牛蛙抗菌肽temporin-La及其基因和在製藥中的應用的製作方法

2023-04-26 03:02:46 3

專利名稱：：牛蛙抗菌肽temporin-La及其基因和在製藥中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種牛蛙抗菌肽temporin-La及其基因和在製藥中的應用，屬於生物醫學
技術領域：
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背景技術：
：抗菌肽作為一種全新概念的、廣譜抗菌蛋白類抗生素將具有比傳統抗生素更加廣闊的市場前景,有希望成為新一代抗菌劑，其研製目前受到廣泛重視。目前已從不同的無尾目動物皮膚中分離到300多條不同的抗菌肽，並且其數目還在增加。來自中國科學院昆明動物研究所生物毒素系的研究人員在CWorra朋gm/wmK無指盤臭蛙，一種兩棲動物)中發現了107種新型的抗菌肽(antimicrobialpeptides),並進行了抗菌機制研究，這比目前報導的兩棲類抗菌肽數目多了三倍，是迄今為止發現的最豐富的抗菌肽資源，這也為抗菌機制研究提供了重要信息。在中國，很多兩棲類動物被作為傳統中藥和民族藥物而廣泛應用，如中華蟾蜍(Sw/ogorg"hz""力等。這些兩棲類動物的皮膚和內臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報導藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮痛、局部麻醉、免疫調節、心血管系統作用等。據國內外文獻報導，已從各種生物來源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進入臨床治療。例如將esculentin-l基因轉入到菸草中，在其體液中檢測到有活性的esculentin-l的存在，同時這種植物對細菌以及真菌的抵抗力明顯增強；從爪蟾(J^w;7附/從w力皮膚分泌液獲得的抗菌肽Magainin具光譜抗微生物作用,同時具有抗腫瘤活性,在美國已獲準作為廣譜抗菌藥物,其基因工程產品已進入三期臨床。我國對兩棲類藥物的應用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質的研究主要集中於生物鹼等有機小分子，對其皮膚活性肽類物質的研究不多。發明人將本發明的牛蛙抗菌肽全序列胺基酸結構經蛋白質資料庫進行比對，未發現有任何相同多肽。
發明內容本發明的目的在於提供一種牛蛙抗菌肽temporin-La，為一種新的牛蛙抗菌肽，具有藥理活性。本發明還進一步提供了牛蛙抗菌肽temporin-La在製藥中的應用，製備病原微生物感染疾病的治療藥物和腫瘤治療藥物。為了實現本發明的目的，本發明提供如下技術方案-牛蛙抗菌肽是由無尾兩棲類牛蛙抗菌肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量為1623.08道爾頓，等電點為9.70，多肽全序列一級結構為LeuLeuArgHisValValLyslieLeuGluLysTyrLeu-AMIDAT翻。牛蛙抗菌肽基因的克隆包括牛蛙皮膚總RNA的提取，mRNA的純化，mRNA的反轉錄及cDNA文庫構建，設計引物利用PCR方法篩選牛蛙抗菌肽基因。擴增引物長度為20個核苷酸，其序列為-A丁GTTCACCWTGAAGAAATC-3'，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNALibraryConstructionKit中的5'PCRPrimer引物，其序列為5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3'。所獲陽性單克隆進行核苷酸序列測定。測序結果表明牛蛙抗菌肽的基因由324個核苷酸組成，自5'端至3'端序列為-ttttgtgaggaagagaggLgatgtcgatcaagatgaaagaagagatgatccaggtgaaagg120aatgttcaagtggaaaaacgattgttacgacatgttgtsaagattctcgaaaa^tatttg180ggaaaataaccagaaatgttgaaactttgaaaatggaattggaaatcatttgatgtggaa240tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaaaataMtaaatatgttgcaaaaa300犯aaa3犯犯a^犯犯犯a^犯a324編碼牛蛙成熟抗菌肽為第142-180位核苷酸，其胺基酸序列為LeuLeuArgHisValValLysHeLeuGluLysTyrLeu—AMIDATION牛蛙抗菌肽基因作為基因工程製備牛蛙抗菌肽的應用。牛蛙抗菌肽的製備方法根據編碼牛鮭抗菌肽的基因推斷牛蛙抗菌肽的胺基酸序列，用自動多肽合成儀APEX396合成其全序列。通過HPLC反相d8柱層析脫鹽、純化。然後用高效液相色譜HPLC方法鑑定其純度，分子量測定採用快原子轟擊質譜法，等電聚焦電泳測定等電點，用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。下述的藥理實驗證實了牛蛙抗菌肽具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用，可以作為製備病原微生物感染疾病的治療藥物被應用。1、牛蛙抗菌肽抑制細菌生長的作用抗菌活性檢測，測定最小抑菌濃度(MIC)時，採用二倍稀釋法進行抗菌檢測。以4LB液體培養基作為培養介質。將過夜培養的標準菌株用LB培養基稀釋菌落成每毫升含105細菌的菌液，將菌液接種於LB液體培養基，細菌最終濃度為105。在96孔細胞培養板上加入90pLLB培養基中，加入經0.22pm孔徑膜過濾的溶解於生理鹽水的牛蛙抗菌肽樣品10pL作為第一孔,混勻後取50|aL加入第2管，依次倍比稀釋，自第9孔吸出5(HiL棄去，第10管系對照管，每個樣品重複兩次。細菌菌株均為吉林大學畜牧獸醫學院微生物與免疫實驗室保存，結果如表1.表l，牛蛙抗菌肽的抑菌活性tableseeoriginaldocumentpage5由表1可見，合成的牛蛙抗菌肽具有顯著的抑制細菌生長的作用。2.牛蛙抗菌肽抑制真菌生長的作用抗真菌活性檢測採用杯碟法,培養基採用改良沙保氏(Sabousand)。採用二倍稀釋法進行抗菌活性檢測。在96孔細胞培養板上加入90^L沙保氏培養基中，加入經0.22pm孔徑膜過濾的溶解於生理鹽水的牛蛙抗菌肽樣品10^iL作為第一孔,混勻後取50nL加入第2管，依次倍比稀釋，自第9孔吸出50pL棄去，第10管系對照管，每個樣品重複兩次。白色念珠菌為吉林大學畜牧獸醫學院微生物與免疫實驗室保存，結果如表2.表2.牛蛙抗菌肽抑制真菌生長的作用tableseeoriginaldocumentpage5由表2可知，牛蛙抗菌肽具有抑制真菌生長的作用。本發明的有益效果在於-由牛蛙抗菌肽編碼基因推導其胺基酸結構，合成一種新的牛蛙抗菌肽，具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用，該牛蛙抗菌肽具有結構簡單、人工合成方便、抗菌譜系廣的有益特點，可以作為製備治療病原微生物感染疾病的藥物被應用。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容並不局限於此。實施例1:牛蛙抗菌肽基因克隆I.牛蛙皮膚總RNA提取A.活體牛蛙用雙蒸水清洗乾淨，滅菌針從牛蛙的延髓腔致癱，取50100mg牛蛙皮膚組織放入幹烤過的研缽中，加入1mLTRIZOLReagent(Invitrogen公司產品)迅速在冰水浴中研磨。B.充分混勻後,移入1.5mL離心管中(DEPC管)1530°C放置5min,加入等體積氯仿，旋渦混勻15s，4°C,12000xg離心15min。C.取上清加入500pL異丙醇,1530。C放置5min，旋渦15s混勻,4°C,12000xg離心10min。棄上清,加入1mL75%乙醇漂洗沉澱,7500xg離心5min,重複1次。超淨工作檯中乾燥90s，用30nLRNase-freewater溶解,即得到牛蛙皮膚組織總RNA。II.牛蛙皮膚mRNA分離純化採用操作步驟按照德國QIAGEN公司的OligotexmRNAMiniKit試劑盒說明書進行。III.牛蛙皮膚cDNA文庫的構建採用CLONTECH公司的CreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit文庫構建試劑盒。A.cDNA第一鏈合成(raRNA反轉錄)1.在05mL無菌的離心管加入lnL牛蛙皮膚mRNA、1uLSMARTIV寡聚核苷酸、lnLCDSlll/3'PCR引物，加2pL去離子水使總體積達到5pL。2.混勻離心管中的試劑並短暫離心，72°C保溫2分鐘。3.將離心管在冰上孵育2分鐘。4.在離心管中加入以下試劑2pL5X第一鏈緩衝、l.OuL20mM二硫蘇糖醇、1.0nLdNTP(10mM)混合物、1.0Powerscript反轉錄酶。5.混合離心管中試劑並短暫離心，在42°C保溫1小時。6.將離心管置於冰上中止第一鏈的合成。7.從離心管取2pL所合成的cDNA第一鏈備用。B.採用長末端聚合酶鏈式反應(LD-PCR)方法擴增第二鏈1.95°C預熱PCR儀。2.將2pLcDNA第一鏈(mRNA反轉錄)、80pL去離子水、1(^L10*Advantage2PCR緩衝液、2pL50*dNTP混合物、2pL5'PCR引物、2pLCDS111/3'PCR引物以及2nL50*Advantage2PolymeraseMix離心管進行反應。3.在PCR儀中按以下程序擴增①95°C1分鐘；②22個循環95°C15秒鐘，68°C復性6分鐘。4.循環結束後，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行純化。C.cDNA雙鏈的純化1.蛋白酶K的消化在一個0.5mL的試管中加入50yL經擴增得到的雙鏈cDNA(2-3ug)產物，然後向其中加入2uL的蛋白酶K(20ug/uL)。注意用蛋白酶K處理抑制DNA聚合酶的活性是非常必要的。該系統在操作過程中經過優化最佳的PCR產物cDNA的量為2-3ug(50uL體系)。過多的雙鏈cDNA會降低文庫的效價。2.顛倒混勻，45'C，20分鐘。3.加50uL去離子水。4.加100uL苯酚:氯仿:異戊醇，連續輕柔的顛倒混合1-2分鐘。5.14,000rpm，5min，使其兩相分離。6.將上層(水相)移入潔淨的0.5ml的試管(棄去界面和下層液體)7.加100ul氯仿:異戊醇，連續輕柔的顛倒混合l-2分鐘。8.14,000rpm，5min，使其兩相分離。9.將上層(水相)移入潔淨的0.5ml的試管(棄去界面和下層液體)10.加入3MNaAc醋酸鈉10"L、Glycogen糖原(20ug/ul)1.3uL、95%乙醇(室溫)260uL，14，OOOrpm，室溫離心20分鐘。注意在離心之前不要對樣品進行-20'C預冷或者冰浴，對離心管的冷卻將導致樣7品和雜質一起沉澱。11.用槍小心的移去上清，槍頭不要碰到析出物，用100uL80^的乙醇清洗析出物。12.蒸發乙醇，在空氣中乾燥析出物，加去離子水懸浮析出物。D.大腸桿菌DH5a感受態細胞的製備1.挑取大腸桿菌DH5a單菌落劃線接種在新鮮LB瓊脂平板上，37°C過夜。挑取單菌落接種到25mL的LB液體培養基中。2.以220-225rpm37。C振搖過夜。取10mL過夜培養物接種到1LLB中。在37'C劇烈振搖培養直到OD6(X)達到0.5-0.7，冰浴lh。3.把菌液轉移到滅菌的預冷的離心瓶中。以4000rpm(2800xg)4°C,15min。去上清液，瓶子放在冰上。輕輕地用1L冰預冷的10%甘油重懸沉澱。4.4000rpm(2800xg)4'C，15min，輕輕地用0.5L冰預冷的10%甘油重懸沉澱。5.4000rpm(2800xg)4'C，15min，輕輕地用250mL冰預冷的10%甘油重懸沉澱。6.4000rpm(2800xg)4°C，15min。用甘油重懸使最終體積達3.5mL。細菌密度大約為3xlW細胞/mL。等體積分裝為100nL/份，迅速放於乾冰中。在-8(TC貯存感受態細胞。7.用超螺旋載體如Pucl9進行轉化驗證感受態。應產生至少0.5-lxlOlcfu4ig的細胞。E.連接以及連接產物的轉化1.在微量離心管中加入0.3pLTaKaRapMD18-T載體、2.2pL牛蛙cDNA雙鏈溶液、加入2.5pL的Solutionl，全量為5pL。2.16'C連接過夜.3.全量(5pL)加入至10(^LDH5a感受態細胞中，冰浴30分鐘。5.42'C熱擊90秒鐘後，冰浴2分鐘。6.加入LB培養基800nL，37'C緩慢振蕩培養(60-80轉/min)45-60分鐘。7.取200pL塗布於含有Amp+的LB培養基上37°C培養16小時，形成單菌落。8.每個LB平皿用5mLLB液體培養基洗滌菌落，加30%甘油凍存。構建的cDNA文庫大約含lx106個單獨克隆。IV.牛蛙抗菌肽基因克隆篩選擴增引物長度為20個核苷酸，其序列為5'-ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3'，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTcDNALibraryConstructionKit中的5'PCRPrimer引物，其序列為5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3'。PCR反應條件如下94°C30秒，50°C30秒，72°C2分鐘，共35循環，72°C10分鐘。V.牛蛙抗菌肽基因序列測定和結果提取質粒並用M13+與M13-測序，儀器為ABIPRISM3730全自動核苷酸序列測定儀，基因測序結果自5'端至3'端序列為atgttccccttgaagaaatccctgttactcctttttttccttgggaccatcaacttatct60ttttgtgagg犯gagagagatgtcgatca^gatg3aaga^gagatgatccaggtg犯agg120aatgttcaagtggaa肌acgattgttaLCgacatgttgtaaagatl:ctcgaaaaata1:ttg180ggaaaataaccagaaatgttgaaactttgaaaatggaattggaaatcatttgatgtggaa240324牛蛙抗菌肽基因核苷酸的序列表為序列長度為324個鹼基，序列類型核酸，鏈數單鏈，序列種類CDNA，來源牛蛙皮膚編碼牛蛙成熟肽抗菌肽為第142-180位核苷酸，其胺基酸序列為LeuLeuArgHisValValLyslieLeuGluLysTyrLeu-AMIDATION合成的牛蛙抗菌肽具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用，可以作為製備病原微生物感染疾病的治療藥物被應用。實施例2:製備牛蛙抗菌肽I、樣品的製備方法根據編碼牛蛙抗菌肽的基因推斷牛蛙抗菌肽的胺基酸序列，用自動多肽合成儀APEX396合成其全序列。通過HPLC反相C^柱層析脫鹽、純化。II、分子量測定採用電噴霧電離(electrosprayionization,ESI),發射電壓為4.5Kv。III、純化的牛蛙抗菌肽用高效液相色譜HPLC方法鑑定其純度(流速l.Oml/min;流動相乙腈+水+TFA0.01。/。，梯度洗脫；色譜柱C,s，檢測波長220nm)，分子量測定採用快原子轟擊質譜法，等電聚焦電泳測定等電點，用自動胺基酸測序儀測定胺基酸序列結構。9牛蛙抗菌肽是由無尾兩棲類動物牛蛙抗菌肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量分別為1623.08道爾頓，等電點為9.70，多肽全序列一級結構為亮氨酸一亮氨酸—精氨酸一組氨酸一纈氨酸一纈氨酸一賴氨酸一異亮氨酸一亮氨酸一穀氨酸一賴氨酸一酪氨酸一亮氨酸一醯胺化(LeuLeuArgHisValValLyslieLeuGluLysTyrLeu-AMIDATION)。權利要求1、一種牛蛙抗菌肽temporin-La，其特徵在於為牛蛙抗菌肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量分別為1623.08道爾頓，等電點為9.70，多肽全序列一級結構為LeuLeuArgHisValValLysIleLeuGluLysTyrLeu-AMIDATION。2.—種牛蛙抗菌肽temporin-La基因的核苷酸序歹iJ，其特徵在於cDNA由324個核苷酸組成，其自5'端至3'端序列為ttttgtggLggaagagagagatgtcgatc犯gatga幼gaagagatga1xcaggtgaBagg120aatgttcaagtgg犯a犯cgattgttacgacatgttgta犯gattctcgaaa^eiteit1:tg180ggaaaatEtaccagaaatgttgaaactttga^aatggaattggaaatcatttgatgtggaa240tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaaaataaataaatatgttgcaaaaa300333aaa^aaaa333aa8a^aaa333之鬥。3.權利要求2所述的牛蛙抗菌肽基因核苷酸序列，其特徵在於，編碼牛蛙成熟抗菌肽為142-180位核苷酸，其胺基酸序列為LeuLeuArgHisValValLyslieLeuGluLysTyrLeu-AMIDATION。4.權利要求1所述的牛蛙抗菌肽temporin-La，在製備治療病原微生物感染疾病的藥物和腫瘤藥物的應用。全文摘要本發明提供一種牛蛙抗菌肽temporin-La及其基因和在製藥中的應用，屬於生物醫學領域。本發明的牛蛙抗菌肽基因是從構建的牛蛙皮膚cDNA文庫中篩選得到的，分子量為1623.08道爾頓，等電點為9.70，多肽全序列一級結構為LeuLeuArgHisValValLysIleLeuGluLysTyrLeu-AMIDATION。編碼牛蛙抗菌肽的基因由324位核苷酸，其中編碼成熟肽的為第142-180位核苷酸。人工合成的牛蛙抗菌肽具有明顯的抑制細菌和真菌生長的作用，及無溶血活性的優點，可以作為製備治療病原微生物感染疾病的藥物被應用。文檔編號C07K7/00GK101475630SQ200810051638公開日2009年7月8日申請日期2008年12月22日優先權日2008年12月22日發明者新馮,孫長江,趙瑞利,雷連成,韓俊友,韓文瑜申請人:吉林大學