一種基於果寡糖修飾的抗凍糖肽的製備方法及應用與流程
2023-04-28 09:30:21 1
本發明具體涉及一種基於果寡糖修飾的抗凍糖肽的製備方法及應用，屬於生物、食品加工技術領域。
背景技術：
抗凍蛋白，俗稱冰結構蛋白，又叫作熱滯蛋白，首先於1969年由devries在南極海峽的一種極地魚（trematomusborchgrevinki）的血液中發現。抗凍蛋白具有低溫保護活性，可以作為冷凍保護劑應用於醫學、生物及食品加工等領。如抗凍蛋白應用於組織、細胞及微生物的低溫保存，可以顯著提高其冷凍存活率；抗凍蛋白能減少冷凍食品在低溫凍藏過程形成的冰晶及其重結晶對食品造成的品質劣變，提高冷凍食品的穩定性。
抗凍蛋白的抗凍活性主要來源於抗凍蛋白中的某些活性片段，並不是整個蛋白在起作用。汪少芸等人通過酶解技術從牛皮、豬皮及魚皮等不同來源的膠原蛋白中酶解、分離出具有高抗凍活性的多肽片段。
近年來有研究發現重結晶抑制活性對於抗凍蛋白發揮冷凍保護作用起到了至關重要的作用，然而抗凍蛋白的熱滯活性和冰結合特性對於當凍藏溫度低於熱滯活性溫度區間的生物材料（如細胞、血液、組織）反而起到破壞甚至致死作用，主要因為當凍藏溫度低於熱滯活性溫度範圍時，冰晶生長不受控制而快速轉變成針狀結構，進而導致細胞損傷和解凍後細胞存活率的下降。這也是阻礙天然抗凍蛋白（或肽）作為冷凍保護劑進行實際應用的主要因素。因此，近年來國際研究開始致力於開發一些具有重結晶抑制活性而沒有熱滯活性的新型抗凍蛋白，基於糖基化修飾的抗凍蛋白就是這類活性物質的一種。例如一個由4個ser-gly-gly三肽重複的肽鏈為骨架並通過ser殘基的碳端連接一個半乳糖苷基形成的抗凍肽就發現具有很強的重結晶抑制活性而沒有熱滯活性。此外，研究還發現糖基種類和肽鏈骨架中糖基化位置及胺基酸殘基類型對重結晶抑制活性有著顯著的影響作用，如半乳糖基修飾的抗凍肽重結晶抑制活性比甘露糖基修飾的抗凍肽強，而脯氨酸由於具有限制的旋轉角可使蛋白在溶液中具有明顯二級結構，因此一些含脯氨酸的具有較強的重結晶抑制活性。
果寡糖是一種價格廉價的混合物，由果糖和低聚合度的低聚寡糖組成，而且它被列為具有特殊功能營養和特定功能的食品。在營養方面，它們是膳食纖維的來源，低能量，適合糖尿病患者，無致癌作用，而且是刺激雙歧桿菌生長的益菌素。果寡糖也能通過改善穩定性、質地、口感、味道等增加食物的功能性，同時也可以取代糖和脂肪。一種成功的抗凍多肽-果寡糖共聚物可能擁有更加良好的功能性質。
因此，本發明將不同來源的抗凍多肽與果寡糖通過糖基化修飾手段，化學合成抗凍糖肽。所合成的抗凍糖肽的抗凍活性顯著高於原始抗凍多肽，可以廣泛應用於細胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存；並且該方法安全、易於控制，可以大規模工業化生產。
技術實現要素：
本發明目的在於針對現有技術不足，提供一種基於果寡糖修飾的抗凍糖肽的製備方法及應用。添加本發明抗凍糖肽的細胞、組織、器官、微生物的冷凍存活率均顯著提高；將本發明應用到冷凍保藏食品中，可以很好地保持冷凍食品原有品質的穩定性，顯著降低冷凍損傷引起的食品品質劣變。
為實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
一種基於果寡糖修飾的抗凍糖肽的製備方法，按照如下方法製備：將抗凍多肽粉和果寡糖之間按照質量比為1:1~1:5的比例溶解於磷酸鹽緩衝液中，溶液最終濃度為5~15%（w/v），攪拌使其充分溶解；然後在60~80℃、ph為8.0~9.0條件下反應1~2h；反應結束後，立即放在0℃的水中冷卻以終止反應，反應後的溶液冷凍乾燥，得到所述的果寡糖修飾的抗凍糖肽凍乾粉。
所述的抗凍多肽粉的原料來源於豬皮、牛皮、魚皮或魚鱗。
所述的磷酸鹽緩衝液的ph為7.6~8.0，其中kh2po4為2.6mm，k2po4為32.5mm。
所述的攪拌時間為10~20min；所述冷卻時間為15~30min。
如上所述的製備方法製得的抗凍糖肽的用途，所述的抗凍糖肽用於細胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存。
本發明所提供的技術方案具有如下優勢：
（1）本發明所用的抗凍多肽原料來源於食品源下腳料，具有安全無毒、來源廣泛，價格便宜等優勢；
（2）本發明提供的抗凍糖肽合成方法高效、安全、成本低，易於控制；
（3）本發明合成的抗凍糖肽應用廣泛，可應用於細胞、組織、器官、微生物及冷凍食品的低溫冷凍保存；並且與抗凍多肽相比，其抗凍活性顯著提高；
（4）本發明中的果寡糖是一種具有特殊功能營養和特定功能的食品，能通過改善穩定性、質地、口感、味道等，增加食物的功能性，同時也可以取代糖和脂肪。適合糖尿病患者，而且是刺激雙歧桿菌生長的益菌素。
具體實施措施
以下結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不僅僅限於這些實施例。
實施例1
一種基於果寡糖修飾的抗凍糖肽的製備，按照如下方法進行：
（1）按照抗凍多肽粉（來源於豬皮）和果寡糖之間質量比為1:2.7的比例將抗凍多肽粉和果寡糖混合，然後溶解於ph7.6的磷酸鹽緩衝液（2.6mmkh2po4，32.5mmk2po4）中，溶液最終濃度為10%（w/v），攪拌15min使其充分溶解；
（2）溶解後的抗凍多肽與果寡糖混合液在77℃、ph為8.74條件下反應67min；反應結束後，立即放在冰水（0℃）中冷卻20min，終止反應，反應後的溶液冷凍乾燥，得到抗凍糖肽凍乾粉。
實施例2
一種基於果寡糖修飾的抗凍糖肽的製備，按照如下方法進行：
（1）按照抗凍多肽粉（來源於牛皮）和果寡糖之間質量比為1:1的比例將抗凍多肽粉和果寡糖混合，然後溶解於ph7.8的磷酸鹽緩衝液（2.6mmkh2po4，32.5mmk2po4）中，溶液最終濃度為5%（w/v），攪拌10min使其充分溶解；
（2）溶解後的抗凍多肽與果寡糖混合液在60℃、ph為8.0條件下反應60min；反應結束後，立即放在冰水（0℃）中冷卻15min，終止反應，反應後的溶液冷凍乾燥，得到抗凍糖肽凍乾粉。
實施例3
一種基於果寡糖修飾的抗凍糖肽的製備，按照如下方法進行：
（1）按照抗凍多肽粉（來源於魚皮）和果寡糖之間質量比為1:5的比例將抗凍多肽粉和果寡糖混合，然後溶解於ph8.0的磷酸鹽緩衝液（2.6mmkh2po4，32.5mmk2po4）中，溶液最終濃度為15%（w/v），攪拌20min使其充分溶解；
（2）溶解後的抗凍多肽與果寡糖混合液在80℃、ph為9.0條件下反應120min；反應結束後，立即放在冰水（0℃）中冷卻30min，終止反應，反應後的溶液冷凍乾燥，得到抗凍糖肽凍乾粉。
應用例1本發明抗凍糖肽在微生物冷凍保存中的應用
按照如下方法進行：
試驗處理：a.空白對照（去離子水），b.果寡糖，c.未進行糖基化修飾的抗凍多肽，d.實施例1製備的抗凍糖肽。
試驗方法：
（1）製備種子液：取保存的嗜熱鏈球菌在m17液體培養基中復甦，37℃，180r/min培養一夜，od值約為1.3。
（2）準備實驗菌液：取50μl的種子液在盛有4mlm17液體培養基的試管中培養4h，此時菌液的od值約為1.2。
（3）將實驗菌液用滅菌去離子水稀釋100倍，取100μl的稀釋菌液轉移到2ml的塑料冷凍管中，與900μl的抗凍保護劑混合，渦旋混合器混勻。
（4）取樣品混合液50μl在4ml的m17液體培養基中培養7h，檢測600nm處的od值。取完後的樣品放入-24℃冷凍處理24h後，37℃水浴解凍10min，再次取50μl接種培養測定7h的od值。
此條件下的od值與乳酸菌的相對含量符合如下關係式：
y=0.2152ln(x)+0.0594，r2=0.9972(2-1)
式中y為樣品中活菌的相對含量，x為7h培養菌液的od值。計算出冷凍前後樣品中菌的相對含量c0和c後，菌的存活率用公式（2-2）計算：
(2-2)
c0，冷凍前樣品中菌的相對含量（%）；c，冷凍24小時後樣品中菌的相對含量（%）。計算冷凍處理樣品的菌存活率，來檢測添加劑的抗凍活性。
結果見表1，果寡糖（處理b）和抗凍多肽（處理c）對嗜熱鏈球菌均有一定的抗凍保護效果，本發明基於果寡糖修飾的抗凍糖肽修飾物（處理d）的冷凍存活率高達95.7%，顯著高於單一的果寡糖（51.2%）和抗凍多肽（66.5%）。說明本發明的基於果寡糖修飾的抗凍糖肽具有很好的抗凍功能，對微生物的冷凍保藏具有很好的低溫保護作用。
表1本發明抗凍糖肽對對微生物冷凍保護對比試驗結果
應用例2本發明抗凍糖肽在豬卵母細胞冷凍保存中的應用
豬卵母細胞冷凍保護劑基本配方，每100份中含：葡萄糖3份、檸檬酸鈉1份、青黴素8萬單位。
試驗處理：在實施實例4中的豬卵母細胞冷凍保護劑基本配方上，分別添加去離子水、果寡糖、抗凍多肽、實施例1製備的抗凍糖肽，將其相應命名為保護劑a、b、c、d，以保護劑a為對照組。
試驗方法：
（1）裝管：從廢棄的豬卵巢中獲取卵母細胞，洗淨，移入裝有冷凍保護劑的凍存管中平衡15min。
（2）凍存：將平衡後裝有卵母細胞的凍存管放入冷凍降溫盒中（降溫速率2℃/min），降溫至-80℃後放入液氮罐中保存。
（3）結果鑑定：解凍後進行培養，計算存活率，結果見表2。
表2本發明抗凍糖肽對卵母細胞冷凍保護對比試驗結果
從表2可以看出，本發明的基於果寡糖修飾的抗凍糖肽具有很好的抗凍功能，對卵母細胞的超低溫保藏具有很好的保護作用。
應用例3本發明抗凍糖肽在冷凍土豆麵團製品中的應用
一種耐低溫冷藏的冷凍土豆麵團所用的原料及配方如下：中筋麵粉100份、新鮮土豆120份、高活性乾酵母2份、實施例1製備的抗凍糖肽4份、蒸餾水80份。
試驗方法：
(1)土豆泥製備：將新鮮土豆洗淨瀝乾，按比例稱取瀝乾的土豆，放入高溫蒸汽鍋中蒸煮30min,去皮，放入組織搗碎機中搗成土豆泥，冷卻至室溫備用；
(2)酵母活化：稱取所需乾酵母粉於37℃蒸餾水中活化20min；
(3)麵團調製：將實施例1製備的抗凍糖肽按所需比例添加到活化處理後的酵母液中溶解，再將土豆泥及麵粉一同倒入和面機中充分攪拌，揉面至麵團表面光滑不黏手；
(4)分割：將揉好的麵團分割成劑量為20g左右的麵團坯子；
(5)整形：將麵團坯子搓圓用保鮮膜包裹；
(6)速凍：將包裹好的麵團坯子置於-80℃冰箱速凍60min；
(7)凍藏：將速凍後的麵團坯置於-20℃冰箱中凍藏；
(8)解凍：將冷凍麵團置於溫度為35℃，相對溼度為85%的恆溫箱中解凍30min；
(9)一次發酵：解凍好的麵團置於溫度為37℃，相對溼度為85%的恆溫箱中發酵100min；
(10)揉面：將一次發酵好的麵團用壓面機壓10遍；
(11)整形：將壓好的面整成所需的饅頭形狀；
(12)二次發酵：整好型後的麵團置於溫度為37℃，相對溼度為85%的恆溫箱中醒發30min；
(13)蒸製：將發酵好的饅頭坯子置於蒸籠中大火蒸煮30min；等待5min後開鍋取出。
添加本發明抗凍糖肽的冷凍麵團製作饅頭所需醒發時間短，蒸製而得的饅頭比容大，饅頭心部呈海綿狀，口感細膩有彈性，與用新鮮麵團製作的饅頭品質相近。
應用例4本發明抗凍糖肽在冷凍魚糜製品中的應用
一種耐低溫冷藏的冷凍魚糜製品所用的原料及配方如下：魚漿60份、大豆分離蛋白、實施例1製備的抗凍糖肽5份、明膠30份、豬脊膘20份、澱粉8份、大蒜0.4份、味琳1.5份、白糖3份、食用鹽3份、味精0.3份，餘量為冰水。
試驗方法：
（1）解凍：將魚漿解凍至可斬碎，但中心部位仍有部分碎冰為宜的半解凍狀態；
（2）斬拌：將解凍後的魚漿與豬脊膘、大蒜、味琳、白糖、食用鹽、味精和冰水在斬拌機中斬拌，期間待料溫達到15℃以上添加澱粉，繼續斬拌，出漿溫度為20℃；
（3）將大豆分離蛋白打成乳液狀後，與實施例1製備的抗凍糖肽一同加入斬拌機內，中速斬拌均勻；
（4）成型：所述成型採用的成型模具，包括機座，所述機座上設有魚糜螺旋進料機構，料槽道上方均設有轉動的推料撥板、壓輥及熱接合裝置的上下部熱接合輥，所述引導部設置在框架的一側，將通過壓輥機將魚糜壓成片狀，再經過捆束機將魚糜片捲成櫻花狀。
（5）蒸煮：先低溫水煮：將成型後的生魚丸製品送入低溫水煮機內進行低溫水煮，水煮溫度為40℃，水煮時間為15min；接著高溫水煮：將低溫水煮後的魚丸製品送入高溫水煮機內進行高溫水煮，水煮溫度為95℃，水煮時間為4min；最後將高溫水煮後的魚丸製品送入高溫蒸煮機內進行高溫蒸煮，蒸煮溫度為121℃，蒸煮時間為15min。
（6）冷卻：所述冷卻的工藝如下：將高溫蒸煮後的魚丸製品送入冷卻機上，使魚丸製品的溫度降低至室溫。
（7）速凍：所述速凍的工藝如下：將冷卻後的魚丸製品送入速凍機內，速凍機庫溫低於-30℃，凍結完成後魚丸製品中心溫度低於-18℃。
（8）包裝：對檢驗合格的產品進行包裝，包裝好的產品經過金屬探測器的檢測產品中是否混有金屬物質；
（9）入庫：將裝箱合格的產品放在-18℃以下的冷藏庫冷藏。
在冷凍魚糜製品中添加本發明抗凍糖肽能有效抑制由於凍藏引發的品質略變、凝膠性能降低、風味不佳等問題；抗凍糖肽能改善肉製品品質，同時使魚糜製品營養更豐富，更受消費者青睞。
以上所述僅為本發明的較佳實施實例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。