菊花水孔蛋白編碼基因CmAQP及其植物表達載體和構建方法

2023-04-26 03:10:41

專利名稱：菊花水孔蛋白編碼基因CmAQP 及其植物表達載體和構建方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及菊花水孔蛋白編碼基因CmAQP及其植物表達載體和構建方法。
背景技術：
菊花是世界四大切花之一，切花菊約佔世界切花總量的30%，在花卉產業中佔據重要的地位。隨著菊花產業化的快速發展，其設施栽培面積不斷增加，土壤鹽潰化逐漸成為菊花周年供應的主要限制因素。然而目前的土壤改良措施存在著許多不足，同時巨大的水資源消耗也成為當前菊花產業發展的瓶頸。菊花抗逆育種一直是國內外園藝工作者致力的重要課題之一。 水孔蛋白作為一種功能性跨膜輸水蛋白，對植物體形成水選擇性運輸通道並實現水分的跨膜運輸起到重要的作用。當植物處於鹽、乾旱、低溫等逆境脅迫狀態時，體內的水分平衡被打破，水孔蛋白在水分運輸和胞內滲透壓的調控等方面表現出重要作用。研究表明，植物種子的萌發過程中，伴隨細胞質滲透勢的改變，需要迅速調節滲透勢從而達到滲透平衡以提供最佳的發育環境，AQPs在調節滲透平衡中起著非常重要的作用，如轉人參PgTIPl基因的擬南芥的發育速度遠高於野生擬南芥發育速度(Lin et al.，2007)。鹽脅迫可降低根的水分輸導能力，Zhu等研究表明，200mmol/L NaCl鹽脅迫處理24h後可抑制玉米水孔蛋白基因ZmPIPs和ZmTIPs的表達，且葉片含水量快速、持續下降(Zhu et al.，2005)。迄今，鹽脅迫對AQP的表達調控研究主要集中在PIPs和TIPs等亞類，並推測PIPs與TIPs可能通過轉錄調節協同微調水分的跨膜運輸，進而維持鹽脅迫和高滲條件下的水分平衡(Shao et al.，2008)。在作物的遺傳轉化途徑中，農桿菌介導法是應用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達載體至關重要。將抗逆基因基因構建植物表達載體，用於農桿菌介導的植物遺傳轉化，可獲得具有耐逆特性的新種質。對於優良作物新品種的培育及在生產中的廣泛應用具有重要意義。[I]Zhu C F，Schraut D, Hartung W. (2005). Differential responses ofmaizeMIP genes to salt stress and ABA. J Exp Bot. 56(421):2971-2981.[2] Lin W, Peng Y，Li G，et al. (2007). Isolation and functionalcharacterization of PgTIPl，ahormone—autotrophic cells—specific tonoplastaquaporin in ginseng. J ExP Bot.58:947-956.[3] Shao H B，Chu L Y，Shao M A et al. (2008). Advances in functionalregulation mechanisms of plant aquaporins:Their diversity, gene expression, Iocalization,structure and roles in plant soi1-water relations(Review). Mol MembrBiol. 25(3) :179-191.

發明內容
本發明為解決提高植物耐逆性的問題，提供一個新的菊花『神馬』抗逆基因CmAQP。本發明還提供該抗逆基因CmAQP的植物表達載體及其構建方法。所構建的植物表達載體可直接用於農桿菌介導的作物遺傳轉化，創製耐鹽新種質，可用於植物品種改良。本發明的技術問題可通過如下技術方案解決菊花『神馬』抗逆基因CmAQP，該基因的序列為SEQ ID NO. I。菊花『神馬』抗逆基因CmAQP的植物表達載體，由本發明所述的菊花『神馬』抗逆 基因CmAQP與中間植物表達載體pCAMBIA 1301構成。菊花『神馬』抗逆基因植物表達載體，其構建方法如下I)菊花『神馬』抗逆基因CmAQP的克隆以『神馬』幼嫩葉片為材料，提取總RNA，反轉錄為cDNA，設計引物擴增CmAQP基因，上遊弓丨物CmAQP-F: 5' -ATGACTAAAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 2)下遊引物CmAQP-Rj' -CAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 3)以反轉錄的cDNA為模板，進行聚合酶鏈式PCR反應，產物連接到pMD19-T Simple載體，轉化T0P10感受態細胞，進行序列測定；2)植物表達載體pCAMBIA 1301-CmAQP的構建設計引物以菊花『神馬』 cDNA為模板，用高保真酶進行PCR反應，在CmAQP基因的上遊和下遊分別引入BamH I和Xba I酶切位點，上遊弓 I 物 CmAQP-TF: 5' -CGGGATCCATGACTMAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 4)下遊引物CmAQP-TR:5'-GCTCTAGACAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 5)PCR產物連接到pMD19-T Simple載體，轉化T0P10感受態細胞，提取陽性質粒，BamH I和Xba I雙酶切的CmAQP片段與BamH I和Xba I雙酶切的pCAMBIA 1301連接轉化，提取陽性質粒，酶切電泳檢測並測序驗證，植物表達載體pCAMBIA 1301-CmAQP構建成功。本發明所述的菊花『神馬』抗逆基因CmAQP在創製耐鹽新種質和/或植物品種改良中的應用。本發明所述的菊花『神馬』抗逆基因CmAQP植物表達載體在創製耐鹽新種質和/或植物品種改良中的應用.CmAQP的植物表達載體用於農桿菌介導的植物遺傳轉化，提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發率，方法如下農桿菌菌株EHA105感受態製備及凍融法轉化擬南芥花序浸染及種子篩選PCR鑑定及耐鹽性評價本發明的有益效果I.本發明提供的菊花『神馬』CmAQP是一個新的抗逆基因，該基因可提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發率。2.本發明構建的菊花『神馬』CmAQP基因植物表達載體為首次報導，可直接用於農桿菌介導的遺傳轉化，創製耐鹽新種質，提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發率，可進行植物品種改良。


圖I為CmAQP瓊脂糖凝膠電泳分析M DNA MarkerI :CmAQP ；2 :pMD19_T Simple-CmAQP 質粒 BamH I 和 Xba I 雙酶切；3 pCAMBIA 1301-CmAQP 表達載體 BamH I 和 Xba I 雙酶切檢測2植物表達載體pCAMBIA 1301-CmAQP構建方法示意3野生型與轉基因擬南芥PCR鑑定圖4野生型與轉基因擬南芥種子鹽脅迫下的萌發率評價
具體實施例方式實施例I. CmAQP的克隆選用菊花『神馬』作為材料，取0.05g幼嫩葉片，參照Trizol RNA提取試劑盒(TaKaRa)說明書方法，提取葉片總RNA，按照M-MLV反轉錄試劑盒(TaKaRa)取I y g總RNA反轉錄成cDNA,用RNase消化cDNA產物,參照菊花CmAQP序列信息,經Primer 5軟體分析設計引物擴增CmAQP ；上遊弓丨物CmAQP-F: 5' -ATGACTAAAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 2)下遊引物CmAQP-Rj' -CAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 3)以提取的葉片cDNA為模板，進行PCR反應，50 ii L 反應體系10 X RCR Buffer 5. 0 u L, dNTP mix 4. 0 u L (2. 5mmol L-1)，CmAQP-F、CmAQP-R 弓丨物各 LOyL (20 u mo I L-1)，Taq DNAPolymerase 0. 2 u L, cDNA模板I y L，ddH2037. 8 ii L ;反應程序95 °C預變性4min，然後94 °C解鏈30sec，55 °C退火30sec，72°C延伸Imin 30sec，反應35個循環，72°C延伸IOmin ;PCR產物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收純化，用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接到pMD19_T Simple載體(TaKaRa)，轉化T0P10感受態細胞，進行序列測定，CmAQP序列如SEQ ID NO. I所示。實施例2.植物表達載體pCAMBIA 1301_CmAQP的構建設計引物進行PCR反應，在目的基因CmAQP的上遊和下遊分別引入酶切位點BamHI和Xba 1沖0 產物連接到？1 191 Simple載體，轉化T0P10感受態細胞，提取陽性質粒，BamHI和Xba I雙酶切的CmAQP片段與BamH I和Xba I雙酶切的pCAMBIA 1301連接轉化，提取陽性質粒，酶切電泳檢測並測序驗證(圖I)。上遊弓丨物CmAQP-TF: 5' -CGGGATCCATGACTMAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 4)下遊引物CmAQP-TR:5'-GCTCTAGACAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 5)①以菊花『神馬』葉片cDNA作為模板，用高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase, TaKaRa)進行 PCR 反應，50 y L 反應體系10XHS RCR Buffer 5. 0 u L,CmAQP-TF、CmAQP-TR 引物各 I. Ou L(20umol L-1)，dNTP mix 4. Ou L(2. 5mmol L-1)，PrimeSTAR HS DNA PolymeraseO. 4u L, cDNA 模板 I y L, ddH20 37. 6 u L ;反應程序95°C預變性4min，然後94°C解鏈30sec，55°C退火30sec，72°C延伸Imin 30sec,反應30個循環，72°C延伸IOmin ;PCR產物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN，USA)回收，連接到pMD19_T Simple載體，轉化T0P10感受態細胞，提取陽性質粒pMD19-T Simple-CmAQP ；②取載體pCAMBIA 1301 (Invitrogen, USA)和 pMD 19-T Simple-CmAQP 用 BamH I和 XbaI 雙酶切，雙酶切體系(50 ii L) :10 X H Buffer 5u L,pMD19-T Simple-CmAQP 15 u L,BamH I 2 u L, Xba I 2 u L, ddH20 26 u L ;37°C反應3h ;雙酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收質粒pCAMBIA 1301大片段和pMD19_T Simple-CmAQP小片段。用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接兩個回收的產物，連接反應體系(10 y L)IOXT4IigaseBuffer IuL, pCAMBIA 1301 大片段 2 y L，pMD19_T Simple-CmAQP 小片段6uL, T4DNA連接酶IuL ;16°C過夜連接反應，取5 ii L連接產物轉化TOPlO感受態細胞。37°C過夜培養，挑取陽性單克隆擴大培養，提取質粒pCAMBIA 1301-CmAQP,進行酶切和測序驗證。植物表達載體pCAMBIA 1301-CmAQP的構建成功(圖2)。實施例3.植物表達載體pCAMBIA 1301-CmAQP遺傳轉化擬南芥及其耐鹽性鑑定①農桿菌菌株EHA105感受態製備及凍融法轉化從YEB (50ug/mL利福平)平板上挑取EHA105單菌落，接種於50mL含50ug/mL利福平的YEB液體培養基中，200rpm，28°C培養至OD值0. 5，而後冰浴菌液30min，離心收集菌 體，懸浮於2mL預冷的的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200uL/管分裝，待用。取IOuL pCAMBIA 1301-CmAQP載體質粒，加入200uL農桿菌EHA105感受態細胞，冰浴30min，液氮冷凍5min，37°C 5min,加入800uLYEB液體培養基，28°C 200rpm預培養4h，菌液塗板於YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那黴素)固體培養基上，28°C暗培養2天，挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用於擬南芥花序轉化。②擬南芥花序浸染及種子篩選將陽性單克隆接到50mL的YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那黴素)液體培養基中，培養24小時，5000rpm離心20分鐘，然後用轉化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，調pH為5. 8，然後加200uL/L的Silwet L-77混合)劇烈懸浮沉澱至完全懸起。將擬南芥地上部分直接浸泡於上述懸浮液中I分鐘，然後用保鮮膜完全包裹植株以保溼，放回培養室培養12小時，打開保鮮膜，待種子成熟時米收。種子消毒與播種將種子放入2mL的離心管中，加入ImL 75%酒精，添加0. 1%的TritonX-IOO搖晃15分鐘，然後在超淨臺中用95%的酒精洗兩次，而後直接把種子連同酒精倒在滅菌過的濾紙上，以吹乾種子(放置30分鐘)，輕輕敲擊濾紙將幹種子均勻撒播到篩選培養基上(l/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨苄青黴素)篩選培養10天，然後將抗性苗移栽到土中，用透明的蓋子覆蓋幼苗I周以保溼。③PCR鑑定及耐鹽性評價待抗性苗7 8片葉，提取擬南芥葉片DNA，進行PCR (引物CmAQP-F和CmAQP-R)鑑定(圖3)。經PCR鑑定的T1代轉基因苗繼續生長，採收T2代種子。對野生型和T2代抗性轉基因擬南芥種子進行鹽脅迫處理(200mM NaCl),比較抗鹽性，發現轉基因擬南芥萌發率(47. 92%)高於野生型擬南芥(26. 53%)(圖4)。綜上所述，本發明構建了含有抗逆基因的植物表達載體pCAMBIA 1301-CAQP，其中CmAQP為首次報導。所構建的載體可導入植物中，提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發率。
權利要求
1.菊花『神馬』抗逆基因CmAQP，其特徵在於該基因的序列為SEQID NO. I。
2.菊花『神馬』抗逆基因CmAQP植物表達載體，其特徵在於由權利要求I所述的菊花 『神馬』抗逆基因CmAQP與植物表達載體構成。
3.根據權利要求2所述的菊花『神馬』抗逆基因CmAQP植物表達載體，其特徵在於所述 的植物表達載體為BamH I和Xba I雙酶切CmAQP後插入到表達載體pCAMBIA 1301質粒 進行重組反應得到。
4.權利要求3所述的菊花『神馬』抗逆基因CmAQP植物表達載體的構建方法，其特徵在 於包括如下步驟設計引物以菊花『神馬』 cDNA為模板，用高保真酶進行PCR反應，在CmAQP基因的上遊 和下遊分別引入BamH I和Xba I酶切位點，上遊引物 CmAQP-TF: SEQ ID NO. 2下遊引物 CmAQP-TR: SEQ ID NO. 3PCR產物連接到pMD19-T Simple載體，轉化T0P10感受態細胞，提取陽性質粒，BamH I 和Xba I雙酶切的CmAQP片段與BamH I和Xba I雙酶切的pCAMBIA 1301連接轉化，提取 陽性質粒，酶切電泳檢測並測序驗證，植物表達載體pCAMBIA 1301-CmAQP構建成功。
5.權利要求I所述的菊花『神馬』抗逆基因CmAQP在創製耐鹽新種質和/或植物品種 改良中的應用。
6.權利要求2所述的菊花『神馬』抗逆基因CmAQP植物表達載體在創製耐鹽新種質和 /或植物品種改良中的應用。
全文摘要
本發明屬於分子生物學領域，公開了菊花水孔蛋白編碼基因CmAQP及其植物表達載體和構建方法。本發明所構建的表達載體pCAMBIA 1301-CmAQP是由CmAQP基因插入到克隆載體pMD19-T simple vector，經BamH I和Xba I雙酶切後連接到載體pCAMBIA 1301的BamH I和Xba I位點而得到的重組質粒。將該植物表達載體用於植物遺傳轉化，CmAQP基因在CaMV35S啟動子的啟動下超量表達，大量合成CmAQP蛋白，從而提高擬南芥種子鹽脅迫下的萌發率。
文檔編號A01H5/00GK102660557SQ20121017152
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者劉兆磊, 劉浦生, 房偉民, 李佩玲, 滕年軍, 王紅賓, 管志勇, 蔣甲福, 陳發棣, 陳素梅 申請人:南京農業大學