2mo1/L的檸檬酸磷酸鹽緩衝液溶解鏈黴親和素，鏈黴親和素的濃度為1.06.0yg/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加入空白酶標板中，每孔100250iU;之後置於324(TC烘乾，得到鏈黴親和素預包被酶標板。所述的碳酸鹽緩衝液優選為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液；所述的檸檬酸鹽緩衝液優選為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液；所述鏈黴親和素預包被酶標板優選在烘乾後置於封口袋中於25t:下保存；所述鏈黴親和素預包被酶標板中的鏈黴親和素結合穩定，與生物素結合力強；所述鏈黴親和素預包被酶標板應用於體外免疫檢測
技術領域：
，也可用於分子生3物學中核酸檢測領域；所述鏈黴親和素預包被酶標板的應用，包含以下步驟先用PBST緩衝液清洗所述鏈黴親和素預包被酶標板至少5次，每次1分鐘，每次清洗後甩掉拍幹，除去未結合的鏈黴親和素，加入待測物質進行酶聯免疫吸附分析即可；所述PBST緩衝液為含有Tween20的PBS緩衝液，其中Tween20濃度為體積百分比0.05%;所述PBS緩衝液優選為pH值為7.4、濃度為O.Olmol/L的PBS緩衝液；本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果(1)本發明中鏈黴親和素預包被酶標板的製備方法簡單，鏈黴親和素利用率高，從而降低了鏈黴親和素的用量(現有技術的鏈黴親和素包被液濃度需要lOi!g/ml，而幹法在2iig/ml時可達到相比溼法更優的包被效果)。(2)通過本發明所述的製備方法得到的鏈黴親和素預包被酶標板批次穩定，即固相載體-酶標板結合的鏈黴親和素的量較為均勻。另外，所述的鏈黴親和素預包被酶標板的孔間差、批間差及穩定性均高於溼法包被，更適合長期保存。(3)本發明製備的鏈黴親和素預包被酶標板鏈黴親和素結合穩定，PBST緩衝液衝洗20次生物素結合量變化不顯著，性能優良。鏈黴親和素預包被酶標板對於生物素的結合量的測定數據能反映包被的質量，酶標板的生物素結合量越大，說明鏈黴親和素預包被酶標板的包被效果越優越。本實驗中潔特高親和力板幹法包被的最大生物素結合濃度為10ng/ml(見圖1)，即每孔可結合lng生物素(4.1pmo1/孔)。而同樣的方法測得的國產預包被板生物素結合量只有0.2ng(0.8pmo1/孔)，顯示本實驗的包被效果優於國產預包被板。(4)本發明所述的製備方法對空白酶標板的質量要求低，國產板和進口板之間的差異不顯著，而溼法包被對空白酶標板的質量要求高，國產板和進口板之間有顯著差異(如表4所示)，因此，本發明所述的製備方法成本更低。(5)本發明採用了碳酸鹽緩衝液(pH9.6)和檸檬酸磷酸鹽緩衝液(pH5.0)兩種pH值相差極大的包被緩衝液，可分別適合後期檢測中不同pH值的檢測體系，擴大了本發明的適用範圍。圖1是生物素結合容量測定結果圖。具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1空白酶標板為潔特高親和力酶標板。使用pH9.6、0.05M的碳酸鹽緩衝液(1.59g碳酸鈉和2.93g碳酸氫鈉加水稀釋至lOOOmL)稀釋鏈黴親和素至2g/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加到空白酶標板中，每孔100iU，之後置於恆溫箱中37t:溫育過夜至完全乾燥，得到鏈黴親和素預包被酶標板。乾燥的酶標板用封口袋裝好於4t:下保存。實施例2空白酶標板為潔特高親和力酶標板。使用pH5.0、0.15M的檸檬酸磷酸鹽緩衝液(1030ml0.1M檸檬酸和970ml0.2MNa2HP04混合得到)稀釋鏈黴親和素至2g/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加到空白酶標板中，每孔100iU，之後置於恆溫箱中37t:溫育過夜至完全乾燥，得到鏈黴親和素預包被酶標板。乾燥的酶標板用封口袋裝好於4t:下保存。實施例3空白酶標板為Nunc酶標板。使用pH5.0、0.15M的檸檬酸磷酸鹽緩衝液(1030ml0.1M檸檬酸和970ml0.2MNa2HP04混合得到)稀釋鏈黴親和素至2g/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加到空白酶標板中，每孔100iU，之後置於恆溫箱中37t:溫育過夜至完全乾燥，得到鏈黴親和素預包被酶標板。乾燥的酶標板用封口袋裝好於4t:下保存。實施例4空白酶標板為潔特高親和力酶標板。使用pH9.0、0.01M的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液稀釋鏈黴親和素至6iig/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加到空白酶標板中，每孔200iU，之後置於恆溫箱中4(TC溫育過夜至完全乾燥，得到鏈黴親和素預包被酶標板。乾燥的酶標板用封口袋裝好於4t:下保存。實施例5空白酶標板為Nunc酶標板。使用pH9.8、0.07M的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液稀釋鏈黴親和素至1Pg/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加到空白酶標板中，每孔250iU，之後置於恆溫箱中32t:溫育過夜至完全乾燥，得到鏈黴親和素預包被酶標板。乾燥的酶標板用封口袋裝好於4t:下保存。實施例6空白酶標板為Nunc酶標板。使用pH4.5、0.2M的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液稀釋鏈黴親和素至6iig/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加到空白酶標板中，每孔250iU，之後置於恆溫箱中4(TC溫育過夜至完全乾燥，得到鏈黴親和素預包被酶標板。乾燥的酶標板用封口袋裝好於4t:下保存。實施例7空白酶標板為潔特高親和力酶標板。使用pH5.5、0.1M的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液稀釋鏈黴親和素至1Pg/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加到空白酶標板中，每孔150iU，之後置於恆溫箱中32t:溫育過夜至完全乾燥，得到鏈黴親和素預包被酶標板。乾燥的酶標板用封口袋裝好於4t:下保存。對比實施例1採用溼法包被鏈黴親和素，使用潔特高親和力酶標板使用pH5.0、0.15M的檸檬酸磷酸鹽緩衝液(1030ml0.1M檸檬酸和970ml0.2MCNNa2HP04混合得到)稀釋鏈黴親和素至4g/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加到空白酶標板中，每孔100iU，之後置於恆溫箱中fC包被16h，甩幹包被液，在37t:下封板2h，封口袋裝好後保存於4t:。對比實施例2操作同對比實施例l，區別僅在於使用的空白酶標板為Nunc酶標板。效果比較將實施例13通過幹法製備得到的鏈黴親和素預包被酶標板與對比實施例12通過溼法製備得到的鏈黴親和素預包被酶標板進行比較表l為各種酶標板的包被效果比較。各種酶標板在使用前用含體積百分比0.05%Tween20的PBST緩衝液(PBS緩衝液的濃度為0.01mol/L，pH值為7.4)衝洗5次，每次lmin，以洗掉結合不牢固的鏈黴親和素，提高生物素結合力。接著，加入生物素標記的HRP100ii1(0.01MPBS1:1000稀釋)，測量TMB(4，5-三甲氧基苯甲醛)顯色後的OD值。由表中數據可得，這四種方式包被效果無顯著差異(P〈0.01)。由於幹法包被鏈黴親和素用量少，僅為溼法的一半，說明本發明所述的製備方法利用鏈黴親和素的效率高。另外，實施例13使用的酶標板不同，說明對於本發明的製備方法，空白酶標板的質量對於最終得到的鏈黴親和素預包被酶標板質量影響不大，這有利於成本的降低。表l:四種實施方式包被效果比較tableseeoriginaldocumentpage6注A、a是統計學中的符號，上下字母相同，說明差異不顯著(0.05)或差異極不顯著(O.Ol)，下同。表2為不同包被方法包被的酶標板之間的孔間差、批間差比較。各種酶標板在使用前用含體積百分比0.05%Tween20的PBST緩衝液衝洗5次，每次lmin，以洗掉結合不牢固的鏈黴親和素，提高生物素結合力。接著，加入生物素標記的HRP100iU(0.01MPBS1:1000稀釋)，測量TMB顯色後的OD值。其中潔特板、Nunc板的幹法包被符合國家標準(國標CV值〈15%)。表2:兩種酶標板包被後比較包被法卞&溼法潔特板Nunc板2.954%9.258%7.375%孔間差7.079%9,122%批間差9.235%14,63%表3為實施例1製備的酶標板的解吸附試驗。用洗液PBST(0.05%Tween20)分別洗酶標板5、10和20次，清洗時間為lmin/次，加入生物素標記的HRP100yI(O.OIMPBS1:1000稀釋)清洗次數不同的酶標板的生物素結合能力無顯著差異(P〈0.01)，說明幹法包被鏈黴親和素結合牢固。表3:潔特板幹法解吸附比較潔特板千法OD平均值0.050.015次1.13220次1,077aA10次0,967A表4為本發明所述的製備方法的空白酶標板分別為進口酶標板和國產酶標板的包被效果，操作條件同實施例l。本發明所述的製備方法對空白酶標板的質量要求低，國產和進口板之間的差異不顯著，而溼法包被則有顯著差異(如表4所示)，也就是說溼法包被對空白酶標板的要求高，因此，本發明所述的製備方法成本更低。圖1為執行實施案例1所得鏈黴親和素預包被酶標板，加入不同濃度的生物素溶液，分別為0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、24.0、32.0ng/ml，37°C結合20min，甩幹生物素溶液，加入l:lOOOHRP溫育lh後顯色，所得0D值如圖1。當OD值降至最低處即為酶標板的生物素容量，如圖1實施案例1所得酶標板的最大生物素結合濃度為10ng/ml，即每孔可結合lng生物素(4.1pmol/孔)。而同樣的方法測得的國產預包被板生物素結合量只有0.2ng(0.8pmo1/孔)，顯示本實驗的包被效果優於國產預包被板。表4:進口、國產酶標板包被效果比較板名稱_千法包被OD值_溼法包被OD值進口Costar板"0.781^0.801進「JNunc板0,6510.792國產板I0.M40.41];j產板20麓0扁兇產板3O,WO0.7S8上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。權利要求一種鏈黴親和素預包被酶標板的製備方法，其特徵在於包括以下步驟用pH9.0～9.8、0.01～0.07mol/L的碳酸鹽緩衝液或pH4.5～5.5、0.1～0.2mol/L的檸檬酸磷酸鹽緩衝液溶解鏈黴親和素，鏈黴親和素的濃度為1.0～6.0μg/ml，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加入空白酶標板中，每孔100～250μl；之後置於32～40℃烘乾，得到鏈黴親和素預包被酶標板。2.根據權利要求1所述鏈黴親和素預包被酶標板的製備方法，其特徵在於所述的碳酸鹽緩衝液為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩衝液。3.根據權利要求1所述鏈黴親和素預包被酶標板的製備方法，其特徵在於所述的檸檬酸鹽緩衝液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液。4.根據權利要求1所述鏈黴親和素預包被酶標板的製備方法，其特徵在於所述鏈黴親和素預包被酶標板在烘乾後置於封口袋中於25t:下保存。5.—種鏈黴親和素預包被酶標板，通過權利要求14任一項所述的製備方法得到。6.權利要求5所述鏈黴親和素預包被酶標板的應用，其特徵在於所述的鏈黴親和素預包被酶標板應用於體外免疫檢測
技術領域：
或分子生物學中核酸檢測領域。7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於先用PBST緩衝液清洗所述鏈黴親和素預包被酶標板至少5次，每次1分鐘，每次清洗後甩掉拍幹，除去未結合的鏈黴親和素，加入待測物質進行酶聯免疫吸附分析即可；所述PBST緩衝液為含有Tween20的PBS緩衝液，其中Tween20濃度為體積百分比0.05%。8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述PBS緩衝液為pH值為7.4、濃度為0.01mol/L的PBS緩衝液。全文摘要本發明公開了一種鏈黴親和素預包被酶標板及其製備方法與應用。本發明用碳酸鹽緩衝液或檸檬酸磷酸鹽緩衝液溶解鏈黴親和素，得到包被緩衝液；將包被緩衝液加入酶標板中後烘乾，得到鏈黴親和素預包被酶標板。該製備方法簡單，鏈黴親和素利用率高，從而降低了鏈黴親和素的用量。該製備方法對空白酶標板的質量要求不高，而且得到的鏈黴親和素預包被酶標板批次穩定，鏈黴親和素預包被酶標板的孔間差、批間差及穩定性均高於溼法包被，更適合長期保存。本發明所述的鏈黴親和素預包被酶標板成本低，效果好，可應用於體外免疫檢測
技術領域：
或者是分子生物學中核酸檢測領域。文檔編號G01N33/543GK101692087SQ20091019289公開日2010年4月7日申請日期2009年9月30日優先權日2009年9月30日發明者劉賓,吳希陽申請人:暨南大學