新的鑑定刺激stf－1在胰島細胞內表達的化合物的方法

2023-04-26 01:12:46 1

專利名稱：新的鑑定刺激stf－1在胰島細胞內表達的化合物的方法
技術領域：
本發明主要涉及生物化學內分泌學、分子生物學和蛋白質化學。更具體地說，本發明涉及鑑定刺激胰島細胞內STF-1表達的化合物的新方法。
背景技術：
血液中葡萄糖平衡需要許多神經內分泌系統的協同作用。胰島被認為是哺乳動物體內主要的「葡萄糖傳感器」。胰島包含4種細胞群，經鑑定主要是產生胰島素、胰高血糖素、抑生長素或胰腺多肽的細胞。其中以產生胰島素的b細胞為主。血清葡萄糖的升高會刺激胰島素的分泌和產生，由此指令特定組織吸收葡萄糖。因此，b細胞的功能紊亂或損傷會導致血清葡萄糖水平升高，最終發展成為糖尿病。
遺傳連鎖分析顯示，遺傳因素極大地影響著糖尿病的易患性。例如，至少有18個基因座在一定程度上與胰島素依賴型糖尿病(IDDM)連鎖。被稱為IDDM2的一種疾病易患基因座包含了人胰島素基因，並被與胰島素啟動子的轉錄調控功能的改變相關聯。因此，胰島素基因表達的調控過程受到幹擾在一定程度上造成了糖尿病的發生。與該假設一致的是，β細胞功能受損是糖尿病非常常見的特徵之非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的發生被認為是外部影響和複雜的遺傳影響的共同結果。重要的是，人們已經將胰島素基因座本身的等位變異體與糖尿病相關聯。這些變異體似乎包含有正常的胰島素基因，但是表現出轉錄調控方面的特性被改變。
據估計，約有20,000,000之多的美國人患有非胰島素依賴型(Ⅱ型)糖尿病。疾病的發展似乎需要環境因素和某些目前還沒有完全確定的糖尿病易患性基因的共同作用，它們可能造成Ⅱ型糖尿病外周抗胰島素性，此時，組織不能應答胰島素信號來合理使用葡萄糖。或者，遺傳因素可能造成這些患者體內產生胰島素的胰腺β細胞對葡萄糖敏感性降低。以上兩種生理狀態的最終結果都是嚴重的高血糖症，這是糖尿病的主要特徵。
對胰島素基因的轉錄調控是利用與細胞特異性葡萄糖敏感信號傳導分子相作用的一小段側翼DNA獲得的。對該調控機構的確切性質還知之甚少，但一般認為，鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)和含同源域的因子是指導胰島素的β細胞特異性表達的轉錄機制中的關鍵。胰島特異性鹼性螺旋-環-螺旋複合物與近端的E框(E-box)相互作用，後者又稱Nir,IEB1或ICE；該元件在大鼠胰島素Ⅰ基因中有兩份，但在大鼠胰島素Ⅱ基因和人胰島素基因中只有一份。
產胰島素細胞系內進行的瞬時試驗表明，E框結合因子與結合附近被稱為FLAT的AT豐富序列的β細胞特異性蛋白具有協同作用，所述的序列具有特徵性的同源域識別序列。數個已鑑定出的同源域蛋白已經被證明與FLAT元件結合，其中包括Isl-1、Imx-1、cdx-3和STF-1。此外，後者與在被稱為P元件的進化保守AT豐富序列處的主結合活性有關。Isl-l與FLAT元件弱結合而且似乎不存在於用產胰島素細胞提取物檢測到的FLAT結合複合體中。目前的證據證明Isl-1更重要的作用在於神經發育方面。同源域因子Imx-1和cdx-3在異源細胞內具有重要的與胰島素啟動子功能有關的交叉活化特性，但是對於它們的細胞分布以及在β細胞內的FLAT結合能力仍然不清楚。而且，直接涉及這些因子在β細胞系內的功能的信息很少。
在具有結合胰島素啟動子活性的因子中，STF-1可能是真正的胰島素啟動子功能調控者的最有希望的候選因子。在小鼠中，STF-1最早是在胚胎期第8.5天在形成胰腺的原細胞的細胞核中檢測到的，隨後立即在該區域內最早檢測到了胰島素的表達。在隨後的胰內分泌腺的整個發育過程中，STF-1和胰島素大量地被共表達的。此外，在來自產胰島素細胞系的提取物中，STF-1似乎是胰島素啟動子內FLAT和P元件處內源性DNA結合活性的一部分。和根據FLAT結合因子所在的預計一樣，STF-1也與E框結合因子Pan-1具有強協同作用。但是，DNA結合分析顯示，β細胞提取物中的其它未知因子對於測得的FLAT結合活性也有很大的貢獻。人們至今仍然不清楚由FLAT介導的胰島素啟動活性需要全部這些被測得的因子還是只需要其中一部分。
雖然STF-1最早是同時在發育中的胰腺的外分泌細胞和內分泌細胞中表達的，但是STF-1的產生逐漸地局限於產生胰島素和抑生長素的胰島細胞。在這些細胞中，STF-1的作用似乎對於保持抑生長素和胰島素基因的高水平表達至關重要。
STF-1識別胰島素啟動子上兩個已經完全確定了的胰島特異性元件，即FLAT和P。當STF-1與這些位置結合時，它與E47一起刺激胰島素的轉錄，後者是識別被稱為Far和Nir的兩個E框的螺旋-環-螺旋蛋白。同樣，STF-1通過被稱為TSEⅠ和TSEⅡ的兩個胰島特異性元件調控胰島細胞內抑生長素的表達。
已發現同源域蛋白如STF-1，通過確立細胞或細胞成份身份而在發育中起著重要作用。與它們在體內的特異性和區別性作用相反，大多數同源域蛋白在體外表現出很低的並且重迭的DNA結合特異性。但是，最近的研究暗示特定的蛋白質輔因子決定了體內同源域DNA結合的特異性。例如在果蠅中，人們發現外小齒(extradenticle)(exd)減弱同源異型蛋白的活性卻不改變它們的表達方式。更確切的說，外小齒似乎通過加強特定同源域蛋白的DNA結合特異性來促進靶基因的選擇。實際上，在脊椎動物中，外小齒是高度保守的，與人原癌基因Pbx1具有廣泛的序列相似形(71％)。
發育過程中細胞的譜系特異性的定型主要是由許多同源域(HOX)選擇蛋白的相對性表達決定的，所述的蛋白介導不同基因程序的活化作用。但是各HOX基因如何自身定向以便在不同的細胞類型中得以表達的機制還遠沒有被揭示過。
脊椎動物的胰腺由內分泌腺和外分泌腺構成，兩者都來自十二指腸原基內共同的祖細胞(1)。在胰腺的內分泌部分，最早表達多種胰島激素的多能前體細胞逐步受到限制直至形成構成郎氏成熟胰島的4個細胞亞群產生胰島素、抑生長素、胰高血糖素和胰多肽的細胞(2,3)。這些發育路徑的活化機制還不清楚，但是目前的證據暗示同源異型框因子STF-1(IPF-1/IDX-1)是該過程中的一個主要決定因素。實際上，發育過程需要STF-1得到了同源重組研究的支持，在該研究中，針對性地幹擾STF-1/IPF-1基因造成胰腺的先天性缺失(4)。
STF-1(又稱Pdx1)的表達最早可以在胚胎期第8.5天的胰腺原基和多能前體細胞中檢測到。STF-1同時在發育中的胰腺的內分泌和外分泌部分瞬時表達後逐漸被限制在產生胰島素和抑生長素的胰島細胞內表達(5,6)。在這些細胞內，STF-1通過與胰島素和抑生長素基因各自啟動子內的功能元件結合調控它們的表達(5,7-16)。
現有技術缺乏調控同源域蛋白STF-1在胰腺細胞內表達的有效手段。本發明滿足了本領域長期以來的這一需求。
發明概述雖然STF-1是胰腺基因的一種主要調節物，但是STF-1的表達如何自身定向於胰腺細胞的機制還不清楚。本發明證明，STF-1啟動子的一段6.5kb片段足以指導β-半乳糖苷酶報導基因在轉基因小鼠和培養十二指腸細胞內的胰島特異性表達。在該6.5kb的片段內，位於相對於主轉錄起始位點的-140位的一個E框對STF-1啟動子活性尤其重要。該元件被STF-1胰島特異性表達所必需的上遊激活劑識別。實際上，該STF-1啟動子使在胰島細胞內STF-1定向表達的活性增加20至100倍。缺失位於-104位的近端的E框使得STF-1在HIT細胞內完全不表達。而且，抗-USF(上遊因子)抗血清抑制C1、C2和C3的形成，這表明這些蛋白質是由USF蛋白質形成的。
而且，還在轉錄起始位置上遊600bp的一段530bp區域內發現了一個STF-1增強子元件。包含該530bp片段的啟動子結構物受地塞米松處理的完全抑制，但是包含遍在USF-1識別位置的基本STF-1啟動子結構物卻不受抑制。該530bp區域在HIT-T15細胞內的活性比在COS-7細胞內的高5至10倍，這表明該片段具有胰島細胞特異性活性。所以，在本發明中STF-1-lacZ融合基因被用於篩選能夠增強胰島細胞內STF-1表達的化合物。刺激STF-1產生的化合物可加強胰島B細胞的功能，即胰島素的產生。所以，利用本發明描述的方法鑑定出的化合物對於因邊緣胰島細胞功能造成不耐糖的Ⅱ型糖尿病患者尤其有用。
本發明實施方式之一提供了一種檢測誘導STF-1轉錄的化合物的方法。
用磷酸鈣共沉澱法分離出表達STF-1/lacZ融合基因的胰島細胞系。為了檢查各種化合物對STF-1表達的作用，目標化合物被加入表達STF-1/lacZ融合基因的細胞中。然後利用比色分析定量檢測對照和經處理細胞內的lacZ活性。利用此方法，可以篩選大量的化合物並方便地鑑定出STF-1誘導性化合物。
本發明實施方式之二提供了一種利用STF-1體內標記產胰島素的胰島細胞的方法。其中，綠螢光蛋白(GFP)被用作指示物。如Ogawa等在美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)1995,92:11 899-11903中所述，可以在不幹擾細胞的情況下測得綠螢光蛋白的表達。為了便於從動物的胰腺回收β細胞，STF-1啟動子被與編碼GFP的基因融合。給豬引入STF-1-綠螢光蛋白轉基因能夠迅速高效地從胰腺中回收產胰島素的細胞。簡而言之，回收豬的胰腺，然後用膠原酶處理來分散細胞。利用基於STF-1綠螢光蛋白轉基因的表達的螢光激活細胞分類術(FACS)有效地回收得到產胰島素的胰島細胞。純化的β細胞群可以被用於對糖尿病患者的細胞療法。
本發明的內容之一提供了一種測定待測化合物刺激胰島細胞誘導STF-1轉錄的能力的方法，它包括以下步驟提供包含STF-1增強子(具有選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或它們的片段的序列)、啟動子和同時受所述STF-1增強子和所述啟動子轉錄調控的報導基因的載體，所述的表達基因能夠使所述的宿主細胞具有一個可檢測的信號；將所述的載體轉移到所述的宿主細胞內；在待測化合物存在下培養所述的宿主細胞來測定所述待測物質刺激所述宿主細胞產生所述的可檢測信號的能力；分析所述的信號來測定所述待測化合物刺激所述宿主細胞產生所述信號的能力，其中所述信號的存在表示所述待測化合物刺激胰島細胞誘導了STF-1的轉錄，沒有所述信號則表示所述待測化合物沒有刺激誘導細胞誘導STF-1的轉錄。
在本發明以此為目的的優選實施方式中，使用的報導基因是一種酶。在更好的實施方式中，該酶選自螢光素酶和β-半乳糖苷酶。
在本發明的另一實施方式中，所述的轉移步驟是利用用轉染或微注射法將轉基因導入動物。
本發明的另一目標中提供了體內標記產胰島素胰島細胞的方法，步驟是它包括提供包含STF-1啟動子和受所述STF-1啟動子轉錄調控的報導基因的載體，其中所述的報導基因能夠使胰島細胞具有一個可檢測的信號；將所述的載體作為轉基因引入動物胚胎；將所述的胚胎培育成具有胰島細胞的動物體；分析所述的可檢測信號來測定所述動物的胰島細胞是否表達所述的報導基因，其中信號的存在表示有產胰島素胰島細胞存在，而沒有信號則表示沒有產胰島素的胰島細胞。
在本發明以此為目的的優選實施方式中，報導基因產生螢光蛋白，而且該方法還包括一步利用螢光激活細胞分類術(FACS)將產胰島素胰島細胞與非產胰島素胰島細胞分選開來。
通過對本發明優選實施方式的說明，本發明的其它內容、特徵和優點將更為清楚。
附圖概述為了更詳細的理解本發明的上述特徵、優點和目的是如何獲得的，以下將結合附圖中表示的特定優選實施方式更具體的說明以上概括的本發明內容。這些附圖屬於說明書的一部分。但是必需指出，


的只是本發明的優選實施方式，所以不能理解成對本發明的範圍構成限定。
圖1顯示STF-1在染色體上的位置。圖1A顯示STF-1基因是由鼠5號染色體遠端區域內一同源異型框孤獨基因編碼的，該圖中顯示了STF-1(被稱為「Pdx1」)在5號染色體上相對於其它標記的位置。右邊顯示的是釐摩標度。左欄所示的是染色體排布所使用的標記。STF-1在此稱為Pdx1。
圖2顯示STF-1沒有TATA，使用多轉錄起始位置。圖2A顯示了15kb的STF-1基因組克隆的圖示，同時在上方給出kb標尺。所示的有6.5kb的5(側翼區4kb的內含子和3kb的3(側翼。IVS表示將外顯子Ⅰ(被打上了陰影並以Ⅰ表示)和Ⅱ(被打上了陰影並以Ⅱ表示)打斷的4kb內含子。圖2B顯示STF-1基因5』側翼區的核苷酸序列。利用RNase保護法(實心箭頭)和引物的延伸(空心箭頭)製圖測得的轉錄起始位置在物理圖譜中以S1(主起始位置，以黑體表示)、S2和S3表示。bHLH/bHLH-ZIP(E框)、CTP/NF-1(CAAT)和C/EBP的潛在上遊因子結合位置被加以下劃線並標識了相對於主起始位置的位置。圖2C顯示的是利用反義STF-1RNA探針進行的Tu6 RNA(Tu6，泳道2)或對照酵母tRNA(酵母，泳道3)的RNase保護試驗。左側顯示未被消化的探針(泳道1)。圖2D用反義STF-1 RNA引物對酵母(泳道4)、Tu6 mRNA(泳道5)或RIN mRNA(泳道6)進行的引物延伸分析結果。右側顯示測序梯(GATC，泳道7至10)。RNase保護產物和引物延伸產物之間的對應性是明顯的，還顯示了前三個起始位置S1、S2和S3(見圖2B底部)。
圖3顯示的是STF-1啟動子的6.5kb片段使得β-半乳糖苷酶報導基因的表達定向於轉基因小鼠的胰島細胞。用Xga1作為生色底物對轉基因(上方)和對照(下方)同窩生子的成年胰腺的代表性低溫切片進行了lacZ活性評定。箭頭所指為胰島細胞。
圖4顯示，STF-1啟動子內的遠端和近端元件使得STF-1的表達定向於胰島細胞。圖4A顯示與轉染到非胰島細胞(PC12,COS,HeLa)內相比，轉染到胰島細胞(βTC3,HIT)內後-6500 STF-1螢光素酶報導質粒的活性。一代表性的試驗顯示了在以共轉染的RSV-CAT對照質粒歸一化後，STF-1啟動子相對於在其它細胞系內的在HIT細胞內的活性(100％)。圖4B顯示STF-1螢光素酶啟動子結構物(STFluc)在轉染到HIT細胞內後的代表性試驗。結構物根據相對於主轉錄起始位點(S1，見圖2A和2B)的其5』啟動子邊界來命名。圖中顯示的是細胞核因子的潛在結合位點；主轉錄起始位點以實心箭頭表示。星號表示在遠側3kb內的未確定的結合活性。對每個結構物來說，在以RSV-CAT作為內部對照就轉染效率進行了歸一化後，相對-6500STF Luc(100％)計算其活性。試驗至少重複4次。
圖5顯示STF-1啟動子內的近端E框結合上遊因子USF。圖5A顯示用32P標記的-182至-37(145鹼基對(bp))的STF-1啟動子片段進行的DNaseⅠ保護試驗的結果。放射自顯影圖顯示不加提取物(泳道1和4)、加HIT或Hela細胞核提取物(分別為泳道2和3)或加重組USF-1(泳道5)時的消化圖譜。
圖5B顯示的是與以32P標記的包含STF-1E框(-118/-95)(泳道1)的雙鏈寡核苷酸一起孵育的HIT細胞核提取物的電泳遷移率變化試驗。如下所述在結合反應中加入非標記的競爭寡核苷酸(摩爾數過量50倍)STFE是野生型STF-1E框寡核苷酸；STF-E MUT表示在E框內的-106(C/A)和-102(T/G)處有替換的突變STF-E寡核苷酸；Ins-1(P)是來自胰島素Ⅰ啟動子的P元件；Gal4表示GAL4識別位置。
左側的圖5C顯示以STF-E框為探針(泳道1)進行的HIT細胞核提取物的凝膠遷移試驗的結果。如圖所述在反應中加入USF或TFE-3抗體(泳道2和3)。複合物C1、C2和C3被標記了出來。右側的圖5C顯示的是以STF-E探針進行的HIT提取物(泳道1至3)的凝膠遷移試驗的結果。圖中顯示了在結合反應中加入USF-1和USF-2特異性抗血清。
圖6顯示，USF與-104E框的結合對於STF-1啟動子的活性十分重要。圖6A顯示E框突變對於USF結合活性的影響。用野生型(E-WT)或突變(E-MUT)STF-1E框探針進行的HIT細胞核提取物的凝膠遷移試驗結果，同時在下方顯示了野生型和突變探針從-106至-102的序列。C1-3即複合物C1、C2和C3。圖6B顯示E框突變對STF-1啟動子在HIT細胞內活性的影響。結合圖中顯示了用野生型、突變或缺失(-118/-95)STF-1E框基元轉染的HIT細胞的代表性分析，並結合了6500bp或190bp的STF-1啟動子的試驗結果。顯示的是在以共轉染的RSV-CAT對照質粒就轉染效率歸一化後相對於野生型-6500STF-1 Luc結構物(100％)的報導基因活性。試驗至少重複3次。
圖7證明，糖皮質素通過STF-1基因5(側翼區內的一個胰島特異性增強子抑制STF-1的表達。
圖7A顯示在用地塞米松(10-7M)或對照用乙醇媒質處理HIT-T15 18至24小時後STF-1啟動子的活性。將-6.2/-5.67STF Luc報導基因的活性設定為100％。所有結構物都結合包含120鹼基的5(側翼區(近端側翼區)的STF-1螢光素酶載體(STF-1 Luc)進行評價。插在STF-1 Luc報導基因內的STF-1序列以核苷酸編號表示。例如，-6.5/-6.2STF Luc包含與近端的120鹼基5(側翼區融合的-6500至-6200的STF-1序列。包含激活元件的遠側區以橢圓和方框表示，基本STF-1啟動子以一矩形表示。還顯示了標準誤差立柱。試驗至少重複3次。用共轉染的CMV-(gal對照質粒將STF-1報導基因的活性全部歸一化為轉染效率。
圖7B(上方)顯示的是STF-1報導基因結構物瞬時轉染HIT T15細胞的試驗結果。包含6500鹼基的5(側翼區的-6500STF Luc的活性被設定為100％。各試驗一式兩份，至少重複4次。圖中顯示了標準誤差(下方)。圖中顯示了STF-1螢光素酶報導質粒在瞬時轉染到COS-7細胞內後的活性。啟動子活性被歸一化為CMV-(gal對照活性，以便直接比較HIT細胞內的STF-報導基因活性。
圖7C顯示的是STF-1基因內從-6.2kb至-5.67kb的基本胰島特異性增強子的核苷酸序列。HNF-3和E框結合基元是黑體的並且加有下劃線。
圖8證明，STF-1基因內的胰島特異性增強子包含HNF-3(和BETA-2的結合位置。
圖8A顯示的是用來自大鼠STF-1啟動子-5870至-6100的32P標記的STF-1探針進行的HIT T15胰島細胞、Hela或COS-7細胞的細胞核粗提取物的DNaseⅠ保護試驗結果。NONE；不加提取物的對照反應；HNF-3(；用重組蛋白進行的反應。
圖8B顯示的是來自Hela、HepG2、產胰高血糖素的(TC或產胰島素的HIT或RIN細胞系(如在各泳道上方所示)的細胞核提取物的凝膠遷移率變化試驗結果。試驗是用包含H元件的32P標記的STF-1寡核苷酸探針進行的。下方顯示了野生型(WT)和突變(MT)H元件的核苷酸序列。如泳道上所示，加入了過量100倍的非標記的野生型或突變的競爭DNA。
圖8C顯示的是用32P標記的-5907至-5927的STF-1H元件探針進行的來自HIT胰島瘤(HIT NE)和原代培養的成年大鼠胰島細胞(ISLET NE)的細胞核粗提取物的凝膠遷移率變化試驗。如每根泳道上方所示，在反應中加入了HNF3(，(，或((抗血清。-；沒有加入抗血清。Ⅰ和Ⅱ分別是蛋白質-DNA和抗體超變(supershifted)複合物。
圖8D顯示的是用以32P標記STF-1啟動子內從-5963至-5981的B元件探針進行的來自HIT T15細胞的粗細胞核提取物的凝膠遷移率變化分析結果。在每根泳道上顯示在結合反應中加入了BETA-2、E2A或STF-1抗血清。如圖所示，加入了過量100倍的非標記的野生型(WT:5(-TCAGTGACAGATGGAGTCCT-3或突變的(MT:5(-TCAGTGAAAGACGGAGTCCT-3競爭DNA。泳道7中顯示了來自以BETA-2和E-47cDNA程序化的網織紅細胞裂解物的結合活性。泳道7的最上方是網織紅細胞裂解物原來的位置。
圖9證明，糖皮質素通過抑制HNF-3對胰島特異性增強子的活性而抑制STF-1的表達。
圖9A顯示STF-1報導質粒在HIT T15胰島瘤細胞內的瞬時轉染試驗結果。包含基本胰島特異性增強子(-6200至-5700)的-6.2/-5.7STF Luc結構物的活性被設定為100％。在H元件和B元件內含有點突變的結構物以橢圓或方框內加X表示，這些突變幹擾HNF-3(與BETA2/E2A的結合。點突變與在凝膠遷移變化分析中使用的E框和H元件突變相對應(見圖8)。
圖9B顯示在對照(-)和地塞米松處理(+)的HIT-IT15細胞內HNF-3(過量表達對野生型(陰影立柱)和H元件突變(空白立柱)的STF-1報導基因活性的影響。以含有基本胰島特異性增強子(-6200至-5700)的-6.2/-5.7STF Luc結構物在對照細胞內的活性為100％。圖中顯示了標準誤差立柱。實驗至少重複4次。
圖9C顯示提高HNF-3(效應質粒的水平對野生型STF-1(-6500STF-1 LUC)報導質粒在HIT-IT15細胞內活性的影響。在各立柱下標明了HNF-3(效應質粒的量，以(g為單位。利用空載CMV表達載體進行補足以保持效應質粒的總量在各試驗中保持不變。圖中標明了對照(ETOH)和地塞米松(DEX)處理的細胞。
詳細說明本發明證明，在胰腺的形態發生和體內葡萄糖穩定中起作用的一種同源域蛋白STF-1是由位於鼠5號染色體上的一「孤單」同源異型框基因編碼的。當來自STF-1基因的一段6.5kb的5』側區基因組片段與β-半乳糖苷酶報導基因融合時，它在轉基因小鼠內表現出胰島特異性活性。STF-1啟動子內兩個獨特的元件為胰島限制性表達所必需位於-3至-6.5kb之間的遠端增強子序列和位於-104處的近端E框序列，後者主要被由鹼性螺旋環螺旋(bHLH)/亮氨酸拉鏈(ZIP)細胞核因子USF識別。由於-104E框內的點突變幹擾USF的結合從而降低了STF-1啟動子的活性，所以，本發明證明，USF是將STF-1表達定向於胰島細胞的調控機構中的重要組成部分。而且，我們還發現，糖皮質素強效抑制STF-1的表達，這是通過抑制識別兩個內胚層因子HNF-3(和BETA2/E47的遠端胰島特異性增強子的活性。由此，抑制HNF-3(或BETA2/E47結合的增強子內的突變將幹擾STF-1啟動子的活性。-HNF-3(表達載體恢復經糖皮質素處理的細胞內STF-1增強子活性的能力證明，HNF-3(的確是STF-1表達中重要的調節物。
本發明目的之一是提供測試誘導STF-1轉錄的化合物的方法。用磷酸鈣共沉澱法來分離表達STF-1/lacz融合基因的胰島細胞系。為了檢測各種化合物對STF-1表達的作用，目標化合物被加入到STF-1/lacZ表達細胞中。用比色試驗定量檢測對照和經處理細胞內的LacZ活性。利用此方法，可以對大量的化合物進行篩選並方便地鑑定出STF-1誘導性化合物。
本發明的另一目的是提供用STF-1啟動子體內標記產胰島素的胰島細胞的方法。此處，綠螢光蛋白(GFP)被用作目測指示物。如Ogawa等在美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)1995,92:11899-11903中所述，可以在不幹擾細胞的情況下測得綠螢光蛋白的表達。為了便於從動物的胰腺回收β細胞，將STF-1啟動子與編碼GFP的基因融合。給豬引入STF-1-綠螢光蛋白轉基因能夠迅速高效地從胰腺中回收產胰島素的細胞。簡而言之，回收豬的胰腺，然後用膠原酶處理來分散細胞。利用基於STF-1綠螢光蛋白轉基因的表達的螢光激活細胞分類術(FACS)能夠有效地回收得到產胰島素的胰島細胞。純化的β細胞群可以被用於對糖尿病患者的細胞療法。
本發明的內容之一提供了一種測定待測化合物刺激胰島細胞誘導STF-1轉錄的能力的方法，它包括以下步驟提供包含STF-1增強子(具有選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或它們的片段的序列)、啟動子和同時受所述STF-1增強子和所述啟動子轉錄調控的報導基因的載體，所述的報導基因能夠使所述的宿主細胞具有可檢測的信號；將所述的載體轉移到所述的宿主細胞內；在待測化合物存在下培養所述的宿主細胞來測定所述待測物質刺激所述宿主細胞產生所述的可檢測信號的能力；分析所述的信號，測定所述待測化合物刺激所述宿主細胞產生所述信號的能力，其中所述信號的存在表示所述待測化合物刺激胰島細胞誘導了STF-1的轉錄，沒有所述信號則表示所述待測化合物沒有刺激胰島細胞誘導STF-1的轉錄。
在本發明以此為目的的優選實施方式中，使用的報導基因是一種酶。在更好的實施方式中，該酶選自螢光素酶和β-半乳糖苷酶。
在本發明的另一實施方式中，所述的轉移步驟是利用將轉基因導入動物的轉染或微注射法。
本發明的另一目的提供了體內標記產胰島素的胰島細胞的方法，它包括提供包含STF-1啟動子和受所述STF-1啟動子轉錄調控的報導基因的載體，其中所述的報導基因能夠使胰島細胞具有一個可檢測的信號；將所述的載體作為轉基因引入動物胚胎；將所述的胚胎培育成具有胰島細胞的動物體；分析所述的可檢測信號來測定所述動物的胰島細胞是否表達所述的報導基因，其中信號的存在表示有產胰島素的胰島細胞存在，而沒有信號則表示沒有產胰島素的胰島細胞。
在本發明以此為目的的優選實施方式中，報導基因產生螢光蛋白，而且還包括一步利用螢光激活細胞合類術(FACS)將產胰島素胰島細胞與非產胰島素胰島細胞分選開來。
人基因組含有4個基因簇，被稱為Hox或同源異型選擇者基因，它們是胚胎發生過程中中軸體圖式形成(axial body pattern formation)的關鍵決定子(Krumlauf,1994，細胞(Cell)78:191-201)。4個基因簇各含13個基因，一個基因簇內的一個特定基因通常與另三族中的成員之一具有特別高的同源性。這樣的相關基因被稱為共生同源基因；因此，HoxA1、HoxB1、HoxC1和HoxD1都是密切相關的共生同源基因，各自位於不同染色體的不同Hox基因簇內。HoxB複合物在17號染色體的長臂上，例如，已經鑑定出了HoxB1至HoxB9。
胰島素基因的葡萄糖依賴性調節作用似乎是與葡萄糖介導的胰島素分泌增加相伴發生的。部分原因可能是細胞內鈣的增加。此外，葡萄糖應答性胰島素啟動子的功能可能至少在一定程度上通過FLAT結合蛋白的活性來調節。HoxBl3以高親和性和功能上十分重要的胰島素啟動子的FLAT元件結合。此外，HoxBl3和胰島素ICE/Nir元件-結合因子Pan-1在一同加入時強效活化胰島素啟動子。這與以下發現是一致的，即FLAT和Nir元件在產胰島素細胞內以協同方式發揮作用。總之，以上信息表明，鈣依賴性信號發生路徑可能調控著HoxB13的功能。
本發明可能用到本領域內常規的分子生物學、微生物學和重組DNA技術。在文獻中對這些技術有祥盡的說明。可參見例如Maniatis,Fritsch Sambrook「分子克隆實驗室手冊(1982)」(「Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)」)；「DNA克隆實踐方法」(「DNA Cloning:A Practical Approach」)第Ⅰ卷和第Ⅱ卷(D.N.Glover編輯，1985)；「寡核苷酸合成法」(「OligonucleotideSynthesis」)(M.J.Gait編輯，1984)；「核酸雜交」(「Nucleic AcidHybridization」)(B.D.Hames S.J.Higgins編輯，1985)；「轉錄和翻譯」(「Transcription and Translation」)(B.D.Hames S.J.Higgins編輯，1984)；「動物細胞培養」(「Animal Cell Culture」)(R.I.Freshney編輯，1986)；「固定化細胞和酶」(「Immobilized Cells and Enzymes」)(IRL出版社，1986)；B.Perbal，「分子克隆的實踐指導」(「A Practical Guide To Molecular Cloning」)1984。
所以，本文中出現的下列術語具有以下定義。
「載體」指質粒、噬菌體或粘粒之類的複製子，在上面可以連接其它DNA片段，從而使連接上去的片段得以複製。
「DNA分子」指單鏈或雙鏈螺旋形式的多聚脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)。它只涉及分子的初級和次級結構，不限定任何一種三級形式。所以，它包括除了線性DNA分子(例如限制性片段)內之外，病毒、質粒和染色體內的雙鏈DNA。本文在論述結構時，按照常規只給出從5』至3』端的非轉錄DNA序列(即序列與mRNA一樣的鏈)。
「複製起始點」指參與DNA合成的那些DNA序列。
DNA「編碼序列」是處於正確的調控序列調控下時在體內被轉錄並翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由位於5』(氨基)末端的起始密碼子和位於3』(羧基)末端的翻譯中止密碼子確定。編碼序列可以包括但不限於原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核(例如哺乳動物的)DNA的基因組DNA和合成DNA序列。聚腺苷酸化信號和轉錄中止信號通常位於編碼區的3』末端。
轉錄調控序列和翻譯調控序列是DNA調控序列，例如啟動子、增強子、聚腺苷酸化信號、終止子等，它們為編碼序列在宿主細胞的表達所需。
「啟動子序列」是能夠在細胞內結合RNA聚合酶並引發下遊(3』方向)編碼序列的轉錄的DNA調控區。為了定義本發明，啟動子序列在其3』末端以轉錄起始位置為界，向上遊(5』方向)延伸，直至將引發高於背景的可測水平的轉錄所需的最小數量的鹼基或元件包含在內。在啟動子序列內有轉錄起始位置(一般用核酸酶S1通過物理圖譜來確定)，以及負責結合RNA聚合酶的蛋白質結合域(共有序列)。真核啟動子常常但不總是包含「TATA」框和「CAT」框。原核啟動子除了-10和-35共有序列之外還包含Shine-Dalgarno序列。
「表達調控序列」是控制和調節其它DNA序列的轉錄和翻譯的DNA序列。當RNA聚合物酶將編碼序列轉錄成mRNA，後者再被翻譯成由編碼序列編碼的蛋白質時，編碼序列即「受到轉錄和翻譯調控序列的調控」。
「信號序列」可以被包含在編碼序列之前。該序列編碼一段位於多肽的N末端的信號肽，它與宿主細胞進行交流，將多肽導向細胞的表面，或者將多肽分泌到介質中，而且，該信號肽在蛋白質離開細胞之前被宿主細胞切除。信號肽被發現與許多原核和真核生物特有的蛋白質相關聯。
「寡核苷酸」，例如在指本發明的探針時，其定義為包含兩個或兩個以上核糖核苷酸的分子，最好有8個以上。其確切大小取決於許多因素，這些因素又取決於寡核苷酸的最終功能和用途。
「引物」在此指以天然形式存在(象在純化的限制性消化產物中那樣)或者以合成法生成的這樣一段寡核苷酸，它在處於誘導引物延伸產物合成的條件下時，能夠作為合成起始位點，所述的引物延伸產物是與一段核酸鏈互補的，所述的條件即在核苷酸和例如DNA聚合酶的誘導劑的存在下並且處於合適的溫度和pH下。引物即可以是單鏈也可以是雙鏈，但是必須足夠長，以便在誘導劑的存在下引發所需的延伸產物的合成。引物的確切長度取決於許多因素，其中包括溫度、引物來源和所用的方法。例如，對於診斷用途來說，根據目標序列的複雜性，寡核苷酸引物一般包含15至25個或更多個核苷酸，雖然它也可能包含少於上述數量的核苷酸。
本文中的引物經選擇與不同的目標DNA序列鏈「基本上」互補。這意味著引物必須具有足夠的互補性來與它們對應的鏈雜交。所以，引物序列不必反映出模板的確切序列。例如，非互補性核苷酸片段可以連接在引物的5』末端，而引物的其餘序列與模板鏈是互補的。或者，非互補性鹼基或更長的序列可以插在引物中間，只要引物序列與模板序列具有足夠的互補性或者與它雜交，並由此形成合成延伸產物所需的模板。
「限制性內切酶」和「限制性酶」都指細菌酶，都在或接近一段特定核苷酸序列處切斷雙鏈DNA。
當外源或異源DNA被引入到細胞內部後，則細胞被所述的DNA「轉化」。轉化DNA可能也可能不被整合(共價連接)到細胞的基因組內。在例如原核細胞、酵母和哺乳動物細胞內，轉化DNA可能保持在例如質粒的游離元件上。就真核生物而言，穩定轉化的細胞是指轉化DNA整合到染色體內從而通過染色體複製被子代細胞繼承的細胞。真核細胞能夠建立由包含轉化DNA的子代細胞群構成的細胞系或克隆證明了這種穩定性。「克隆」是由單個細胞或共同的祖先通過有絲分裂得到的一群細胞。「細胞系」是能夠在體外穩定繁殖許多代的原代細胞的克隆。
當確定長度的DNA序列上有至少約75％的核苷酸相互匹配(至少約80％更好，至少約90或95％則最好)，則兩段DNA序列「基本同源」。基本同源的序列可以利用可在序列信息庫中獲得的標準軟體通過序列比較來鑑定，或者在就具體系統而言的嚴謹條件下的Southern雜交實驗來鑑定。確定合適的雜交條件是本領域的常規技術。參見例如Maniatis等，見上文；DNA克隆，第Ⅰ和第Ⅱ卷，見上文；核酸雜交，見上文。
DNA結構物的「異源」區是一段大DNA分子內的一段可鑑定DNA片段，後者並不天然地與所述的大分子相關聯。所以，當異源區編碼哺乳動物基因時，該基因兩側的DNA通常不是在哺乳動物基因組來源生物內位於該基因組DNA兩側的DNA。在另一實例中，編碼序列是一種結構物，其中的編碼序列本身並不天然存在(例如cDNA，其基因組編碼序列包含內含子，或者是具有不同於天然基因的密碼子的合成序列)。等位變異或天然突變都不產生上述DNA異源區。
此類研究最常用的標記是放射性元素、酶、在接觸紫外光時會發螢光的化學物質等。大量螢光物質是已知的，可以用作標記。其中包括例如螢光素、羅丹明、auramine、Texas紅、AMCA藍和螢光黃。一種特殊的檢測材料是在山羊中製備並與螢光素通過異硫氰酸酯共價結合的的抗兔抗體。
同樣，也可以使用酶標記，而且可以用目前使用的比色法、分光光度法、螢光分光光度法、電流分析法或氣體分析法中的任何一種來檢測。酶通過與碳化二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛等橋連分子反應與選定的粒子共軛。已知有許多酶可以用於此方法。其中較好的是過氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加過氧化物酶以及鹼性磷酸酶。例如，美國專利3,654,090，3,850,752和4,016,043還公開了其它標記材料和方法。
以下實施例是為了說明本發明的各種實施方式，而不是對本發明的限定。
實施例1染色體的製圖使用Jackson Laboratoray的(B6×SPRET)F1×SPRET回交DNA系列，以32P標記的STF-1cDAN片段為探針，進行STR-1基因的染色體製圖。
實施例2轉基因鼠的產生和β-半乳糖苷酶染色。
用標準克隆技術構建在β-半乳糖苷酶報導基因之前包含6500鹼基對(bp)的上遊STR-1序列的融合基因，並將它注入受精卵母細胞的精核中。利用Southern印記法和PCR擴增鑑定出鼠建立者(foundermice)。在20μM的低聚甲醛固定化組織切片上以X-gal為生色底物對轉基因組織中STR-1/β-半乳糖苷酶融合基因的表達進行評價。
實施例3抗體超變(supershift)實驗中使用的無差別STR-1、2抗體是購自Santa CruzBiothchnology。TFE3抗體是K.Jones提供的。特異性識別USF-1或USF-2的抗體是M.Sawadogo提供的。(17,18)實施例4STF-1基因組克隆的分離以32P標記的STF-1cDNA片段作為雜交探針從EMBL3大鼠基因組文庫中分離出STF-1基因。將STF-1陽性基因組片段亞克隆到SKⅡ質粒(Strategene)的EcoRⅠ位置內。
實施例5RNase保護和引物的延伸用Oligotex(dT)30系統(Quiagen)製備聚A+RNA。用於引物延伸分析的寡核苷酸用γ-32P ATP和T4聚核苷酸激酶標記其5』末端。5μg聚A+RNA和末端標記的反義引物一起在80℃孵育5分鐘，然後在42℃孵育16小時。引物延伸反應用AMV逆轉錄酶在37℃進行1小時，產物在5％變性聚丙烯醯胺凝膠上進行分析。用25μg從Tu6細胞中抽提的總RNA進行RNase保護分析(19)。利用一段相對翻譯起始位置-185至+93位的STF-1基因組片段產生反義STF-1RNA探針。用T7RNA聚合酶和32P-UTP體外合成32P標記的反義STF-1RNA。STF-1反義RNA探針和mRNA在80℃退火5分鐘，然後在65℃孵育16小時。退火反應系然後在室溫下以40μg/ml RNase處理1小時，以5％變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分析消化產物。
實施例6報導基因克隆和瞬時轉染啟動子片段都被利用標準克隆技術克隆到D.Helinski提供的P(A)3螢光素酶骨架中(20)。來自STF-1啟動子的5』側翼序列在相對主轉錄起始位置的+68位(-6500 STF Luc,-3500 STF Luc,-450 STF Luc,-410 STF Luc,-225 STF Luc,-140 STF Luc)或+78位(-190 STF Luc,-130 STF Luc,-120 STF Luc,-95 STF Luc,-35STF Luc)與螢光素酶基因融合。利用磷酸鈣沉澱法將質粒轉染到HIT-IT15細胞(ATCC)、βTC 3(D.Hanahan(21)提供)、PC12、COS和HeLa細胞內。在單光發光計上定量測定螢光素酶值，並歸一化成由共轉染的RSV-CAT內部對照質粒得出的CAT活性。
實施例7凝膠變化試驗和DNase保護試驗為了用於電泳遷移率變化試驗，寡核苷酸探針利用Klenow片段通過補平反應以α32P-dCTP進行標記。4μg細胞核提取物與0.5納克(ng)32P標記的雙鏈寡核苷酸一起孵育並按照現有技術進行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(9)。為了進行超變分析，蛋白質預先與抗體一起孵育，然後與放射性雙鏈寡核苷酸一起孵育，然後電泳。按照現有技術進行DNase保護試驗(22)。
用HP ScanJet 3C掃描原始照片，然後在Macintosh上用Canvas軟體編輯成DNA結合試驗圖。掃描後的圖像被複製在Tektronix PhaserⅡSDX上。
實施例8STF-1基因的染色體定位和基因組組構用STF-1cDNA作為Jackson Laboratory的DNA回交系列的雜交探針，單拷貝的STF-1基因在物理圖上位於鼠5號染色體的遠端(圖1A)。沒有發現具有遠端標記Pmv12或Iapls3-9的重組體，但是發現了6個具有更遠的Actb基因組的重組體(圖1B)。以上結果預示，STF-1基因將相應地存在於大鼠的14號染色體和人染色體7q上，在與4個同源異型基因簇都不相應的基因座上。以上結果顯示，STF-1基因應該被歸為「孤獨」同源異型框基因。
為了分離編碼STF-1的基因，用32P標記的STF-1cDNA探針篩選來自大鼠EMBL3基因組文庫的106個噬菌體克隆，得到2個含有15kb的基因組插入片段的陽性克隆。除了6.5kb的5』側翼和3.5kb的3』側翼序列，該15kb的STF-1基因組片段還包含完整的STF-1編碼區，該區內緊靠同源異型框(胺基酸140-215)上遊(Ala 135)插有一個4kb的內含子(圖2A)。
STF-1基因組克隆中5』側翼內的共有TATA框和起始序列(圖2B)缺失。接著，對該基因的轉錄起始位置進行製圖。利用對來自產胰島素細胞系RIN和Tu6的mRNA進行的RNase保護和引物延伸分析，鑑定出了三個主起始位置，分別被稱為S1、S2和S3，它們位於翻譯起始位置上遊第91、107和120/125核苷酸。還發現了位於翻譯起始位置上遊137個核苷酸處的第4個次轉錄起始位置。和其它沒有TATA框的啟動子一樣，該STF-1啟動子在S1和S2起始位置上遊30bp處含有G/A和G/C豐富區。(23-25)實施例9STF-1啟動子在胰島細胞內的活性為了確定STF-1基因5』側翼內的序列是否足以使得STF-1的表達以胰島細胞為目標，6500bp的STF-15』側翼序列與β-半乳糖苷酶基因融合，並測定該STF-1-lacz報導基因在轉基因小鼠內的表達。以x-gal為生色底物，在來自三種各自獨立的建立系的轉基因胰島中檢測到了β-半乳糖苷酶活性，但是在同窩生的對照中沒有檢測到(圖3A)。
與目前所述的內源性STF-1蛋白的表達方式一樣，在轉基因鼠的外分泌腺細胞(圖3B)和例如肝和腎的非胰島組織中(未示)沒有檢測到明顯的β-半乳糖苷酶活性。與報導中內源性STF-1基因在十二指腸中的表達一樣(8,13)，以反義β-半乳糖苷酶RNA為探針進行的原位雜交研究也揭示了在轉基因動物的十二指腸上皮細胞內轉基因的表達(未示)。以上結果表明，6500bp的STF-1啟動子足以使得STF-1的表達定向於胰島和十二指腸細胞。
為了確定使STF-1表達定向於胰島細胞的功能元件，在兩個不同的胰島細胞系(βTC3,HIT)中對-6500STF Luc報導基因的活性進行了檢查。正如根據轉基因小鼠得出的結果所作的預計，STF-1報導基因在這些胰島細胞中表現出比在例如HeLa、PC12和COS的非胰島細胞系中強20至100倍的活性(圖4)。相反，STF-1的4kb內含子和3』側翼區當被插入在基本SV40 CAT啟動子質粒中時，沒有顯示出這樣的活性(未示)，這表明是6.5kb的STF-1啟動子片段專門負責將STF-1的表達定向於胰島細胞。
為了描述提供胰島細胞表達特性的STF-1啟動子內的序列，製造了一系列的5』缺失結構物，並通過向HIT細胞內的轉染對這些報導基因進行了分析(圖4B)。從-6500STF-1報導基因結構物中缺失掉-6500至-3500bp序列使得STF-1報導基因的活性降低了4倍，這表明在該區域內存在著遠端活化序列。進一步將STF-1啟動子從-3500bp對截短至-190bp不明顯影響報導基因在HIT細胞內的活性(圖4B)。但是，缺失STF-1啟動子內-190至-95bp的序列嚴重減弱了啟動子在HIT細胞內的活性，這表明STF-1功能還需要一個近端元件。對STF-1啟動子-190至-95區內序列的檢視發現了3個共有E框基元(圖2A)。雖然去除位於-177的兩個雙聯E框不降低啟動子的活性，但是缺失掉位於-104(-95 STF luc)的近端E框完全消除了STF-1在HIT細胞內的表達。
實施例10STF-1啟動子內的近端E框識別含USF複合物為了確定與STF-1啟動子內功能元件結合的上遊因子，用來自HIT和HeLa細胞的細胞核提取物進行了DNaseⅠ保護試驗(圖5)。在兩種提取物中都發現了一個主要的足跡蛋白活性，其邊界與在功能上十分重要的近端E框一致(-118/-95)。為了在HIT和HeLa細胞核提取物中進一步確定與重要的-104E框基元結合的蛋白而進行了凝膠遷移率變化試驗。用從-118至-95的一段雙鏈STF-1寡核苷酸，用兩種細胞核提取物都發現了3種複合物，稱為C1、C2和C3(圖5B，右面，泳道1和4)。在結合實驗中，C1、C2和C3的形成被過量50倍的非標記STF-1E框競爭寡核苷酸所抑制。但是，突變E框寡核苷酸或非特異性競爭DNA對它們的結合活性沒有影響，這表明C1、C2和C3確實對STF-1E框序列具有特異性(圖5B)。HeLa和HIT提取物中的這些聚合物在圖式上沒有質的差異(未示)，這表明-104E框可能識別在兩種細胞中類似表達的因子。
以前的報導證明，E框(例如-118/-95STF-1基元(CACGTG))優選結合bHLH-ZIP蛋白例如myc、max、TFE-3和USF。我們對C1、C2或C3複合物中是否含有上述候選蛋白進行了檢查(26,27)。因為-118/-95E框結合蛋白具有耐熱變性的能力(未示)，所以我們檢查熱穩定上遊因子USF是否是C1、C2或C3的組成部分(28)。值得注意的是，在凝膠遷移率變化反應中加入抗USF抗血清抑制了所有3中複合物的形成(圖5C)。但是抗TFE-3抗血清對C1、C2或C3複合物沒有影響，這表明這些複合物很可能是由USF蛋白形成的。在凝膠變化試驗中，重組USF-1產生了一種蛋白質DNA複合物，它和複合物C2在相同的相對位置發生遷移(未示)。而且，在DNaseⅠ保護研究中，重組USF-1足跡蛋白活性與在HIT提取物中觀察到的一樣(圖5A)。
兩種USF,USF-1和USF-2似乎在大多數細胞類型中都表達(18)。為了分辨出這些USF蛋白中哪種包含在C1、C2和C3複合物內，將HIT或HeLa提取物與抗USF-1特異性抗血清或抗USF-2特異性抗血清一起孵育(圖5D)。雖然USF-1抗血清能夠「超變」所有3中複合物，但是USF-2特異性抗血清只抑制C1和C3複合物的形成。以上結果表明，C1和C3複合物對應於USF-1/USF-2異二聚體，而C2含有USF-1同源二聚體。
為了證實CACGTG E框序列是否為STF-1啟動子活性所必需，我們構建了一個在E框內含有兩處鹼基對取代的突變STF-1寡核苷酸(-118/-95)。在以HIT提取物進行的凝膠遷移率變化試驗中，該突變E框基元(AACGCG)不能形成C1、C2和C3複合物，也不能與野生型E框寡核苷酸競爭與USF-1的結合(圖6A)。相應的，包含突變STF E基元的全長(6.5kb)STF-1和截短報導質粒(-190STF)在胰島細胞中的活性比它們的野生型低近10倍(圖6B)。以上結果表明，結合USF的近端E框對STF-1啟動子活性來說確實是關鍵性的。
所以，前6500鹼基對的STF-15』序列內的兩個元件對於胰島特異性表達來說是重要的位於-6500至-3500之間的遠端元件，和位於-104的近端元件。近端的-104元件含有一個共有E框基元，它識別上遊活化物USF。許多信息證明，USF對於STF-1的活性十分重要。首先，無差別USF-1、2抗體和USF-1、2特異性抗體都識別STF-1E框特異性複合物。其次，STF-1E框在HIT細胞核提取物中的結合活性具有USF特有的特徵複合物具有熱穩定性，具有與重組USF-1相近的半衰期。最後，STF E框上抑制USF複合物形成的點突變相應地減弱了STF-1報導基因的活性。以上結果表明，USF複合物對於STF-1啟動子的活性確實十分重要，由此，對於胰腺的器官形成也十分重要。
除USF之外的其它核因子，最主要的是myc和max，也能夠高親和力地結合STF-1E框(CACGTG)基元。myc已被證明通過與max以異二聚體的形式與E框基元結合來刺激靶基因的轉錄(32,33)。由於myc基因的表達在細胞有絲分裂後期(例如胰島中的那些)中無法測得，所以那裡的STF-1啟動子調控作用可能不涉及myc-max複合物。但是，在發育過程中，STF-1的表達似乎集中在增殖性管細胞中(6)，所以，myc可能在那些條件下刺激STF-1的表達。在這方面，在胰腺發育過程中觀察到的STF-1表達的複雜變化可能在一定程度上反映了E框結合活性的變化，後者最終將STF-1的產生限制在胰島細胞。
實施例11凝膠變化試驗和DNaseⅠ保護試驗為了進行電泳遷移率變化試驗，雙鏈寡核苷酸用Klenow片段通過32PdCTP補平反應進行標記。5微克(μg)細胞核提取物與0.5納克(ng)標記過的寡核苷酸和1(g非特異性競爭DNA一起在冰上孵育30分鐘，然後進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。為了進行超變試驗，細胞核提取物預先與抗血清一起在冰上孵育30分鐘至1小時，然後加入標記過的探針。抗HNF-3(、HNF-3(和HNF-3(抗體是由S.Duncan和J.Darell提供的。抗BETA-2抗體是M.J.Tsai提供的。抗-E2A抗體是向Santa Cruz Biochemicals購買的。如現有技術所述進行DNAseⅠ保護試驗(37)。重組HNF-3(由K.Zaret提供。
實施例12Northen印跡抑生長素細胞瘤/胰島細胞瘤Tu6細胞在乙醇或10-7地塞米松中培養不同的時間。用苯酚胍法抽提總RNA。用15微克總RNA在含有甲醛的瓊脂糖凝膠上進行電泳，然後轉移到Zeta-Probe上。使用Amersham隨機引發試劑盒形成隨機引發STF-1和微管cDNA。
實施例13內皮因子HNF-3(和BETA-2通過胰島特異性增強子調控STF-1表達包含STF-1基因從-6200至-5670的530鹼基對的啟動子結構物經地塞米松處理後被完全抑制，但含有遍在USF-1識別位置的基本STF-1啟動子結構物卻不受抑制(圖7a)。STF-1基因的該相同530bp區域在HIT-T15細胞內比在COS-7細胞內活性高約5至10倍，這表明該片段具有胰島細胞特異性活性(圖7b)。對細胞特異性STF-1增強子內序列的檢測顯示有對應E框結合蛋白(-5.98至-5.963)和HNF-3(-5.927至-5.907)的共有基元(圖7c)。該E框基元，被稱為B元件，在序列上與大鼠胰島素Ⅰ和Ⅱ啟動子內的NIR和FAR元件是一樣的(34)。HNF-3位置，被稱為H元件，在12個位置的9各內與HNF-3共有結合位置是一致的。
為了確定B元件和H元件是否真的被胰島特異性核蛋白識別，我們用以32P標記的從-5870至-6100的STF-1增強子片段進行DNAseⅠ保護試驗。從HIT T15細胞製備的核提取物被發現同時具有在B位置(E框基元)和H位置(HNF-3基元)上的DNA結合活性(圖8a、比較泳道1和2)。在以來自HIT、HeLa和COS 7細胞的核提取物進行的DNAseⅠ保護試驗中，B元件都受到相同程度的保護，但是只有在來自HIT細胞的提取物中H元件受到保護(圖8a，比較由此2和4)。在含有純化重組HNF-3(蛋白的反應中，我們還注意到插在H元件足跡中間的一個突出的超敏位點，這使得我們懷疑HNF-3調節物家族中的一員與HIT-T細胞中的STF-1H元件結合(圖8a，比較泳道2和5)。
為了進一步確定識別STF-1增強子上H元件的核因子，我們用32P標記的STF-1H元件探針進行了凝膠遷移率變化試驗。在含有HIT或RIN核提取物的反應系中觀察到主要為低遷移率複合物，而且該複合物的形成特異性地受到添加摩爾量過量100倍的非標記野生型H元件競爭DNA的抑制，但不受非標記突變H元件競爭DNA的抑制(圖8b，比較泳道4-5,9-10,14-15)。在含有HeLa細胞核提取物的反應系中沒有發現特異性蛋白質DNA複合物，這表明H元件可能識別具有限制性表達方式的細胞核因子(圖8b，比較泳道1,6)。但是，在HepG2肝癌提取物中存在著遷移率與RIN/HIT-T15複合物一樣的H元件特異性複合物表明，H元件結合蛋白可能在具有內皮性起源的細胞中普遍表達(圖8b，比較泳道3-5)。
HNF-3核活化物家族由((,(和組成，它們通過高度保守的翼狀螺旋主域結合DNA。為了確定HIT提取物中的H元件結合活性是否與HNF-3家族成員有關，我們用HNF-3成員各自的特異性抗血清進行了凝膠遷移率變化試驗。雖然用Western印記分析在HIT-T15胰島瘤細胞的細胞核提取物中測得了全部3種HNF-3蛋白(未示)，但是在使用相同的提取物和H元件探針時，只發現HNF-3(抗血清被發現抑制為主的蛋白質-DNA複合物的形成(圖8c，泳道1-4)。以從成年大鼠胰島細胞原代培養物製備的細胞核提取物進行的凝膠變化試驗中也得出相同的結果(圖8c，泳道5-8)。
STF-1增強子內的B元件含有與胰島素啟動子內的E框元件一致的共有E框基元。以前的研究證明，胰島特異性因子BETA-2通過與遍在因子E47以異二聚體形式結合這些胰島素啟動子元件來激活胰島素啟動子活性，這促使我們對STF-1B元件上BETA-2/E47的形成進行了測試。在HIT細胞核提取物的凝膠遷移率變化試驗中，32P標記的B元件探針被發現形成4種特異性DNA蛋白質複合物，它們會被加入的非標記的野生型競爭抑制，但不受非標記突變型的競爭抑制(圖8d，比較泳道1,5,6)。最慢的複合物其遷移位置與重組E2A/BETA2異二聚體相同(圖8d，比較泳道1和7)。雖然非相關性抗血清對B元件結合活性沒有影響(圖8d，泳道4泳道2和3)，但是BETA-2或E2A抗血清特異性地抑制最慢的複合物的形成(圖8d，泳道2和3)，這表明，E2A/BETA2異二聚體的確在HIT細胞核提取物中識別T元件。
為了測定HNF-3(和E2A/BETA-2識別位置在介導STF-1增強子活性方面的重要性，我們在B和H元件內進行了點突變，這樣的突變在體外幹擾上述識別因子的結合。當結合530bp的增強子進行測試時，含有B元件內或H元件內突變的STF-1報導質粒在HIT T15細胞內的活性比野生型結構物低得多(圖9a)。但是，相反，突變的B元件和H元件結構物的活性在COS-7細胞內與野生型-6500STF-1報導質粒相同；這表明這些突變幹擾特異性地與胰島細胞相關聯的轉錄活性。所以，B元件和H元件突變STF-1報導質粒在HIT-T15細胞內對地塞米松誘導也是沒有反應的，這表明，這種激素特異性地幹擾E2A/BETA 2或HNF-3(活性(圖9b)。
為了評價地塞米松是否通過幹擾HNF-3(或BETA 2/E47對遠端增強子的活性來幹擾STF-1的表達，我們用HNF-3(或BETA 2和E47效應質粒進行了瞬時轉染試驗。HNF-3((圖9b)或BETA 2/E47(未示)的過量表達在非受激HIT T15細胞內對STF-1報導基因的表達幾乎沒有影響(圖9b，比較立柱1和5)。HNF-3(被發現抑制地塞米松對野生型STF-1報導基因活性的抑制作用(圖9h，比較立柱1,3,7)，但是例如BETA 2/E47、STF-1和HNF-4的活化物不能恢復經地塞米松處理過的細胞內的STF-1啟動子的活性(未示)。在以不斷加量的效應質粒進行的滴定實驗中，HNF-3(被發現以劑量依賴性方式恢復-6500STF-1 LUC報導基因的活性(圖9c)。但是，HNF-3(不加強含有H元件內突變的突變STF-1報導質粒的活性，這表明該活化物的抑制作用是通過其在STF-1增強子內的識別位置產生的(圖9b比較立柱2,4,6,8)。
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(B)註冊號16,040(C)文獻/卷宗號D-5848(ⅰⅹ)電傳信息(A)電話713-626-8646(B)電傳713-963-5853(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度403bp
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型(A)說明其它核酸(ⅲ)假設非(ⅳ)反義非(ⅵ)原始來源(B)菌株(C)具體分離株(D)發育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(xi)SEQ ID NO:1的序列描述TTAAGCTCTA ATGGAGCGGT TTTGTAACGG AGTAAAGGTT CTGATATTTT TGCGCTCCCC 60GGTTTGGAGA GCTCCGCAGC AGGACAGGAG AGATCAGCCT GCTGAGAGAG AAAATTGAAA 120CAAGTGCAGG TGTTCGCGGG CCTGGGCCTC CTTCTTAAGG CAGGGCCAGG CCAATGGTGG 180CCCCAGGCTG AACCACGTGG GGTGCCTCAG AGCCTATGGC ACGGCGACCG GCTTCTCTGT 240CTCTCGCCAG CCTGTGGTTC CCCGGGAGAG CAGTGGAGAA CTGTCAAAGC GATCTGGGGT 300GGCGCTGAGA GTCCGTGAGC TGCCAGCGCC TTAAGGCCTG GCTTGTAGCT CCCTACCCCG 360GGCTGCCGGC CCCGAAGTGC CGGCTGCCAC CATGAATAGT GAG 403(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度490bp(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型(A)說明其它核酸(ⅲ)假設非
(ⅳ)反義非(ⅵ)原始來源(B)菌株(C)具體分離株(D)發育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述TCTAGAGAGT TCTCCTGTTC GCTAGATAAG AAAGCCTGTT CTGCCATCCC AGCAGGCATA 60GGCTGTTTAA GTTACTAGAT AACAGAGTTG TTATTGATTC TATTATTATT ATTTTTTCTA 120CTCTTCCTGA TTCCCTGAAG TCCAAGGGAA GTTTTGTCAA CTAGGAATGA TTTTTGTTTA 180AAAAAAAAAA AAAAAGGCTC CTTGTTGTGT CTTAGCTGGT CAGTGACAGA TGGAGTCCTG 240AGTTTCCTAG GAGCCCTTTA CTCAGGAGTG GGAGAACAGA AAGTAAATAA GCGCTCTTAG 300TCATCTGCTT TCTCAGAGCA GCGTTGGGCC CCAGCACTTG GAAAGCGAAT GCTGGCTCCT 360CCTGGACTCC CCCGTCAGCC TGATGTTGTT AACCCGTTTA ACATTCCCTT ATCACATGCT 420CATTGTGGGC AGAATTAAGT GGAATTAGCT AACAAATTAT ATAAAATTCA TTTACCTTTC 480AAGGAAGCTG 490(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型(A)說明其它核酸(ⅲ)假設非(ⅳ)反義非(ⅵ)原始來源(B)菌株(C)具體分離株
(D)發育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述TCAGTGACAG ATGGAGTCCT 20(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線性(ⅱ)分子類型(A)說明其它核酸(ⅲ)假設非(ⅳ)反義非(ⅵ)原始來源(B)菌株(C)具體分離株(D)發育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述TCAGTGAAAG ACGGAGTCCT 20
權利要求
1．一種測定被測化合物刺激胰島細胞誘導STF-1轉錄的能力的方法，它包括以下步驟提供包含具有從SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其片段序列中選擇的STF-1增強子、啟動子和受所述STF-1增強子和所述啟動子轉錄調控的報導基因的載體，其中所述的報導基因能夠使得所述的宿主細胞具有可檢測信號；將所述載體轉移到所述宿主細胞內；在被測化合物存在下培養所述的宿主細胞，測定所述的被測物質刺激所述的宿主細胞產生所述信號的能力；分析所述的信號，測定所述的被測化合物刺激所述宿主細胞產生所述可檢測信號的能力，其中有所述信號的存在表示所述被測化合物刺激胰島細胞誘導了STF-1的轉錄，而沒有所述信號則表示所述的被測化合物沒有刺激胰島細胞誘導STF-1的轉錄。
2．根據權利要求1所述的方法，其中所述的報導基因是酶。
3．根據權利要求2所述的方法，其中所述的酶選自螢光素酶和β-半乳糖苷酶。
4．根據權利要求1所述的方法，其中所述的轉移步驟是通過轉染進行的。
5．根據權利要求4所述的方法，其中所述的胰島細胞是HIT細胞。
6．根據權利要求1所述的方法，其中所述的轉移步驟是通過微注射將轉基因導入動物體內來進行的。
7．一種體內標記產胰島素的胰島細胞的方法，它包括以下步驟提供包含STF-1啟動子和受所述STF-1啟動子調控的報導基因的載體，其中所述的報導基因能夠使胰島細胞具有可檢測的信號；將所述載體作為轉基因導入動物的胚胎；將所述的胚胎培養成具有胰島細胞的動物體；分析所述的可檢測信號，確定所述的動物的胰島細胞是否表達所述的報導基因，其中有信號存在表示有產胰島素的胰島細胞存在，而沒有信號表示沒有產胰島素的細胞。
8．根據權利要求7所述的方法，其中所述的報導基因產生螢光蛋白。
9．根據權利要求8所述的方法，其中所述的方法還包括利用螢光激活細胞分類術(FACS)將產胰島素的胰島細胞與不產胰島素的胰島細胞分選開來的步驟。
全文摘要
本發明提供了兩種實施方式。其一是檢測能夠誘導STF－1轉錄的化合物的方法。分離出表達STF－1/lacZ融合基因的胰島細胞,通過將待測化合物加入表達STF－1/lacZ的細胞來測定各種化合物的作用。然後利用比色法定量測定對照細胞和經處理細胞內的lacZ活性。利用此方法可以篩選大量化合物並可以方便地鑑定出STF－1誘導性化合物。其二是在體內用STF－1啟動子標記產生胰島素的胰島細胞的方法。其中,綠螢光蛋白(GFP)被用作指示物。用轉基因方法將STF－1綠螢光蛋白引入豬體內就能夠高效迅速地從胰腺中回收產生胰島素的細胞。
文檔編號C12N15/85GK1209843SQ97191782
公開日1999年3月3日 申請日期1997年1月22日 優先權日1996年1月22日
發明者M·R·蒙特米尼, S·夏爾馬 申請人:研究發展基金會 被以下專利引用 (1),