一種分清五淋丸的質量標準及其檢驗方法

2023-04-25 16:43:01 3

專利名稱：一種分清五淋丸的質量標準及其檢驗方法
技術領域：
本發明屬於中藥技術領域，具體說是涉及一種分清五淋丸的質量標準及其檢驗方法。
背景技術：
分清五淋丸是木通、車前子、黃芩、茯苓、豬苓、黃柏、大黃、篇蓄、瞿麥、知母、澤
瀉、梔子、甘草、滑石14味藥組成的複方，收載於中國藥典2005年版一部。原標準只收載 有顯微鑑別和檢査項，按照藥品註冊管理辦法中有關仿製產品提高質量標準的要求，參照中 國藥典2005年版一部相關品種項下和有關文獻資料，進行各項試驗摸索後，增加了大黃、 梔子、黃柏、黃芩的薄層鑑別；並對該製劑進行了重金屬及砷鹽的考察，其測定結果低於常 規限度，同時對處方中木通所含齊墩果酸和常春藤皂苷元進行了含量測定的試驗摸索，結果 滿意，大大的提高了原標準，使得產品質量更加可控，同時更利於產品工業化生產要求。

發明內容
本發明的目的是公開一種分清五淋丸的質量標準及其檢驗方法，對處方中木通所含齊墩 果酸和常春藤皂苷元建立了高效液相含量測定方法，同時增加了處方中大黃、梔子、黃柏、 黃芩的薄層鑑別，提高了質量標準，加強了該藥的質量可控性，保證了患者服用的有效性， 通過本發明增加的質量控制，有利於本產品的工業化生產的監控。
本發明的目的是由以下技術方案實現的-
一種分清五淋丸的質量標準及其檢驗方法，其特點在於該方法中的鑑別方法是以下的 一種或幾種
a、鑑別
顯微鑑別包括下列步驟取分清五淋丸，置顯微鏡下觀察可見車前子、黃芩、茯苓、 豬苓、黃柏、大黃、萵蓄、瞿麥、知母、澤瀉、梔子、甘草的顯微特徵，
大黃的鑑別包括下列步驟取分清五淋丸O. 5 lg，研細，加甲醇20 40ml，浸泡1 2 小吋，濾過，濾液蒸乾，殘渣加水10 20ml使溶解，再加鹽酸l 2ml，加熱回流30 40分 鍾，立即冷卻，用乙醚分2 4次振搖提取，每次20 30ml，合併乙醚液，蒸乾，殘渣加三 氯甲烷1 2ml使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對照藥材0. 1 0.2g，同法製成對照藥 材溶液。再取大黃酸對照品，加甲醇製成每lml含1 1.5mg的溶液，作為對照品溶液。照 薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各5 10y 1，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑 的矽膠H薄層板上，以石油醚30 6(TC-甲酸乙酉旨-甲酸(15 20 : 5 7 : 1 1.4)的上層溶液 為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈365nm下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色 譜相應的位置上，顯相同的五個橙黃色螢光主斑點；在與對照品色譜相應的位置上，顯相同 的橙黃色螢光斑點，置氨蒸氣中燻後，斑點變為紅色，陰件對照無對應斑點，
梔子的鑑別包括下列步驟取分清五淋丸5 10g，研細，加40 70%甲醇50 100ml， 超聲處理40 60分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取梔子對照藥材l 1.5g,同法製成 對照藥材溶液。再取梔子苷對照品，加乙醇製成每lml含4 6mg的溶液，作為對照品溶液。 照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各2 5til，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合
劑的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5 io : 5 io : 1 2 : 1 2)為展開劑，
展開，取出，晾乾，噴以5 10%硫酸乙醇溶液，在ll(TC加熱至斑點顯色清晰，供試品色 譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，
黃柏的鑑別包括下列步驟取分清五淋丸2 5g，研細，加甲醇25 50ml，加熱回流30 40分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材10 20rag，加甲醇l 2ml，製成 對照藥材溶液。再取鹽酸小檗鹼對照品，加甲醇製成每lral含0.5 lmg的溶液，作為對照 品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各1 2y 1，分別點於同一以羧甲基纖維素
鈉為黏合劑的矽膠r'薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10 15 : 6 15 : 1 2 : 1 2)
為展開劑，置氨蒸氣預飽和的展開缸內，展開，取出，晾乾，置紫外光燈365nm下檢視，供 試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點，
黃芩的鑑別包括下列歩驟取分清五淋丸5 10g，研細，加乙酸乙酯-甲醇(3 6: l 2)的混合溶液50 100ml，加熱回流30 40分鐘，放冷，濾過，濾液蒸乾，殘渣加甲醇5 10ml使溶解，取上清液作為供試品溶液。另取黃芩對照藥材1 1.5g，同法製成對照藥材溶 液。再取黃芩素、漢黃芩素對照品，加甲醇製成每lml各含0.5 lmg的對照品溶液。照薄 層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2 4ul及上述兩種對照品溶液各1 2
p i，分別點於同一聚醯胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸ao 15 : 3 4.5: i i. 5:
2 7.5)為展開劑，預飽和30 40分鐘，展丌，取出，晾乾，置紫外光燈365nm下檢視， 供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相同的位置上，顯相同顏色的暗色斑點， b含量測定
齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量測定方法包括下列步驟
色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸-三 乙胺80 95 : 20 5 : 0. 02 0. 5 : 0. 01 0. 05為流動相；檢測波長為210nm，理論板數按齊 墩果酸峰計算應不低於2000;
對照品溶液的製備；精密稱取齊墩果酸對照品、常春藤皂苷元對照品，加甲醇製成每 lml各含0. 4 0. 7mg的混合溶液，即得；
供試品溶液的製備取分清五淋丸，研細，取約10 15g，精密稱定，加甲醇50 80ml， 超聲處理功率250W，頻率50kHz30 40分鐘，濾過，殘渣用甲醇洗滌，合併濾液與洗液，回 收溶劑至幹，殘渣加水10 15 ml溶解，用水飽和正丁醇萃取3 5次，每次20 30ml，合 並提取液，蒸乾，殘渣加甲醇20 30 ml、鹽酸2 4ml，加熱水解4 6小時，水解物加水 10 15ml，用三氯甲烷振搖提取2 4次，每次20 30ml，合併提取液，冋收溶劑至幹，殘 渣加甲醇溶解並轉移至5 10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 20^1 ，注入液相色譜儀，測定， 即得；
分清五淋丸每lg含木通以齊墩果酸(C3。H4803)和常春藤皂苷元(C3。H4804)的總量計，不 得少於0. 20mg;
該方法中的質量標準鑑別a及含量測定b方法是以下方法的一種或幾種 a鑑別
顯微鑑別取分清五淋丸，置顯微鏡下觀察不規則分枝狀團塊無色，遇水合氯醛試液
溶化；菌絲無色或淡棕色，直徑4 6um;菌絲黏結成團，大多無色；草酸鈣方晶正八面體 形，直徑32 60um;種皮內表皮細胞表面觀類長方形，壁微波狀，以數個細胞為一組，略 作鑲嵌狀排列；韌皮纖維淡黃色，梭形，壁厚，孔溝細；纖維束鮮黃色，周圍細胞含草酸鈣 方品，形成晶纖維，含晶細胞的壁木化增厚；纖維束周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶，形成晶纖 維；草酸鈣簇晶大，直徑60 140wm;草酸鈣針晶成束或散在，長26 110ym;纖維束周 圍薄壁細胞含草酸鈣簇晶，形成晶纖維，含晶細胞縱向成行；葉表皮細胞平周壁有角質線紋， 氣孔不等式，副衛細胞3個；上下表皮均可見柵欄組織；薄壁細胞類圓形，有橢園形紋孔， 集成紋孔群；內皮層細胞垂周壁波狀彎曲，較厚，木化，有稀疏細孔溝；種皮石細胞黃色或 淡棕色，多破碎，完整著長多角形、長方形或不規則形，壁厚，有大的圓形紋孔，胞腔棕紅色；
大黃的鑑別取分清五淋丸0.5g，研細，加甲醇20ml，浸泡1小時，濾過，濾液蒸乾， 殘渣加水10ml使溶解，再加鹽酸lml，加熱回流30分鐘，立即冷卻，用乙醚分2次振搖提 取，每次20ml，合併乙醚液，蒸乾，殘渣加三氯甲垸lml使溶解，作為供試品溶液；另取 大黃對照藥材O. lg，同法製成對照藥材溶液；再取大黃酸對照品，加甲醇製成每lml含lmg 的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各5iU,分別點於同一以 羧甲基纖維素鈉為黏合劑的矽膠H薄層板上，以石油醚30 60°C-甲酸乙酉g-甲酸15 : 5 : 1 的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈365rm下檢視；供試品色譜中，在與 對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的五個橙黃色螢光主斑點；在與對照品色譜相應的位置 上，顯相同的橙黃色螢光斑點，置氨蒸氣中燻後，斑點變為紅色；
梔子的鑑別取分清五淋丸5g，研細，加5(m甲醇50ml，超聲處理40分鐘，濾過，濾 液作為供試品溶液；另取梔子對照藥材lg，同法製成對照藥材溶液；再取梔子苷對照品，加 乙醇製成每lml含4mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各 2Pl，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸
-水5 : 5 : l : i為展丌劑，展開，取出，晾乾，噴以10%硫酸乙醇溶液，在iio"c加熱至斑
點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的 斑點；
黃柏的鑑別取分清五淋丸2g，研細，加甲醇25ml，加熱回流30分鐘，濾過，濾液作 為供試品溶液；另取黃柏對照藥材50mg，加甲醇5ral，同法製成對照藥材溶液；再取鹽酸小 檗鹼對照品，加甲醇製成每lml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸 取h述三種溶液各1 u 1，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的矽膠G薄層板上，以乙
酸乙酯-丁酮-甲酸-水io : 6 : i : i為展升劑，置氨蒸氣預飽和的展開缸內，展開，取出，
晾乾，置紫外光燈(365nm)下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的 位置上，顯相同顏色的螢光斑點；
黃芩的鑑別取分清五淋丸5g，研細，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶液50ml，加熱 回流30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸乾，殘渣加甲醇5ml使溶解，取上清液作為供試品溶液； 另取黃芩對照藥材lg，同法製成對照藥材溶液；再取黃芩素、漢黃芩素對照品，加甲醇製成 每lml各含0. 5mg的對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2 yl及上述兩種對照品溶液各分別點於同一聚醯胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-
甲酸io : 3 : i : 2為展開劑，預飽和30分鐘，展開，取出，晾乾，置紫外光燈365腦下檢
視；供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相同的位置上，顯相同顏色的暗色斑點； b含量測定齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量測定
照高效液相色譜法中國藥典2005年版一部附錄Vi D測定，色譜條件與系統適用性試驗
以卜八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺87 : 13 : o. 04 : o. 02為流動
相；檢測波長為210nm;理論板數按齊墩果酸峰計算應不低於2000。
對照品溶液的製備精密稱取齊墩果酸對照品、常春藤皂苷元對照品，加甲醇製成每lml 各含0. 5mg的混合溶液，即得；
供試品溶液的製備取分清五淋丸，研細，取約10g，精密稱定，加甲醇50ml，超盧處 理功率250W，頻率50kHz30分鐘，濾過，殘渣用甲醇洗滌，合併濾液與洗液，回收溶劑至幹， 殘渣加水IO ml溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合併提取液，蒸乾，殘渣加 甲醇20 ml、鹽酸2 ml，加熱水解4小時，水解物加水10 ml，用三氯甲烷振搖提取2次， 每次20ml，合併提取液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解並轉移至5ml量瓶中，加甲醇至 刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 pl ，注入液相色譜儀，測定， 即得。
分清五淋丸每lg含木通以齊墩果酸(C3。H4803)和常春藤皂苷元(C:,。H4804)的總量計，不 得少於0. 20mg。
本發明的有益效果本發明通過顯微鑑別車前子、黃芩、茯苳、豬苓、黃柏、大黃、萵 蓄、瞿麥、知母、澤瀉、梔子、甘草，採用薄層色譜法鑑別大黃、梔子、黃柏、黃芩，含量 測定採用高效液相色譜法測定木通中齊墩果酸對照品和常春藤皂苷元，是提供分清五淋丸質 量檢驗方法及標準，通過建立明確專屬性強的鑑別及重現性、穩定性及精密度良好的含量測 定方法，能夠有效控制分清五淋丸的質量，使分清五淋丸質量達到穩定、可控、高效及安全， 是對產品的投料要求及質量控制嚴格，克服現有技術的不足，提高產品的質量、療效、生物 利用度，產品質量高，能保證產品療效，更好地滿足醫療的需要。


圖1是本發明的分清五淋丸中大黃紫外燈下鑑別圖； 圖2是本發明的分清五淋丸中大黃氨蒸氣燻後鑑別圖； 圖3是本發明的分清五淋丸中梔子鑑別圖； 圖4是本發明的分清五淋丸中黃柏鑑別圖； 圖5是本發明的分清五淋丸中黃吝鑑別圖6是本發明的齊墩果酸對照品、常春藤皂苷元對照品的高效液相色譜圖7是本發明的分清五淋丸中樣品的高效液相色譜圖8是本發明的分清五淋丸陰性對照溶液高效液相色譜具體實施例方式
實施例1:
1、 在分清五淋丸的定性鑑別的研究中，首先按中國藥典2005版一部分清五淋丸標準， 保留了顯微鑑別項，同時設計對處方中木通、黃苓、茯苓、黃柏、大黃、知母、梔子、甘草 進行定性鑑別，參考藥典方法及文獻報導方法，經反覆試驗摸索，結果木通、茯苳、知母、 甘草分離效果依舊很差，有的甚至無法分離，陰性樣品有幹擾，大黃、梔子、黃柏、黃芩分 離效果很好，陰性樣品無幹擾。
2、 分清五淋丸在定量分析的設計中，因原標準中沒有含量測定項，對木通進行了成分
分析的實驗。採用的高效液相色譜法對其中所含齊墩果酸對照品和常春藤皂苷元進行含量測 定，經過對系統適用性、線性回歸、精密度、重現性、穩定性、回收率等試驗考察，證明本 檢驗方法，重現性好，能快速準確的檢驗藥品質量。鑑別
1、分清五淋丸的顯微鑑別
取分清五淋丸研細，置顯微鏡下觀察不規則分枝狀團塊無色，遇水合氯醛試液溶化； 菌絲無色或淡棕色，直徑4 6ixm。菌絲黏結成團，大多無色；草酸鈣方晶正八面體形，直
徑32 60nm。種皮內表皮細胞表面觀類長方形，壁微波狀，以數個細胞為一組，略作鑲嵌 狀排列。韌皮纖維淡黃色，梭形，壁厚，孔溝細。纖維束鮮黃色，周圍細胞含草酸鈣方晶， 形成晶纖維，含晶細胞的壁木化增厚。纖維束周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維。草 酸鈣簇晶大，直徑60 140ym。草酸鈣針晶成束或散在，長26 110nrn。纖維束周圍薄壁 細胞含草酸鈣簇晶，形成晶纖維，含晶細胞縱向成行。葉表皮細胞平周壁有角質線紋，氣孔 不等式，副衛細胞3個；上下表皮均可見柵欄組織。薄壁細胞類圓形，有橢園形紋孔，集成 紋孔群；內皮層細胞垂周壁波狀彎曲，較厚，木化，有稀疏細孔溝。種皮石細胞黃色或淡棕色，多破碎，完整著長多角形、長方形或不規則形，壁厚，有大的圓形紋孔，胞腔棕紅色。 2、大黃的薄層鑑別
供試品溶液的製備取分清五淋丸0.5g，研細，加甲醇20ml，浸泡1小時，濾過，濾 液蒸乾，殘渣加水10ml使溶解，再加鹽酸lml，加熱回流30分鐘，立即冷卻，用乙醚分2 次振搖提取，每次20ml，合併乙醚液，蒸乾，殘渣加三氯甲烷lml使溶解，即得。
陰性對照溶液製備取缺大黃的陰性樣品0.5g，加甲醇20ml，浸泡1小時，濾過，濾 液蒸乾，殘渣加水10ml使溶解，再加鹽酸lml，加熱回流30分鐘，立即冷卻，用乙醚分2 次振搖提取，每次20ml，合併乙醚液，蒸乾，殘渣加三氯甲垸lml使溶解，即得。
對照藥材溶液的製備取大黃對照藥材O. lg，研細，加甲醇20ml，浸泡1小時，濾過， 濾液蒸乾，殘渣加水iOml使溶解，再加鹽酸lml，加熱回流30分鐘，立即冷卻，用乙醚分 2次振搖提取，每次20ml，合併乙醚液，蒸乾，殘渣加三氯甲烷lml使溶解，即得。
對照品溶液的製備取大黃酸對照品，加甲醇製成每lml含lmg的溶液，即得。
試驗方法照薄層色譜法試驗(中國藥典2005年版一部附錄VI B)，吸取上述四種溶 液各5nl，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的矽膠H薄層板上，以石油醚(30 6(TC)-甲酸乙酉旨-甲酸(15 : 5 : 1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈 (365nm)下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的五個橙黃色 螢光主斑點；在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色螢光斑點，置氨蒸氣中燻後， 斑點變為紅色；而陰性對照溶液無斑點出現，結果不幹擾黃芪的鑑別，見圖l。
3、 梔子的鑑別
供試品溶液的製備取分清五淋丸5g，研細，加5Cm甲醇50ml，超聲處理40分鐘，濾 過，即得。
陰性對照溶液製備取缺梔子的陰性樣品5g，研細，加50y。甲醇50ml，超聲處理40分 鍾，濾過，即得。
對照藥材溶液的製備取梔子對照藥材lg，加5(F。甲醇50ml，超聲處理40分鐘，濾過， 即得。
對照品溶液的製備取梔子苷對照品，加乙醇製成每lml含4mg的溶液，即得。 試驗方法照薄層色譜法試驗(中國藥典2005年版一部附錄VI B)，吸取上述四種溶 液各2ii1，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-
甲酸-水(5:5:i:i)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以10%硫酸乙醇溶液，在iio°c
加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，顯相 同顏色的斑點；而陰性對照溶液無斑點出現，結果不T擾梔了的鑑別，見圖2。
4、 黃柏的鑑別
供試品溶液的製備取分清五淋丸2g，研細，加甲醇25ml，加熱冋流30分鐘，濾過， 即得。
陰性對照溶液的製備取缺黃柏的陰性樣品2g，研細，加甲醇25ml，加熱回流30分鐘， 濾過，即得。
對照藥材溶液的製備取黃柏對照藥材50mg，加甲醇5ml，加熱回流30分鐘，濾過， 即得。
對照品溶液的製備取鹽酸小檗鹼對照品，加甲醇製成每lml含0.5mg的溶液，即得。 試驗方法照薄層色譜法試驗(中國藥典2005年版一部附錄VI B)，吸取上述四種溶 液各1 u 1，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(io : 6 : i : i)為展開劑，置氨蒸氣預飽和的展丌缸內，展丌，取出，晾乾，置紫
外光燈(365nm)下檢視；供試品色譜屮，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點；而陰性對照溶液無斑點出現，結果不幹擾黃柏的鑑別，見圖3。 5、黃芩的鑑別-
供試品溶液的製備取分清五淋丸5g，研細，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶液50ml， 加熱回流30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸乾，殘渣加甲醇5ml使溶解，即得。
陰性對照溶液的製備取缺黃芩的陰性樣品5g，研細，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶 液50ml，加熱回流30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸乾，殘渣加甲醇5ml使溶解，即得。
對照藥材溶液的製備取黃芩對照藥材lg，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶液50ml， 加熱回流30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸乾，殘渣加甲醇5ml使溶解，即得。
對照品溶液的製備取黃芩素、漢黃苳素對照品，加甲醇製成每lml各含0. 5mg的對照 品溶液，即得。
試驗方法照薄層色譜法試驗(中國藥典2005年版一部附錄VI B)，吸取供試品溶液、 對照藥材溶液各1及上述四種對照品溶液各1 y 1，分別點於問一聚醯胺薄膜上，以甲苯-
乙酸乙酯-甲醇-甲酸io : 3 : l : 2為展開劑，預飽和30分鐘，展開，取出，晾乾，置紫外
光燈365皿下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相同的位置卜.，顯相 同顏色的暗色斑點；而陰性對照溶液無斑點出現，結果不幹擾黃芩的鑑別，見圖4。含量測定齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量測定
照高效液相色譜法中國藥典2005年版一部附錄VI D測定，色譜條件與系統適用性試驗 以十八垸基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺87 : 13 : 0. 04 : 0. 02為流動 相；檢測波長為210nm;理論板數按齊墩果酸峰計算應不低於2000。
對照品溶液的製備精密稱取齊墩果酸對照品、常春藤皂苷元對照品，加甲醇製成每lml 各含0. 5mg的混合溶液，即得。
供試品溶液的製備取分清五淋丸，研細，取約10g，精密稱定，加甲醇50ml，超聲處 理功率250W，頻率50kHz30分鐘，濾過，殘渣用甲醇洗滌，合併濾液與洗液，回收溶劑至幹， 殘渣加水IO ml溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合併提取液，蒸乾，殘渣加 甲醇20 ml、鹽酸2ml，加熱水解4小時，水解物加水10 ml，用三氯甲垸振搖提取2次， 每次20ml，合併提取液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解並轉移至5ml量瓶中，加甲醇至 刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 |_J ，注入液相色譜儀，測定，即得。
分清五淋丸每lg含木通以齊墩果酸(C3 Hw03)和常春藤皂苷元(C3。H4S04)的總量計，不 得少於0. 20mg。 含量測定
木通收載於《中國藥典》2005年版一部，為木通科植物木通^ire&'a (Thunb.)
Decne.、三口十木通」Vire/^'a tr_i/bJists (Thunb.) Koidz.或白木通/4AeZ^'s tn'/bJists (Thunb.) Koidz.var. aystrah's(Diels.) Rehd.的乾燥藤莖。具有清心火，利小便，通經下乳之功效。 用於治療胸中煩熱，喉痺咽痛，尿赤，五淋，水腫，周身攣痛，經閉乳少等症，為方中主藥。 據文獻報導，木通主要含有三萜皂苷類化學成分[4]。，其皂苷元齊墩果酸、常春藤皂苷元是 中.要活性成分，閒此，我們參照《中國藥典》2005年版一部等文獻資料，對處方中木通所含 齊墩果酸和常春藤皂苷元進行了高效液相色譜法含量測定的試驗摸索，結果滿意，可作為該 藥內在質量控制指標。
1. 樣品來源由內蒙古包頭中藥有限責任公司提供(批號20050408、 20050410、 20050412、 20050503、 20050510、 20050516、 20050528、 20050601、 20050602、 20050603)。
2. 儀器與試藥美國Alltech高效液相色譜儀，M626輸液泵，UVIS-201型檢測器；齊墩果酸和常春藤皂苷元對照品由中國藥品牛物製品檢定所提供；甲醇為色譜純試劑；冰醋酸， 三乙胺均為分析純試劑；水為超純水。
3. 色譜條件Alltech RP-C,8色譜柱(5 ,， 4. 6 mmX250 mm);流動相甲醇_水-冰醋 酸-三乙胺(87 : 13 : 0. 04 : 0.02);檢測波長210 nm ;流速l.Oml/min;柱溫室溫。 4.試驗條件的選擇
丄1高效液相色譜條件的選擇
4. 1. 1檢測波長的選擇取對照品溶液，在400^190nm波長範圍內進行光譜掃描，結果 齊墩果酸、常春藤皂苷元在205nm波長處都有最大吸收，但由於205 nm處溶劑峰十擾較大， 經試驗選用210 nm為測定波長，以減少溶劑對皂苷元測定的幹擾。
4.1.2流動相的選擇參考《中國藥典》2005年版一部木通項下以甲醇-水-冰醋酸-
三乙胺(87 : 13 : 0.04 : 0.02)為流動相，其中冰醋酸可產生弱酸性環境，有利於樣品中酸
性物質的分離，既可使齊墩果酸與常春藤皂苷元得到良好的分離，又能與其他成分達到基線 分離；三乙胺可良好地改善峰形，故選擇該流動相。 4. 2樣品提取條件的選擇
分別考察了索氏提取、加熱回流提取、超聲提取等三種方法對含量的影響，結果見表l。
表l不同提取條件的測定結果
提取條件取樣量(g)含量(mg/g)
超聲提取30分鐘10. 00350. 432
加熱回流1小時10. 27630. 418
索氏提取4小時10.25680. 419
索氏提取4小時，超聲提取0. 5小時，回流提取1小時的結果基本一致，而超聲提取方法 簡單易行，且提取副產物少，所以選用超聲提取法。
5. 陰性對照試驗
取按處方量比例以相同工藝製備的陰性對照溶液(缺木通)，同法測定。測得結果為陰
性對照溶液的HPLC色譜中在與齊墩果酸和常春藤皂苷元對照品色譜中相對應的保留時間處無 色譜峰出現。表明處方中其他組分對齊墩果酸和常春藤皂苷元的測定無T擾。對照品溶液、樣
品溶液、陰性對照溶液HPLC圖譜見圖5-圖7。
6. 含量測定
6. l對照品溶液的製備精密稱取齊墩果酸對照品、常春藤皂苷元對照品，加甲醇製成每 lml各含0. 5mg的混合溶液，即得。
6.2供試品溶液的製備取分清五淋丸，研細，取約10g，精密稱定，加甲醇50ml，超聲 處理(功率250W，頻率50kHz) 30分鐘，濾過，殘渣用甲醇洗滌，合併濾液與洗液，回收溶 劑至幹，殘渣加水IO ml溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合併提取液，蒸乾， 殘渣加甲醇20 ml，鹽酸2ml，加熱水解4小時，水解物加水10 ml，用三氯甲烷振搖提取2 次，每次20 ml，合併提取液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解並定量轉移至5 ml量瓶中， 加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
6.3測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 pi ，注入液相色譜儀，測定， 即得。
7. 方法學考察
7. l線性關係考察分別精密稱取齊墩果酸對照品、常春藤皂苷元對照品，加甲醇製成每lml各含lmg的混合溶液。精密吸取該溶液0. 5、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0 ml，置5ml量瓶 中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10yl分別注入液相色譜儀，測定峰面積值。結果對 照品峰面積Y與其進樣量X (iig)之間早.良好的線性關係，線性範圍及回歸方稃見表2，回歸 曲線見圖8。
表2 標準曲線結果
成分 線性方程 線性範圍(ug)相關係數(r)
齊墩果酸 Y=06X + 3E-92304 1. 02廣10. 21 常春藤皂苷元 Y二06X+3E-90987 0.996 9.960.9992 0.9992
7.2精密度試驗精密吸取供試品(批號20050601)溶液，連續進樣5次，記錄齊墩果 酸、常春藤皂苷元峰面積積分值。結果見表3。 表3 精密度試驗結果編號12 3 45 RSD
齊墩果酸 899247894498 899302 890900897679 0.40%
常春藤皂苷元 1314273 1311855 1325533 13262471315477 0.51%
結果表明本法精密度良好。
7.3穩定性試驗精密吸取供試品(批號20050601)溶液，分別於0、 4、 8、 12小時進 樣，記錄齊墩果酸、常春藤皂苷元峰面積積分值。結果見表4。
表4 穩定性試驗結果
時間(小時)04812RSD
齊墩果酸9196689274529299849255860. 47%
常春藤皂苷元i3205381339618134278213385050. 75%
結果表明，本法在12小時內測定方法穩定。
7. 4重複性試驗:取供試品(批號:20050601) 5份，分別按[含jl測定]項下方法操作並測定含量，齊墩果酸和常春藤皂苷元總含量的平均值為0. 432mg/g， RSD為1. 20%。結果見表5。
表5重複性試驗結果(n=5)
編號雙《 (g)齊墩果酸(mg/g)常春藤皂苷元 (mg/g)總含量 (mg/g)平均植 (mg/g)RSD (%)
1 10.00350. 1800. 2530. 433
2 10.00020. 1780. 2470. 425
3 10.00580. 1780.2530.4310. 4321.20
4 10.36000. 1850. 2530. 438
5 10.45320. 1850. 2520. 437
結果表明，本法重複性較好。
7.5回收率試驗採用加樣回收法，精密稱取已知齊墩果酸和常春藤皂苷兀總含量的供試
品(批號20050601) 5份，分別精密加入齊墩果酸和常春藤皂苷元對照品，按[含量測定]方 法測定，計算回收率，結果見表6。
表6回收率試驗結果(n=5)
取樣量 (g)
成分
供試品含j (mg)
加入 (mg)
(mg)
回收率
平均 回收率(％)
RSD(%)
5.2583 齊墩果酸
0. 961
1. 811
97. 92
98. 17
0. 515. 2035 5. 2203 5. 2197 5.2884 5.2583 5,2035 5.2203 5.2197 5. 2884
常春藤皂 苷元0.9511.80197. 920.9540. 8681.80497. 920.9541.80598. 040.9661.82699. 071.3292.46698. 691.3152.742100. 431.3191. 1522.45898.871.3192.43096. 441.3362.47498. 78
98.64
1. 44
結果表明回收率均在95%~105%以內，符合方法學考察要求
7. 6樣品含量測定按上述[含量測定]項下方法操作，分別精密吸取對照品溶液與供試品 溶液各IO pi ，注入液相色譜儀，測定，即得。結果見表7。
表7 含量測定結果(n=2)
批號
取樣量(g)
含量(mg/g)
平均含量(mg/g)
10.25690.447
200506010.436
10.00280.426
2005060210.00120.425
0.436
10.30160.4472005060310.33180.446
0.437
10.00560.4282005040810.00230.436
0.434
10.11360.4332005041010.05690.454
0.441
10.13880.4292005041210.45880.464
0.445
10.00230.4272005050310.38980.414
0.413
9.92350.4122005051010.42330.453
0.453
10.35680.4542005051610.48330.447
0.438
10.00210.430
10.00050.420
200505280.421
10.00560.422
8.木通藥材中齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量測定取藥材粉末(過四號篩)2g，精密 稱定，加甲醇50 ml，超聲處理(功率250W，頻率50kHz) 30分鐘，濾過，殘渣用甲醇洗滌， 合併濾液與洗液，回收溶劑至幹，殘渣加水10 ml溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 ml， 合併提取液，蒸乾，殘渣加甲醇20ml、鹽酸2ml，加熱水解4小時，水解物加水10 ml，用 三氯甲烷振搖提取2次，每次20ml，合併提取液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解並定量轉 移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，按含量測定方法進行測定。 結果見表8。
表8 木通藥材含量測定結果取樣量 (g)齊墩果酸(％)常春藤皂苷元(％)水份 (%)總含量(％)
0.32650. 240. 167.80. 40
藥材木通中齊墩果酸和常春藤皂苷元總含量為0.40%，十批樣品中齊墩果酸和常春藤皂苷元總 含量均高於0. 2mg/g ，轉移率約為98.77%。參照《中國藥典》2005年版一部"木通"項下 齊墩果酸和常春藤皂苷元的總含量限度及市售木通藥材所含齊墩果酸和常春藤皂苷元的總含 量的不同，分清五淋丸含木通以齊墩果酸(C3 H18Q,)和常春藤皂苷元(C3晶A)的總量計，暫 定為每lg不得少於O. 2mg。
權利要求
1、一種分清五淋丸的質量標準及其檢驗方法，其特徵在於該方法中的質量標準a鑑別及b含量測定方法是以下方法的一種或幾種a鑑別顯微鑑別取分清五淋丸，置顯微鏡下觀察可見車前子、黃芩、茯苓、豬苓、黃柏、大黃、萹蓄、瞿麥、知母、澤瀉、梔子、甘草的顯微特徵；大黃的鑑別包括下列步驟取分清五淋丸0.5～1g，研細，加甲醇20～40ml，浸泡1～2小時，濾過，濾液蒸乾，殘渣加水10～20ml使溶解，再加鹽酸1～2ml，加熱回流30～40分鐘，立即冷卻，用乙醚分2～4次振搖提取，每次20～30ml，合併乙醚液，蒸乾，殘渣加三氯甲烷1～2ml使溶解，作為供試品溶液；另取大黃對照藥材0.1～0.2g，同法製成對照藥材溶液；再取大黃酸對照品，加甲醇製成每1ml含1～1.5mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各5～10μl，分別點於矽膠薄層板上，以石油醚30～60℃-甲酸乙酯-甲酸15～20∶5～7∶1～1.4的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈365nm下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的五個橙黃色螢光主斑點，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色螢光斑點，置氨蒸氣中燻後，斑點變為紅色，陰性對照無對應斑點；梔子的鑑別包括下列步驟取分清五淋丸5～10g，研細，加40～70％甲醇50～100ml，超聲處理40～60分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取梔子對照藥材1～1.5g，同法製成對照藥材溶液；再取梔子苷對照品，加乙醇製成每1ml含4～6mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各2～5μl，分別點於同一矽膠薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水5～10∶5～10∶1～2∶1～2為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以5～10％硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；黃柏的鑑別包括下列步驟取分清五淋丸2～5g，研細，加甲醇25～50ml，加熱回流30～40分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；另取黃柏對照藥材10～20mg，加甲醇1～2ml，製成對照藥材溶液；再取鹽酸小檗鹼對照品，加甲醇製成每1ml含0.5～1mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各1～2μl，分別點於同一矽膠薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水10～15∶6～15∶1～2∶1～2為展開劑，置氨蒸氣預飽和的展開缸內，展開，取出，晾乾，置紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點；黃芩的鑑別包括下列步驟取分清五淋丸5～10g，研細，加乙酸乙酯-甲醇3～6∶1～2的混合溶液50～100ml，加熱回流30～40分鐘，放冷，濾過，濾液蒸乾，殘渣加甲醇5～10ml使溶解，取上清液作為供試品溶液；另取黃芩對照藥材1～1.5g，同法製成對照藥材溶液；再取黃芩素、漢黃芩素對照品，加甲醇製成每1ml各含0.5～1mg的對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各2～4μl及上述兩種對照品溶液各1～2μl，分別點於同一聚醯胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸10～15∶3～4.51～1.5∶2～7.5為展開劑，預飽和30～40分鐘，展開，取出，晾乾，置紫外光燈下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相同的位置上，顯相同顏色的暗色斑點；b含量測定齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量測定方法包括下列步驟色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺80～95∶20～5∶0.02～0.5∶0.01～0.05為流動相；檢測波長為210nm，理論板數按齊墩果酸峰計算應不低於2000；對照品溶液的製備精密稱取齊墩果酸對照品、常春藤皂苷元對照品，加甲醇製成每1ml各含0.4～0.7mg的混合溶液，即得；供試品溶液的製備取分清五淋丸，研細，取約10～15g，精密稱定，加甲醇50～80ml，超聲處理功率250W，頻率50kHz30～40分鐘，濾過，殘渣用甲醇洗滌，合併濾液與洗液，回收溶劑至幹，殘渣加水10～15ml溶解，用水飽和正丁醇萃取3～5次，每次20～30ml，合併提取液，蒸乾，殘渣加甲醇20～30ml、鹽酸2～4ml，加熱水解4～6小時，水解物加水10～15ml，用三氯甲烷振搖提取2～4次，每次20～30ml，合併提取液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解並轉移至5～10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10～20μl，注入液相色譜儀，測定，即得；分清五淋丸每1g含木通以齊墩果酸(C30H48O3)和常春藤皂苷元(C30H48O4)的總量計，不得少於0.20mg。
2、根據權利要求1所述一種分清五淋丸的質量檢驗方法，其特徵在於該方法中的 a鑑別方法和b含量測定是以下方法的一種或幾種a鑑別顯微鑑別取分清五淋丸，置顯微鏡下觀察不規則分枝狀團塊無色，遇水合氯醛試液溶化；菌絲無色或淡棕色，直徑4 6ym;菌絲黏結成團，大多無色；草酸鈣方晶正八 面體形，直徑32 60ym;種皮內表皮細胞表面觀類長方形，壁微波狀，以數個細胞為一組，略作鑲嵌狀排列；韌皮纖維淡黃色，梭形，壁厚，孔溝細；纖維束鮮黃色，周圍細胞 含草酸鈣方晶，形成晶纖維，含晶細胞的壁木化增厚；纖維束周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶， 形成晶纖維；草酸鈣簇晶大，直徑60 140um;草酸鈣針晶成束或散在，長26 110ym; 纖維束周圍薄壁細胞含草酸鈣簇晶，形成晶纖維，含晶細胞縱向成行；葉表皮細胞平周壁 有角質線紋，氣孔不等式，副衛細胞3個；上下表皮均可見柵欄組織；薄壁細胞類圓形， 有橢園形紋孔，集成紋孔群；內皮層細胞垂周壁波狀彎曲，較厚，木化，有稀疏細孔溝； 種皮石細胞黃色或淡棕色，多破碎，完整著長多角形、長方形或不規則形，壁厚，有大的 圓形紋孔，胞腔棕紅色；大黃的鑑別取分清五淋丸O. 5g，研細，加甲醇20ml，浸泡1小時，濾過，濾液蒸 幹，殘渣加水10ml使溶解，再加鹽酸lml，加熱回流30分鐘，立即冷卻，用乙醚分2次 振搖提取，每次20ml，合併乙醚液，蒸乾，殘渣加三氯甲垸lml使溶解，作為供試品溶 液；另取大黃對照藥材0. lg，同法製成對照藥材溶液；再取大黃酸對照品，加甲醇製成 每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各5ul， 分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的矽膠H薄層板上，以石油醚30 6(TC-甲酸乙 酯-甲酸15 : 5 : 1的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈365nm下檢視； 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的五個橙黃色螢光主斑點；在與 對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色螢光斑點，置氨蒸氣中燻後，斑點變為紅色；梔子的鑑別取分清五淋丸5g，研細，加5(m甲醇50ml，超聲處理40分鐘，濾過， 濾液作為供試品溶液；另取梔子對照藥材lg，同法製成對照藥材溶液；再取梔子苷對照 品，加乙醇製成每lml含4mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取上述三 種溶液各2ul，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水5:5:i:i為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以10%硫酸乙醇溶液，在11(TC加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；黃柏的鑑別取分清五淋丸2g，研細，加甲醇25ml，加熱回流30分鐘，濾過，濾液 作為供試品溶液；另取黃柏對照藥材50mg，加甲醇5ml，同法製成對照藥材溶液；再取鹽 酸小檗鹼對照品，加甲醇製成每lml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法試 驗，吸取上述三種溶液各1 U 1，分別點於同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水io : 6 : l : l為展開劑，置氨蒸氣預飽和的展開缸內，展開，取出，晾乾，置紫外光燈(365nm)下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜及對 照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點；黃芩的鑑別取分清五淋丸5g，研細，加乙酸乙酯-甲醇3 : 1的混合溶液50ml，加 熱回流30分鐘，放冷，濾過，濾液蒸乾，殘渣加甲醇5ml使溶解，取上清液作為供試品 溶液；另取黃芩對照藥材lg，同法製成對照藥材溶液；再取黃芩素、漢黃芩素對照品， 加甲醇製成每lml各含0.5mg的對照品溶液；照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液、對照 藥材溶液各2nl及上述兩種對照品溶液各lul，分別點於同一聚醯胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸io : 3 : i : 2為展開劑，預飽和30分鐘，展開，取出，晾乾，置紫外光燈365nm下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相同的位置上，顯 相同顏色的暗色斑點；b含量測定齊墩果酸和常春藤皂苷元的含量測定照高效液相色譜法中國藥典2005年版一部附錄VI D測定，色譜條件與系統適用性試驗以十八垸基矽垸鍵合矽膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺87 : 13 : 0. 04 : 0. 02為流動相；檢測波長為210nm;理論板數按齊墩果酸峰計算應不低於2000;對照品溶液的製備精密稱取齊墩果酸對照品、常春藤皂苷元對照品，加甲醇製成 每lml各含0.5mg的混合溶液，即得；供試品溶液的製備取分清五淋丸，研細，取約10g，精密稱定，加甲醇50ml，超 聲處理功率250W，頻率50kHz30分鐘，濾過，殘渣用甲醇洗滌，合併濾液與洗液，回收 溶劑至幹，殘渣加水IO ml溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合併提取液， 蒸乾，殘渣加甲醇20ml、鹽酸2ml，加熱水解4小時，水解物加水10 ml，用三氯甲烷 振搖提取2次，每次20ml，合併提取液，回收溶劑至幹，殘渣加甲醇溶解並轉移至5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10pl ，注入液相色譜儀，測定， 即得；分清五淋丸每lg含木通以齊墩果酸(C3。H4803)和常春藤皂苷元(C3。H4804)的總量計， 不得少於0. 20mg。
全文摘要
本發明屬於中藥技術領域，具體說是一種分清五淋丸的質量標準及其檢驗方法，原分清五淋丸的質量標準只有顯微鑑別和檢查項，本發明進行各項試驗摸索後，增加了大黃、梔子、黃柏、黃芩的薄層鑑別，並對該製劑進行了重金屬及砷鹽的考察，其測定結果低於常規限度，同時對處方中木通所含齊墩果酸和常春藤皂苷元進行了含量測定的試驗摸索，對處方中木通所含齊墩果酸和常春藤皂苷元建立了高效液相含量測定方法，提高了質量標準，加強了該藥的質量可控性，保證了患者服用的有效性，通過本發明增加的質量控制，結果滿意，提高了原標準，使得產品質量更加可控，同時更利於產品工業化生產要求，有利於本產品的工業化生產的監控。
文檔編號A61K36/8964GK101444589SQ20081013772
公開日2009年6月3日 申請日期2008年7月11日 優先權日2008年7月11日
發明者於得才, 朱賀年, 麗 楊, 賈金良 申請人:包頭中藥有限責任公司