一種大片段dna製備乳腺生物反應器新方法
2023-04-28 13:51:56 1
專利名稱：一種大片段dna製備乳腺生物反應器新方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域和藥物領域，更具體地，本發明涉及製備乳腺生物反應器的製備方法，尤其是用大片段DNA製備乳腺生物反應器的方法。
乳腺生物反應器製藥是80年代末90年代初興起的新興技術。這項技術原理是將人藥用蛋白基因轉入乳用家畜體內，藥用蛋白在家畜乳腺中表達，進而在乳汁中提取蛋白。與細菌表達重組蛋白及哺乳動物細胞表達方法相比，該方法有明顯優勢，例如生產的蛋白不但可以表達較大的蛋白，以複雜的糖基化進行修飾，產生正常的生理活性，而且產量大、生產成本低，因而此技術有著廣闊的市場前景。
自90年以來乳腺生物反應器先後成功表達了抗胰蛋白酶，纖溶酶原，凝血因子九，血漿白蛋白等藥用蛋白，並打入了藥品市場，現在每年產值近十億美元。
但是隨著該技術的大規模應用，一些技術難題漸漸顯現出來。其中最突出的是轉基因表達的位點效應，即轉基因在基因組中隨機整合，但只有整合在活化的染色質區才能表達；這樣只有10-20％的轉基因整合動物的才會不同程度的表達目標蛋白，而且表達量相差顯著，這就大大提高了生產轉基因動物的成本，使得該技術產業化困難。
為了克服位點效應各國科學家作了多年的研究，發現乳蛋白基因的5′和3′調控區遠端存在基因座控制區(locus control region，簡稱為「LCR」)或基質附著區(matrix attachment region，簡稱為「MAR」)[Jew P cell 1992][Kioussis.D,Curr Opin Genet Develop 1997][Blackwood,Science 1998]，這些序列的存在可以克服轉基因表達中的位點效應。但是乳蛋白的LCR序列大多位於基因上下遊的幾十KB的範圍內，如果用質粒來克隆如此大的DNA片段是不可能的，因為質粒的克隆能力在15KB以內。
以YAC(酵母人工染色體)、BAC(細菌人工染色體)和P1人工染色體技術為代表的大片段DNA轉基因技術的發展，提供解決了這一難題的可能。這些載體可以克隆長達幾百KB的DNA片段，可以一次克隆下乳蛋白基因的上下遊遠端幾十KB的調控序列。實驗已表明用BAC、YAC載體構建的大片段DNA消除了轉基因表達中的位點效應，而且明顯體現了轉基因拷貝數與目標蛋白表達的正相關性，轉基因整合的拷貝數越多，表達量越高[Keneth,PNAS 1993]。這些載體不僅克隆能力很強，而且在細菌中和酵母內的同源重組率高[Xiangdong W,Nature Biotechnology 1997]，因而對BAC、YAC分子同源重組改造方便，可以向YAC中重組引入篩選標誌，酶切位點等，並可以將目標蛋白基因轉入YAC轉基因載體中或突變YAC中的基因，酵母中成熟的分子克隆技術促進了YAC載體在轉基因領域的應用。
近年來，大片段DNA轉基因技術應用越來越廣泛，從大基因組基因的功能研究到建立疾病模型都有應用例[Keneth PNAS 1993]。在90年代中後期大片段DNA轉基因技術漸漸應用起來。
97年-99年日本科學家Y.Fujiwara等第一次將YAC載體引入乳腺生物反應器的研究中，97年用含乳清白蛋白基因的YAC DNA(210KB)轉基因，得到了乳清白蛋白表達量高達2-3ml/ml。98年又進一步對YAC進行酵母內同源重組，成功地完成了重組YAC DNA的轉基因。目標蛋白生長激素的表達量可達0.8mg/ml。
1999年法國的Marie-Georges研究組成功應用了170KB的BAC DNA乳腺表達了羊乳清白蛋白，表達量可達0.8-1mg/ml。
Y.Fujiwara和Marie-Georges的成功提示大片段DNA轉基因在乳腺生物反應器領域的應用將領導乳腺製藥領域的技術潮流。應用該技術有利於基因表達調控的進一步深入研究；揭示基因基因定位高效表達的分子機理；促進乳腺製藥產業的發展。
然而，目前的大片段DNA製備乳腺生物反應器的技術仍存在一些缺點，如由於大片段DNA轉基因構建過程的複雜性和操作過程的難度大，所以目前世界上還只有兩三個實驗室作該領域工作；而且只能表達一些長度在10kb以內較小的目的基因；還只能應用該技術生產轉基因小鼠，還沒有該技術生產轉基因大動物的先例。
本發明的目的就是提供一種新的用大片段DNA製備乳腺生物反應器的方法，該方法具有至少如下一個或多個優點1．簡化了大片段DNA轉基因構建方法，使其程式化，促進了在乳腺製藥工業的應用。
2．將酵母內YAC嵌合技術引入大片段DNA轉基因構建方法，使得可以表達長度10kb-200kb的目的基因的基因組基因，擴展了大片段DNA轉基因技術的應用範圍。
3．首次應用大片段DNA轉基因技術製備轉基因乳山羊。
本發明提供了一種用大片段DNA製備乳腺生物反應器的方法，它包括步驟製備BAC、YAC和P1載體上的含目的基因的大片段DNA，其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點表達；用原核注射法將大片段DNA注射入山羊受精卵內，移植到代孕山羊體內，產生轉基因的山羊，大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點表達。
在本發明的一個實施例中，該目的基因編碼乳鐵蛋白，而且將含乳蛋白基因的大片段直接用於轉基因。
在本發明的一個實施例中，該大片段DNA通過酵母內同源重組的方法進行改造，從而在該大片段DNA中乳蛋白基因的調控序列位於目的基因的兩側並指導目的基因的表達。一種酵母內同源重組的方法改造大片段DNA的具體程序包括步驟用聚合酶鏈式反應方法調取乳蛋白基因上下遊各一段300-1500bp調控序列作為同源臂，兩者之間插入要表達的目的基因構建成打靶載體。較佳地，還包括步驟將所述的打靶載體，與含有乳蛋白基因大片段上下遊序列及基因自身的完整編碼序列的大分子YAC、BAC、P1克隆進行酵母內重組，從而將目的基因插入在乳蛋白基因的大片段調控序列下。
在本發明的一個較佳實施例中，大片段DNA可包括長度為5-200kb的含目的基因的基因組序列，和位於所述基因組序列兩側並指導目的基因表達的長度為50-200KB的乳蛋白基因的調控序列。
如本領域技術人員所熟知的那樣，所述的乳蛋白基因的調控序列指乳蛋白基因編碼區的5′和3′序列，通常包括如下控制乳蛋白基因轉錄的核心序列如TATA盒、GC盒，遠端基因座控制區。
在本發明的另一實施例中，所述的大片段DNA是用酵母內YAC嵌合方法製備的。一種具體的用酵母內YAC嵌合方法製備大片段DNA的程序包括步驟製備乳腺定位表達ALA的表達載體和含目的基因的基因組序列的表達載體；用聚合酶鏈式反應(PCR)方法調取乳蛋白基因上下遊各一小段調控序列(300-1500bp，較佳地500-1000bp)，和目的基因的頭尾各一小段序列(500-1000bp，較佳地300-1500bp)，用同源重組方式將所述的乳蛋白基因上下遊各一小段調控序列分別插入所述目的基因的頭尾各一段序列的上下遊，形成兩個嵌合載體；嵌合載體與所述的含目的基因的基因組序列的表達載體進行同源重組，形成目的基因嵌合載體，其中所述的乳蛋白基因上下遊各一小段調控序列位於目的基因的兩側；將目的基因嵌合載體與乳腺定位表達乳蛋白的表達載體轉入同一酵母中，兩者重組形成嵌合分子，其中該嵌合分子上乳蛋白基因大片段上下遊序列指導目的基因的基因組序列的表達。
在附圖中，
圖1顯示了含HLF目的基因的大片段DNA，其中在上方標出了各酶切位點。
圖2顯示了載體RS-ALA-IL的結構。
圖3顯示了用酵母同源重組方法製備含IL-11目的基因大片段DNA的過程。
圖4顯示了載體RS-ALA-IL與含有ALA基因的YAC分子(Y-ALA)之間的同源重組，從而獲得含IL-11目的基因和ALA調控序列的YAC分子(Y-ALA-IL-11)。
圖5顯示了載體RS-FIX2的結構。
圖6顯示了載體RS-FIX1的結構。
圖7顯示了用載體RS-ALA-IL與含有ALA基因的YAC分子(Y-ALA)之間的同源重組，從而獲得含IL-11目的基因和ALA調控序列的YAC分子(Y-ALA-IL-11)。
在本發明中，「大片段DNA」指長度大於50kb，較佳地大於100kb，更佳地大於150kb的DNA分子。
適用於本發明的動物包括常見的哺乳動物，尤其是用於畜牧業和產奶業的哺乳動物，例如牛和羊。更佳地該動物是羊，例如莎能乳山羊、波爾羊、普通山羊。
由於本發明方法具有通用型，因此，適用於本發明方法的目的基因沒有特別限制，例如在本發明的3個實施例中就選用了HLF、IL-11、FIX3中不同的蛋白。至於獲得目的基因的途徑，一種較方便的方法就是通過市售的各種YAC克隆，或者通過用常規方法構成的YAC克隆，採用PCR法和酶切的方法獲得含目的基因的DNA片段，尤其是基因組片段。
在本發明中，通常採用YAC和BAC作為轉基因載體，由於YAC有著平均700kb、BAC有著200KB左右的DNA裝載能力，因而可以容納人或哺乳動物的乳蛋白基因的大片段上下遊序列。
更佳地，採用YAC作為轉基因載體。與目前大多數轉基因動物採用的質粒載體相比，用YAC DNA作為轉基因構建，有明顯的優越性。
1、可以克服整合位點效應。
採用質粒上的小片段轉基因構建時，由於質粒的DNA裝載能力有限(只有20kb之內)，只能克隆較短的乳腺表達啟動序列，這樣轉基因構建必須整合到轉錄活性高的基因組部位，才能得到較高表達，但是整合是隨機的，這樣生產出的轉基因動物的目的基因產物表達量就很不均一，有的不表達，有的低表達，只有極少數較高表達。
相反，用YAC載體的大片段轉基因構建轉基因時，由於含有足夠的上下遊調控序列，因而無論整合在基因組何處，轉基因本身序列有形成局部轉錄活性單元的能力，這就克服了整合位點效應，使轉基因動物的表達量穩定。
2、提高表達量，穩定高效表達。
許多例子表明，蛋白質乳腺表達時採用目標蛋白基因組DNA(gDNA)的表達量明顯高於mRNA的表達量。但在質粒載體轉基因時，對於gDNA稍大的蛋白(10KB以上)往往只能採用該基因的mRNA了。與此相比，YAC載體不僅可以得到足夠長度的調控序列，而且應用YAC嵌合和同源重組技術可以克隆很長的目標蛋白gDNA用於乳腺表達。
一般來說，採用YAC大片段DNA轉基因時，基因的表達水平與體內的同源基因表達水平相當，這對於乳腺製藥工業中在乳腺中大量表達外源目的基因的目標來說，YAC轉基因有很好的應用前景，質粒載體的大片段DNA表達量都要比體內同源基因的水平低1-2個數量級。
3、可以克服異位表達。
乳腺特異表達的轉基因在乳腺以外的表達，叫作異位表達。乳腺中表達的外源基因產物常常在肝、腎等臟器也有微量的表達，這嚴重地影響了轉基因動物本身的健康。而採用YAC載體調取大片段的調控序列則可嚴格控制轉基因表達的組織特異性和發育表達的時序性，從而克服異位表達。
綜上所述，採用大片段DNA轉基因可以大大提高乳腺製藥過程中的成功率，對於降低成本，穩定質量具有深遠的推動作用。
在本發明中，構建乳腺表達載體時通常有三種方式1、對於含有乳蛋白調控序列的目的基因(如人乳蛋白基因)，可以直接製備含人乳蛋白基因的大片段DNA，並以原核注射法生產轉基因山羊。
該方式的優點是構建轉基因大片段DNA簡單，而且目的產物表達量高。
2、利用同源重組方法，改造乳蛋白基因的大片段DNA，將外源基因(如珍貴的藥用蛋白基因)重組入大片段DNA上，使其位於乳腺表達基因的上下遊調控序列下，受其調控。
該方式的優點是構建轉基因大片段DNA周期短。
3、利用YAC嵌合方法，將含目的基因的克隆和乳蛋白基因的YAC克隆轉入同一酵母中，兩者重組形成嵌合YAC分子，其中嵌合YAC分子上乳蛋白基因大片段上下遊序列指導目的基因大分子基因組基因的表達。
該方式的優點是適用性強，以此方法可以表達幾乎所有的目的基因。
下面結合實施例對發明的進一步說明，其中實施例1、2、和3分別對應上述的三種製備乳腺表達載體的方式。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人乳鐵蛋白(HLF)乳腺轉基因構建人乳鐵蛋白(HLF)乳腺表達載體構建人HLF是在人乳腺中特異性高表達量蛋白，在人乳中的表達量可達1.4克/毫升乳汁，所以其基因本身的啟動子即可指導HLF的高效定位表達，為此用PCR調取了該基因的YAC克隆，並進行了稀少酶切分析，確定該YAC株中含有80kb和120kb的啟動序列和下遊調控序列。直接用於乳腺表達。
一、實驗材料人基因組CHEF YAC文庫(上海市第二醫科大學血研所陳竺院士惠贈)，脈衝場電泳儀CHEF-Ⅱ，超濾器(Millipore UTK00)，核酸內切酶，Taq酶及瓊脂糖酶購自Promega公司。
P32CTP同位素標記試劑盒購自Promega公司。
二、構建過程1、用PCR和Southern印跡法來調取並驗證含有人HLF基因的YAC株。
用PCR方法篩選含HLF基因的YAC分子。其中PCR程序為95℃5分鐘，94℃30秒，55℃40秒35個循環，72℃延伸7分鐘。引物為Primer HLF(引物HLF:5′AAGCCTGTGAATTCCTCAG 3′和5′GCTAAGACTACAGCAGGG 3′〕，篩人基因組YAC文庫。經多輪篩選得到了含HLF基因克隆YAC克隆Y-HLF。進一步的Southern印跡結果表明該YAC分子為410KB。
2、含HLF的YAC克隆進一步酶切分析和HLF基因的定位。
用低熔點瓊脂糖法製備HLF克隆的染色體包塊，分別用限制性內切酶SalⅠ,NotⅠ,NruⅠ,MluⅠ和BssHⅡ部分酶切，轉膜。pBR322質粒用BamHⅠ和PvuⅡ酶切，回收1.2KB的YAC分子左臂序列，以α32P標記後與上膜雜交，進而得到該克隆的稀有酶切圖譜。以此為基礎，以α32P標記引物對HLF的PCR產物與上膜雜交，確定了HLF基因在該YAC分子的中部，上下遊各有100KB和180KB的調控序列(
圖1)。
3、Y-HLF分子的純化①染色體包塊製備挑取YAC單克隆接種10ml的AHC培養基中，30℃通氣培養過夜。1500rpm離心5分鐘收集酵母，用10ml 50mM EDTA以同條件離心洗滌兩次，總酵母體積調整到200ul。加100u的lyticase 20ul，混勻，再加200ul 37℃的融化的2％低熔點瓊脂糖，混勻後灌入模板製成包塊。加入原生質球製備液中(50mM EDTA,3％巰基乙醇)，37℃過夜。更換裂解液(50mM EDTA,100ul/ml蛋白酶k)消化24小時。
②Y-HLF分子的純化用含YAC分子的酵母染色體包塊，跑脈衝場電泳膠採用1％的超低溶點瓊脂糖。在經染色觀察後，切取YAC條帶，在65攝氏度水浴5分鐘，之後加入瓊脂糖酶和其25倍的緩衝液，42攝氏度消化2小時。
用截斷分子量為20000的超濾器來濃縮YAC分子，達到2ug/ml的濃度，再用注射緩衝液(Tris-Cl,pH8.0,NaCl 100mM,EDTA 0.025mM)，透析4小時，此時製備的YAC分子即可用於顯微注射來生產轉基因動物。
③轉基因動物的製備A、顯微注射將上述純化後的YAC分子，通過顯微注射的方法導入到莎能奶山羊受精卵雄原核內，再移植到同步發情的受體山羊輸卵管內，待其妊娠產仔。山羊超排、注射、移植以及產仔等試驗結果如下B、轉基因整合檢測將出生不久的小羊羔取其耳組織提取DNA，應用PCR的方法(參見「二、構建過程1」，引物是HLF:5′AAGCCTGTGAATTCCTCAG 3′和5′GCTAAGACTACAGCAGGG 3′)進行轉基因的整合檢測，結果轉基因的整合率為20％(10/50),PCR+Southern試驗證實了基因的整合。
C、表達檢測將性成熟的轉基因羊通過人工催乳，應用Western方法檢測其乳汁中目的蛋白。結果表明其中有人乳鐵蛋白的表達。
實施例2Y-ALA-IL-11轉基因YAC DNA的構建在該實施例中，應用同源重組的方法將人白介素IL-11基因重組入含人乳清白蛋白(ALA)基因的YAC中，從而受到ALA基因的啟動子和下遊調控序列的控制(圖3)。
一、實驗材料Y-ALA為含有ALA基因的YAC分子(上海市第二醫科大學血研所陳竺院士惠贈)，穿梭載體RS403(帶His 3篩選基因)購自Stratagene公司。IL-11基因組基因克隆(由本研究中心篩庫獲得)。
引物ALA1:5′CCGGAATTCGCCTAGATGCTTTCATACAGG 3′5′TCCCCCGGGTTTGGCTACCCCCAAGAACCT 3′ALA2:5′ATTGGGCCCATCCCAGGGAAATGAAGGAAG 3′5′CCGCTCGAGAAGGCTCAGAGACAGATAAG 3′。
A-I3:5′GCTCCTGGGCTCAAGTG 3′5′CTTTAACCCTTCCCTGTCC 3′A-I4:5′TGACTGTGTATTTTGCATGAC 3′5′TTCAAGAATTCGGTGATGTC 3′二、構建過程(調取ALA基因的上下遊同源臂結構)1、構建酵母內穿梭重組載體PRS-ALA。
通過PCR反應，分別用引物對ALA1和引物對ALA2從人基因組DNA中複製人ALA基因的上下遊各700和900bp的ALA-up和ALA-down片段。PCR循環的條件與擴增出的ALA-up和ALA-down片段經ApaⅠ+XhoⅠ酶切和EcoRⅠ+SmaⅠ酶切後與酶切後的PRS403載體相連接，形成PRS-ALA載體。
2、將人IL-11基因重組入Y-ALA上，形成表達IL-11乳腺表達載體將含有IL-11基因DNA用BamHⅠ和NotⅠ酶切，收取6.0kb的IL-11基因編碼區(帶有全部外顯子和內含子，但不含有其調控序列)，克隆入PRS-ALA中的相應位點，構建成RS-ALA-IL(圖2)。該載體中AlA-up片段的3′末端位於ALA基因轉錄啟始位點下遊25bp處。ALA-down片段的5′位於ALA基因的第四個外顯子上。
以下為ALA-up,ALA-down和IL-11的測序結果，其中粗體為外顯子，正常為內含子。ALA-up序列(SEQ ID NO:1)-GTGCCTGGCCTAGATGCTTTCATACAGGCTTTTCAATTATGCATTTTCCTTAAGTAGGAAGTCTTAAGATCCAAGTTATATCGGATTGTTGTAGTCTACGTTCCCATATTCTATTCCTATTTCTGAGCCTTCAGTCATGAGCTACCATATTAAAGAACTAATTCTGGGCCTTGTTACATGGCTGGATTGGTTGGACAAGTGCCAGCTCTGATCCTGGGACTGTGGCATGTGATGACATACACCCCCTCTCCACATTCTGCATGTCTCTAGGGGGGAAGGGGGAAGCTCGGTATAGAACCTTTATTGTATTTTCTGATTGCCTCACTTCTTATATTGCCCCCATGCCCTTCTTTGTTCCTCAAGTAACCAGAGACAGTGCTTCCCAGAACCAACCCTACAAGAAACAAAGGGCTAAACAAAGCCAAATGGGAAGCAGGATCATGGTTTGAACTCTTTCTGGCCAGAGAACAATACCTGCTATGGACTAGATACTGGGAGAGGGAAAGGAAAAGTAGGGTGAATTATGGAAGGAAGCTGGCAGGCTCAGCGTTTCTGTCTTGGCATGACCAGTCTCTCTTCATTCTCTTCCTAGATGTAGGGCTTGGTACCAGAGCCCCTGAGGCTTTCTGCATGAATATAAATAAATGAAACTGAGTGATGCTTCCATTTCAGGTTCTTGGGGGTAGCCAAA-------以下接IL-11基因ALA5′UTR------IL-11基因(SEQ ID NO:2)-ATGCCTCCCCTCCCCAGCCGCGGGCCCAGCTGACCCTCGGGGCTCCCCCGGCAGCGGACAGGGAAGGGTTAAAGGCCCCCGGCTCCCTGCCCCCTGCCCTGGGGAACCCCTGGCCCTGTGGGGACATGAACTGTAAGTTGGTTCATGGGGAGGGTGGAGGGGACAGGGAGGCAGGGAGGAGAGGGACCCACGGCGGGGGTGGGAGCAGACCCCGCTGAGTCGCACAGAGAGGGACCCGGAGACAGGCAGCCGGGGAGGAGAGCAGCTTCGGAGACAGGAGGCGGCGGAGGAGATGGGCAGAGAGAGACACAGACAGGAGCGGATGGAGGCAGCCAATCAGAGGCGCCGCAGGAGGGACGGGCCAGACAGGGCCCGAGAGGAGCGAGACGCGAGACCGAGCAGGGGCAGGGACGCAGGGACTGGTGCCGGGAGGGAGGTGACCCCCATCGACCCAGGCCCCAGGGAGCCCGCGGGGACCGGGAGACTCCCTGGGATTCCGGCAGAGAGGCTCCGGAGGGAAACTGAGGCAGGGTCCGCGGAGAGCGGAGCAAGCCAGGGAGTAGCGACCCCAGCCGGGGGGAGGAGAGAGACTGGGCGCCGGGGGAAAGCGGGGAGAGCCGGGCAGATGCGGCCGACGGAGGCGCGGACAGACCGACGGCTGGCGGGCCCGGGGGGCGGGCTGGGGGTGTGCGAGGCGCGGGCGGCCGGGGAGCGCTGATTGGCTGGCGGGTGGCCGGGTGGGCGGGGCGGCCGGGGTGGGCTGCGGGGAGCGAGCTCCGGACCCCCGCGCCCCCGGCGCCCCCCGCGCCCCCCGCCGCCAGCTCTCCCGCTCCCGGCGCCCGGCCGGGCCATGGCTCTGCCCCTCTCCGCCCAGGTGCGCTGCGGCCCGGGCTTCTGCCGCCCACCCGGCGGGCTCCTGGGAGGGCGTCTAAGGGGTCTCCCGTGGGAGAGGTCCGTGTCTCCCGGACTCCGTCCTGGGCTTTTGGCTCCTTCCCCTGCTCCCAGCCAGCTCGGGCTCCCGCGGCCCGGGGAGGGGGCAGGTTCTGGCCTGTGCCTCCCCCACCATCCGCGCCCCGGGGCCCAGATTCCGGCGTCCGGGGGCGGACGGGAGACGCCCGGGCCGCGTCTGCTCCGACGGGCGGGGCAGCCAGAGCCAGGGAGGGAGAGGGAAGCCCGCCTGGCCCTGCGACCTGCCCGCGGGCGTTCCACCCTGGGACTTAAGACCTCCAGCTCCATCCTCCCTAAGGCCGGGAGTCCAGGCCCCAGACCCTCCTCCCCGAGACCCAGGAGTCCAGACCCCAGGCCTTCCTCCCTCAGACCTAGGAGTCCAGGCCCCCAGCCTCTCCTCCCTCAGACCCAGGAGGAGTCCAGACCCCAGTTCCTCCTCCCTCAGACCCGGGAGTCCAGCCCAGGCCCTCCTCTCTCAGACCCGGAGTCCAGCCTGAGCTCTCTGCCTTATCCTGCCCCCAGGCCTGTGGCCAGATACAGCTGTCGCCCCTGGGCCACCACCTGGCCCCCCTCGAGTTTCCCCAGACCCTCGGGCCGAGCTGGACAGCACCGTGCTCCTGACCCGCTCTCTCCTGGCGGACACGCGGCAGCTGGCTGCACAGCTGCGGAGAGGAGTCTGCGGGCAGCCACTTGGAGGGGTTCTGGGCTCTCAGGTGGCAGAGTGAGGGAGGGGAAGAGTTGGGGGCCTGGCGTGGGGGATGGAGGGAGCCCCGAGGCTGGGCAGGGGCCACCTCACAGCTTTTTTCCCTGCCAGCCCTGCCCACCCTGGCCATGAGTGCAGGGGCACTGGGAGCTCTACAGGTAAGGGCAAGGGAGTGGGCTGGGGACAAGGTGGGAGGCAGGCAGTGAAGGGGGCGGGGAGGATGAGGGGCACTGGTCGGGTGTTCTCTGATGTCCCGGCTCTATCCCCAGGCTGCGAGCGGACCTACTGTCCTACCTGCGGCACGTGCAGTGGCTGCGCCGGGCAGGTGGCTCTTCCCTGAAGACCCTGGAGCCCGAGCTGGGCACCCTGCAGGCCCGACTGGACCGGCTGCTGCGCCGGCTGCAGCTCCTGGTATGTCCTGGCCCCAAGACCTGACACCCCAGACCCCCACCCCTGGCCCCAAAATCCTGTGGCCTGAGTCCTTGAAGCCTGAGACCCCAGACCCGAGTGCAACAGCCCCGCTCTGAGACCCTGACACCCTAACAGCCCGCTCTGAGACCCTGACACCGTAACAGCCCCGCTCTGAGACCCTGACCCTAACAGTCCTGCTCTGAGACCCTGACCCTGCAGTCCCAAGATCCTGTGGCCCTGAGACCCTGAGGCCCTAGACCCCCAAATCCTGCCCAGAAACTTCAAATTCTCACCCAAGACCCTGAGACTCCATCATCCATGACCTCAAAGTCCCCAGATCCCAGCCCCTAAGACCCAAGACCCCATCCTGAAGCCCAAAGCCTTGAGAATTCAAATCCTCACCTCAAGACTTGGAGACCCTGGCCCCATGACATTGAAAACCATGGACCTGGCCAGGCGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCAAGTGGATCACCTGAGGTCGGGAGTTCAAGACCAGCCAGACCAACATGGTGAAACCCTGTCTCTACTAAAAATACAAAATTAGCCAGGCGTGGTGGTGCATGCCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCTGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCGCACCATTACACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCAAAACTCCCTCTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGGAAAAGAAAACCATGGACCTCCAGACCCTGAGACCCCAGGCCCCAGCCCTGAGATCCTGACATCTTAAAGATCCCAGGCCCTAAGATACAAGACCTTGACCCAAAGCCAGCCTTGGGACCCTGGCTGTACAAACCCAAGACCTCCAGGACCTAGACCCCGAGCCCTGAGGCCCTATGTCTCACTCCCAACATCGAAAACCCTGACACCTCAGATCCTGAGCCTGCGCCTGTACGACTCCAAGACCCTCACTTCCAAAGCCAGGCCCAAAGCCCTGAGACCAGAAGACTTCAAACCCTGGTTCTTGGGCCTAACTCCAAAGACCCTGGATCTCAAATTCCAACTTCTAGCTCTGAGACTCCAGCCCTCACCCATGAGTTCCTGAACTTGAACCCAGAGACCCCATCTCTAAGACTTCAGCCTTGAGATCCAGGGCCTGACCCTAGACTCGAGCCCACAGACCTCAGATACTGTCTGTAAAACCCCAGCTCTGGTGGGGAGCAGTGGCTCACTCCTGTAATCCCAAGGCAGGGGAGGCCAAGGCAGAAGGACCTCTTGAGGCCATGAGTTTGAGACAGCCTGGGCAGCATAGCAAGACTCTGTTTCTTAATTATTATTATTATTATTATTTTTTGGAGACAGAGTCTCGCGCTCTGTTGCCCAGGCTAGAGTGCAATGGTGCCATTTCGGCTTGCTGGAACCTCCGCCTCCTGGGCTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTTCAGGTGCACACTGCCACACCCGGATAATTTTTTTGTATTTTAGTAGACACAGGGTTTCACCGTGTTGCCCAGGCTGGTCACAAACTCCTGAGCTCAGGCCATCCGCCCGCCTCGGCCTCCCAAAGCGCTGGGATAACAGGCGTGACGCCGCGCCTGGCTTCTTAATTGTTCTAACAGCAGCGACAACAACAAAAACCCAGCTCTGAGATTCCAGCCCCGGCGACTCTAACAGTCCCAGGCCCGATCCCTCACCTAGAACCGAGATGCCAGCCCTGACTCCACAGACTTCACCCCCAACCCCCACACTCAGCTCTGGAAGCCCGTCCTGACTCCAGCCTCCATTTTCGGAACCCCACAGCCTGAAGAGCTCCCGGCCTAAACACTTCACCCCACGCGCCACAGTCCCCCTGTGAATATGCAGCCCCGATTCAGCTGCAGCTCCACAGCACCCCTGCCCTGCACCCCCGCTGCACCCCCTACCTGTGACTCACCTCTCTCCTCTCCCCACAGATGTCCCGCCTGGCCCTGCCCCAGCCACCCCCGGACCCGCCGGCGCCCCCGCTGGCGCCCCCCTCCTCAGCCTGGGGGGGCATCAGGGCCGCCCACGCCATCCTGGGGGGGCTGCACCTGACACTTGACTGGGCCGTGAGGGGACTGCTGCTGCTGAAGACTCGGCTGTGACCCGGGGCCCAAAGCCACCACCGTCCTTCCAAAGCCAGATCTTATTTATTTATTTATTTCAGTACTGGGGGCGAAACAGCCAGGTGATCCCCCCGCCATTATCTCCCCCTAGTTAGAGACAGTCCTTCCGTGAGGCCTGGGGGGCATCTGTGCCTTATTTATACTTATTTATTTCAGGAGCAGGGGTGGGAGGCAGGTGGACTCCTGGGTCCCCGAGGAGGAGGGGACTGGGGTCCCGGATTCTTGGGTCTCCAAGAAGTCTGTCCACAGACTTCTGCCCTGGCTCTTCCCCATCTAGGCCTGGGCAGGAACATATATTATTTATTTAAGCAATTACTTTTCATGTTGGGGTGGGGACGGAGGGGAAAGGGAAGCCTGGGTTTTTGTACAAAAATGTGAGAAACCTTTGTGAGACAGAGAACAGGGAATTAAATGTGTCATACATATCCACTTGAGGGCGATTTGTCTGAGAGCTGGGGCTGGATGCTTGGGTAACTGGGGCAGGGCAGGTGGAGGGGAGACCTCCATTCAGGTGGAGGTCCCGAGTGGGCGGGGCAGCGACTGGGAGATGGGTCGGTCACCCAGACAGCTCTGTGGAGGCAGGGTCTGAGCCTTGCCTGGGGCCCCGCACTGCATAGGGCCGTTTGTTTGTTTTTTGAGATGGAGTCTCGCTCTGTTGCCTAGGCTGGAGTGCAGTGAGGCAATCTAAGGTCACTGCAACCTCCACCTCCCGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGATTAGCTGGGATCACAGGTGTGCACCACCATGCCCAGCTAATTATTTATTTCTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTTTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCTCCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGTGTGAGCCACCACACCTGACCCATAGGTCTTCAATAAATATTTAATGGAAGGTTCCACAAGTCACCCTGTGATCAACAGTACCCGTATGGGACAAAGCTGCAAGGTCAAGATGGTTCATTATGGCTGTGTTCACCATAGCAAACTGGAAACAATCTAGATATCCAACAGTGAGGGTTAAGCAACATGGTGCATCTGTGGATAGAACGCCACCCAGCCGCCCGGAGCAGGGACTGTCATTCAGGGAGGCTAAGGAGAGAGGCTTGCTTGGGATATAGAAAGATATCCTGACATTGGCCAGGCATGGTGGCTCACGCCTGTAATCCTGGCACTTTGGGAGGACGAAGCGAGTGGATCACTGAAGTCCAAGAGTTTGAGACCGGCCTGCGAGACATGGCAAAACCCTGTCTCAAAAAAGAAAGAATGATGTCCTGACATGAAACAGCAGGCTACAAAACCACTGCATGCTGTGATCCCAATTTTGTGTTTTTCTTTCTATATATGGATTAAAACAAAAATCCTAAAGGGAAATACGCCAAAATGTTGACAATGACTGTCTCCAGGTCAAAGGAGAGAGGTGGGATTGTGGGTGACTTTTAATGTGTATGATTGTCTGTATTTTACAGAATTTCTGCCATGACTGTGTATTTTGCATGACACATTTTAAAAATAATAAACACTATTTTTAGAATAACAGAATATCAGCCTCCTCCTCTCCAAAAATAAGCCCTCAGGAGGGGACAAAGTTGACCGCTGATTGAGCCTGTCAGGGCTGTGCAC-----以下接ALA-downALA-down(SEQ ID NO:3)ATCCCAGGGAAATGAAGGAAGTCCCTACCCAGGGTTAGACATTACCACATTGGTCCTTTCATATAGAAAGACAACAGGCACAAGCCTTGAGTTTAGAGAACCCACTGGATCCAGGGGTTAGGGGAACTCAGTGCCTTTCTGGGTAATACTTGTCAGCTGTCTCAATCCTTTCCCTGTAACTCCTGCCAGAGTTCCTGGATGATGACATTACTGATGACATAATGTGTGCCAAGAAGATCCTGGATATTAAAGGAATTGACTACTGTACTGGTGAATCCTTATTCTATTTTCTATTTCCCCATCCTCCTTCTCCTTACCCCATTAGCCCAGCACCCCTTTCCTCTTACCCTATCTCTTGGTCATTTAATCTAGAATACAGTGTCTGAAACAAAGCTTACCTAGAGACTCAGGTTTCTGTTATTAAGCCTCTCTCGCTCCGCTCCTTGGTAGCAATTTTCCTAATAAGGGGTTGCCTAATGGAGGGCTCAGACCCAGGCCTCCTTTCACTTAGACTTGGACATCTAATTCCACTTGTTTAGTTCTATGCCCTAAAGCAAGCTGTTGGTAACATTGCATCTCTTTTTTAACCCTACAATTTTCTTGGATATTTTTTATGGACTGTATTCCACTTGATGGCTTGTGTCGCTTGACATCAGGCCAGGAATGTCTTTCTGTAATTCTCGTCCACGCTCTTCCACTTCAGCCCTCCTGGGAATGAATGTAAAGATTCAGTCAGCTAACTCACCTTGTCCCCCTTCTCCATTATCAGGTTGGCCCATAAAGCCCTCTGCACTGAGAAGCTGGAACAGTGGCTTTGTGAGAAGTTGTGAGTGTCTGCTGTCCTTGGCACCCCTGCCCACTCCACACTCCTGGAATACCTCTTCCCTAATGCCACCTCAGTTTGTTTCTTTCTGTTCCCCCAAAGCTTATCTGTC3．對含有ALA基因的YAC分子(Y-ALA)進行轉宿主Y-ALA分子是存在於宿主AB1380中的，由於AB1380中的遺傳標記少，不利於同源重組，所以將該YAC分子轉移到YPD925宿主菌中，有利於下一步的基因重組。YPD925酵母株可以用-His或-Leu的營養標記來篩選重組基因。
過夜培養YPD925菌體和含Y-ALA的酵母株，第二天各收取1ml菌液混和離心(2500rpm,2min)，用1ml新鮮的YPD重懸，30攝氏度培養6-8小時，後吸取0.2ml培養物塗篩選平板(-Ura，含有放線菌酮3ug/ml)，培養3天出現菌落。此時YAC分子已轉移到酵母株YPD925中。
4將IL-11基因重組入Y-ALA分子中，構建重組YAC ALA-IL。
過夜培養，Y-ALA菌株100ml，培養物OD值達到0.5左右時，離心收集，用水重懸，離心，用RS-ALA-IL載體通過LiAC法轉化Y-ALA菌株，從而讓RS-ALA-IL與Y-ALA之間發生重組(圖4)。篩選到His+,Ura+和Trp+的轉化子。進一步用引物對A-I3和A-I4鑑定，可分別拉出700和1000bp產物的，即為同源重組子YAC-ALA-IL〔或稱為Y-ALA-IL-11〕。
5重組YAC的純化重組YAC的純化同實施例1。製備的YAC分子即可用於顯微注射來生產轉基因動物。
A、顯微注射將上述純化後的YAC分子，通過顯微注射的方法導入到莎能奶山羊受精卵雄原核內，再移植到同步發情的受體山羊輸卵管內，待其妊娠產仔。山羊超排、注射、移植以及產仔等試驗結果如下B、轉基因整合檢測將出生不久的小羊羔取其耳組織提取DNA，應用PCR的方法(與本實施例「二、構建過程1」中的PCR法相同)進行轉基因的整合檢測，結果轉基因的整合率為20％10/50),PCR+Southern試驗證實了基因的整合。
C、表達檢測將性成熟的轉基因羊通過人工催乳，應用Western方法檢測其乳汁中目的蛋白。結果證實了IL-11的表達。
實施例3一、實驗材料Y-ALA、Y-FIX(含有凝血因子9基因的YAC克隆)(上海市第二醫科大學血研所陳竺院士惠贈)，RS403,RS-401(購自Stratagene公司)，AB1610酵母〔常用菌株〕。引物ALA1: 5′CCGGAATTCGCCTAGATGCTTTCATACAGG 3′5′TCCCCCGGGTTTGGCTACCCCCAAGAACCT 3′ALA2: 5′ATTGGGCCCATCCCAGGGAAATGAAGGAAG 3′5′CCGCTCGAGAAGGCTCAGAGACAGATAAG 3′FIX1 5′CAAAGGTTATGCAGCGC 3′5′AGCTGACATCATGTCTGGAG 3′FIX2 5′GTCATAATTTCAGAACCCACG 3′5′TGAATTAACCTTGGAAATCC 3′F-A1 5′TGGACATTATTTCCCAGAAG 3′5′TTTGGCTACCCCCAAGAACCT 3′F-A2 5′ATCCCAGGGAAATGAAGGAAG 3′5′GGTAAAATATGAAATTCTCCC 3′二、構建過程1、調取ALA基因的上下遊調控序列片段。
通過PCR反應，分別用引物對ALA1和引物對ALA2從人基因組DNA中擴增出人ALA基因的上下遊各700和900bp的片段。PCR循環參數同實施例1。
2、調取凝血因子9基因的頭、尾片段。
通過PCR反應，分別用引物對FIX1和引物對FIX2從人基因組DNA中擴增出人FIX基因的頭尾各1KB和1.2KB的片段。PCR循環參數同實施例1。
3、構建重組載體將步驟1中的700bp的ALA上遊片段經EcoRⅤ和NotⅠ酶切與1KB的凝血因子9基因頭段經EcoRⅤ和XhoⅠ酶切，插入RS403相應位點中，形成載體RS-FIX1〔圖5〕。
將步驟1中900bp的ALA下遊片段(經EcoRⅤ和NotⅠ酶切)與1.2kb的凝血因子9基因尾段(經EcoRⅤ和XhoⅠ酶切)插入RS401相應位點中，形成RS-FIX2〔圖6〕。
4、酵母內重組構建重組Y-rFIX同時將RS-FIX1和RS-FIX2用LiAC法轉化含Y-ALA的YPD925酵母株，篩取Leu+和His+特性的重組YAC分子(圖7)。進一步用引物對F-A1和F-A2篩選同源重組子，PCR反應得到750和850bp條帶即為重組子Y-rFIX。
5、Y-ALA與重組Y-FIX分子發生YAC嵌合重組提取Y-ALA分子，原生質體法轉化導入AB1610，過夜培養該菌及含Y-rFIX的AB1380菌株，第二天，各取1ml混和離心，後用1ml新鮮的YPD培養液30攝氏度培養4-8小時，塗篩選平板(-Leu,-Trp,-Ura)，3天後長出克隆。克隆進一步在孢子形成培養基上培養3天，用1ml水來洗下菌體，用超生波處理，得到孢子液，進一步塗於篩選培養基，篩取Trp+、Ura+、Leu+、His-,TK-的酵母株，此株即為Y-ALA-FIX重組YAC株。
電泳結果表明Y-ALA-FIX重組YAC株長度為230KB，比Y-ALA樣品長。
6．按實施例1類似的方法，提取重組的YAC分子，用於顯微注射。
A、顯微注射將上述純化後的YAC分子，通過顯微注射的方法導入到莎能奶山羊受精卵雄原核內，再移植到同步發情的受體山羊輸卵管內，待其妊娠產仔。山羊超排、注射、移植以及產仔等試驗結果如下B、轉基因整合檢測將出生不久的小羊羔取其耳組織提取DNA，應用PCR的方法(與本實施例「二、構建過程1」中PCR法相同)進行轉基因的整合檢測，結果轉基因的整合率為20％(10/50),PCR+Southern試驗證實了基因的整合。
C、表達檢測將性成熟的轉基因羊通過人工催乳，應用Western方法檢測其乳汁中目的蛋白。結果證實了FIX因子的表達。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種用大片段DNA製備乳腺生物反應器的方法，其特徵在於，它包括步驟製備BAC、YAC和P1載體上的含目的基因的大片段DNA，其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點表達；用原核注射法將大片段DNA注射入山羊受精卵內，移植到代孕山羊體內，產生轉基因的山羊，大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點表達。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，該目的基因編碼乳鐵蛋白，而且將含乳蛋白基因的大片段直接用於轉基因。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，該大片段DNA通過酵母內同源重組的方法進行改造，從而在該大片段DNA中乳蛋白基因的調控序列位於目的基因的兩側並指導目的基因的表達。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，在用酵母內同源重組的方法改造大片段DNA時，包括步驟用聚合酶鏈式反應方法調取乳蛋白基因上下遊各一段300-1500bp調控序列作為同源臂，兩者之間插入要表達的目的基因構建成打靶載體。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，還包括步驟將所述的打靶載體，與含有乳蛋白基因大片段上下遊序列及基因自身的完整編碼序列的大分子YAC、BAC、P1克隆進行酵母內重組，從而將目的基因插入在乳蛋白基因的大片段調控序列下。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，該大片段DNA包括長度為5-200kb的含目的基因的基因組序列，和位於所述基因組序列兩側並指導目的基因表達的長度為50-200KB的乳蛋白基因的調控序列。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的乳蛋白基因的調控序列包括乳蛋白基因編碼區的5′和3′序列，其上包括如下控制乳蛋白基因轉錄的核心序列TATA盒、GC盒，遠端基因座控制區。
8.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的大片段DNA是用酵母內YAC嵌合方法製備的。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，用酵母內YAC嵌合方法製備大片段DNA時包括步驟製備乳腺定位表達ALA的表達載體和含目的基因的基因組序列的表達載體；用聚合酶鏈式反應方法調取乳蛋白基因上下遊各一小段300-1500bp調控序列和目的基因的頭尾各一小段300-1500bp序列，用同源重組方式將所述的乳蛋白基因上下遊各一小段調控序列分別插入所述目的基因的頭尾各一段序列的上下遊，形成兩個嵌合載體；嵌合載體與所述的含目的基因的基因組序列的表達載體進行同源重組，形成目的基因嵌合載體，其中所述的乳蛋白基因上下遊各一小段調控序列位於目的基因的兩側；將目的基因嵌合載體與乳腺定位表達乳蛋白的表達載體轉入同一酵母中，兩者重組形成嵌合分子，其中該嵌合分子上乳蛋白基因大片段上下遊序列指導目的基因的基因組序列的表達。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該目的基因編碼選自下組的蛋白HLF、IL-11、FIX，且該山羊選自下組莎能乳山羊、波爾羊、普通山羊。
全文摘要
本發明公開了一種新的用大片段DNA製備乳腺生物反應器的方法,該方法包括步驟:製備BAC、YAC和P1載體上的含目的基因的大片段DNA,其中大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點表達;用原核注射法將大片段DNA注射入山羊受精卵內,移植到代孕山羊體內,產生轉基因的山羊,大片段DNA上的目的基因在山羊乳腺中定點表達。用本發明方法可有效地實現目的基因在乳腺中的定點、定時表達。
文檔編號C12N15/11GK1324952SQ0011579
公開日2001年12月5日 申請日期2000年5月22日 優先權日2000年5月22日
發明者成國祥, 王凱, 陳建泉, 吳國祥 申請人:上海中路生物工程有限公司