培養具有腈水合酶活性的微生物的方法與流程

2023-04-26 03:10:46 2

本發明涉及培養生產腈水合酶的微生物的方法、培養生產腈水合酶的微生物的組合物、以及含有糖類和有機酸的組合物用於培養生產腈水合酶的微生物的用途。在本發明的上下文中提供的並用於本發明的組合物特別適用於誘導相應微生物的生長和腈水合酶的生產。

背景技術：

聚丙烯醯胺廣泛用作絮凝劑、用作造紙工業中的增稠劑、用作三次採油中的添加劑、以及許多其它領域。聚丙烯醯胺的原料通常是其單體丙烯醯胺。原則上，存在兩種不同的工業規模生產丙烯醯胺的方法：化學合成和生物合成，其中由於更溫和的反應條件和固有的工藝安全性，生物合成方法呈日益上升趨勢。由於更溫和的反應條件、不存在銅催化劑和腈的定量轉化，在生物合成中可以避免昂貴的下遊加工步驟例如蒸餾或離子交換，因此導致更廉價的設備，顯著降低的設備藍圖。

兩種合成方法都使用丙烯腈作為起始物質。雖然化學合成方法使用銅催化劑(例如us4048226，us3597481)，但是生物合成方法使用生物催化劑水合丙烯腈以獲得丙烯醯胺。一般地，這樣的生物催化劑是微生物，其能夠生產酶的腈水合酶(2014年9月30日的iubmb命名法：ec4.2.1.84；cas-no.2391-37-5；也稱為，例如nhase)。生產腈水合酶的微生物廣泛地分布在環境中，並且包括，例如，作為代表的玫瑰色紅球菌(rhodococcusrhodochrous)、食吡啶紅球菌(rhodococcuspyridinovorans)、紅城紅球菌(rhodococcuserythropolis)、馬紅球菌(rhodococcusequi)、赤紅球菌(rhodococcusruber)、渾濁紅球菌(rhodococcusopacus)、黑麴黴(aspergillusniger)、燕麥食酸菌(acidovoraxavenae)、速生食酸菌(acidovoraxfacilis)、根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)、放射形土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、蒼白芽孢桿菌(bacilluspallidus)、史密斯芽孢桿菌(bacillussmithii)、芽孢桿菌br449(bacillusspbr449)、bradyrhizobiumoligotrophicum、bradyrhizobiumdiazoefficiens、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、新洋蔥伯克霍爾德氏菌(burkholderiacenocepacia)、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(burkholderiagladioli)、產酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumonia)、棲異地克雷伯菌(klebsiellavariicola)、鷹嘴豆中間根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、機會中間根瘤菌(mesorhizobiumopportunistum)、中間根瘤菌f28(mesorhizobiumspf28)、莫拉菌屬(moraxella)、pantoeaendophytica、成團泛菌(pantoeaagglomerans)、綠針假單胞菌(pseudomonaschlororaphis)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、根瘤菌屬(rhizobium)、沼澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、液化沙雷氏菌(serratialiquefaciens)、粘質沙雷氏菌(serratiamarcescens)、擬無枝酸菌屬(amycolatopsis)、節桿菌屬(arthrobacter)、短桿菌屬物種ch1(brevibacteriumspch1)、短桿菌屬物種ch2(brevibacteriumspch2)、短桿菌屬物種r312(brevibacteriumspr312)、蛾短桿菌(brevibacteriumimperiale)、corynebacteriumnitrilophilus、假白喉棒桿菌(corynebacteriumpseudodiphteriticum)、穀氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)、corynebacteriumhoffmanii、蛾微桿菌(microbacteriumimperiale)、恥垢微桿菌(microbacteriumsmegmatis)、藤黃微球菌(micrococcusluteus)、小球諾卡氏菌(nocardiagloberula)、玫瑰色諾卡氏菌(nocardiarhodochrous)、嗜熱假諾卡氏菌(pseudonocardiathermophila)、木黴屬(trichoderma)、疣孢漆斑菌(myrotheciumverrucaria)、出芽短梗黴(aureobasidiumpullulans)、candidafamata、季也蒙假絲酵母(candidaguilliermondii)、熱帶假絲酵母(candidatropicalis)、黃隱球酵母(cryptococcusflavus)、隱球酵母ufmg-y28(cryptococcusspufmg-y28)、漢遜德巴利酵母(debaryomyceshanseii)、白地黴(geotrichumcandidum)、地黴屬物種jr1(geotrichumspjr1)、有孢漢遜酵母屬(hanseniaspora)、耐熱克魯維酵母(kluyveromycesthermotolerans)、克魯弗畢赤酵母(pichiakluyveri)、紅酵母(rhodotorulaglutinis)、睪丸酮叢毛單胞菌(comomonastestosteroni)、pyrococcusabyssi、激烈熱火球古菌(pyrococcusfuriosus)和美未氏熱火球古菌(pyrococcushorikoshi)。(參見，例如，prasad，biotechnologyadvances(2010)，28(6)：725-741；fr2835531)。酶腈水合酶是鐵或鈷依賴性的(即其具有在其活性中心配位的鐵或鈷原子)，特別地其特徵在於其催化丙烯腈轉化以通過水合丙烯腈獲得丙烯醯胺的能力(kobayashi，naturebiotechnology(1998)，16：733-736)。

微生物作為將丙烯腈轉化為丙烯醯胺的生物催化劑的能力基本上取決於兩個參數：微生物的充分生長及其腈水合酶的生產速率。用於培養生產腈水合酶的微生物的已知發酵方法面臨幾個不同的困難，例如，適合生長的高濃度的碳或氮源可能抑制酶生產，所謂的「分解代謝物抑制」(leonova，appliedbiochembiotechnol(2000)，88：231-241)或金屬離子輔因子的抑制作用(ep-b11283256；pei，biotechnologyletters(2013)，35：1419-1424)。這些困難導致在給定時間段內低的腈水合酶活性速率，這是由於低的酶生產速率(即微生物主要生長但仍顯示低的酶生產速率)，或由於低的微生物生長速率(即微生物顯示高生產速率，但仍然有太少的微生物)。

因此，需要一種培養生產腈水合酶的微生物的方法，其允許在短時間內獲得高產率的腈水合酶活性。

這一技術問題已經通過權利要求中限定的並且如下文所描述和示例的本發明所克服。

技術實現要素：

本發明的要點在於令人驚訝的發現，根據腈水合酶活性水平，糖類和有機酸的組合增加生長和腈水合酶的生產速率。不受理論的束縛，據信通過有機酸可以改善糖進入細胞中。

因此，本發明涉及用於培養生產腈水合酶(nhase)的微生物的方法，其包括以下步驟：

(a)使所述微生物與包含糖(i)和有機酸(ii)的水性組合物接觸；

(b)在所述(a)的水性組合物中培養所述微生物。

本發明還涉及通過本文所述和提供的培養方法獲得的或可獲得的微生物。

本發明還涉及用於培養生產腈水合酶的微生物的組合物，所述組合物包含糖(i)和有機酸(ii)。

本發明還涉及包含糖(i)和有機酸(ii)的組合物用於培養生產腈水合酶的微生物的用途。

在下文中，當進一步限定和說明根據本發明所描述和提供的方法、組合物和組合物用途的各單個特徵(如腈水合酶、微生物、組合物、糖、有機酸等)時，這些定義和說明應適用於如本文所述和提供的所有本發明方法、本發明組合物和本發明組合物用途。

與本發明的發現相一致，已經證實，一些糖類，相較於其他糖類，看上起與有機酸組合可以更有效地增加腈水合酶活性(例如，允許微生物的高生長和高酶產量)。因此，在一個實施方案中，由本發明上下文中提供和使用的組合物所包含的糖(i)是單糖。此外，在本發明的上下文中，糖(i)可以是其中碳原子數為至少5、優選至少6的糖。在一個實施方案中，糖(i)中的碳原子數是6。包含在本文提供的組合物中和用於本發明上下文中的糖的具體實例包括葡萄糖、果糖、核糖和甘露糖；優選葡萄糖、果糖或甘露糖。在一個實施方案中，糖(i)是葡萄糖。

包含在本文提供的用於本發明的組合物中的有機酸(ii)可以是，例如，包含不超過3個羧基、優選不超過2個羧基、並且最優選不超過1個羧基基團的有機酸。根據本發明已經發現，這樣的有機酸對於增加腈水合酶活性特別有效，如在本文中和實施例中進一步描述和例示的。有機酸(ii)通常不受尺寸限制，但可包含例如不超過6個碳原子、優選不超過4個碳原子、最優選不超過3個碳原子。本發明上下文中，有機酸的具體實例包括乳酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸。在本發明的一個實施方案中，有機酸(ii)選自乳酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸；優選選自乳酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸；更優選選自乳酸、酒石酸和蘋果酸；最優選乳酸。

在本發明的一個具體實施方案中，本文提供的和在本發明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有機酸(ii)是乳酸。

在本文提供和描述的培養生產腈的微生物的方法中，可以首先根據步驟(a)使微生物與包含糖(i)(並且還不包含有機酸(ii))的組合物接觸，然後根據步驟(b)開始培養微生物，並直到這時才在微生物培養期間向組合物中加入有機酸(ii)。另外，反之亦然，在本文提供和描述的培養生產腈的微生物的方法中，可以首先根據步驟(a)使微生物與包含有機酸(ii)(並且還不包含糖(i))的組合物接觸，然後根據步驟(b)開始培養微生物，並直到這時才在微生物培養期間向組合物中加入糖(i)。換句話說，沒有必要，從培養一開始就在與微生物接觸的組合物中存在糖(i)和有機酸(ii)兩組分。相反，也可以在開始培養生產腈水合酶的微生物後，將組分(i)和(ii)中的一種或兩種添加到組合物中，只要最終微生物在包含兩種組分的組合物中培養以實現增加腈水合酶活性的期望效果即可。

本文提供的和在本發明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)和有機酸(ii)的比例通常不受限制。本文提供的和在本發明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)和有機酸(ii)之間的比例(本文通常以重量/重量比表示)可以為，例如1:9至9:1；2:8至8:2；2.5:7.5至7.5:2.5；3:7至7:3；3.5:6.5至6.5:3.5；4:6至6:4；4.5:5.5至5.5:4.5；或1:1。在一個實施方案中，組合物中糖(i)和有機酸(ii)之間的比例在2:8和9:1之間、優選3:7和9:1之間、更優選3:7和8:2之間、更優選3:7和7.5:2.5之間、最優選3:7和7:3之間或1:1和7:3之間。在本發明的上下文中，這些比例是指，加入到本文提供的和在本發明的上下文中使用的用於培養生產腈水合酶的微生物的組合物中的糖(i)和有機酸(ii)的相應重量。例如，組合物中的比例可以在生產腈水合酶的微生物的培養期間變化，因為兩種組分可以獨立地被消耗或更快或更慢地轉化，或者因為組分中的一種或兩種在整個培養過程中以額外量添加。

在本發明的一個具體實施方案中，本文提供的和在本發明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有機酸(ii)是乳酸，並且組合物中糖(i)和有機酸(ii)之間的比例在3:7和7:3之間。

根據本發明描述和提供和使用的，包含糖(i)和有機酸(ii)的組合物還可以包含本領域已知的對培養微生物的組合物有用的其它組分。最優選地，在本發明的上下文中，所述組合物是水性組合物。其它組分可以包括例如氮源(例如銨或硝酸鹽，有機酸如穀氨酸，酵母提取物或蛋白質水解產物)、磷源(例如磷酸鹽，其也可以提供緩衝能力)、硫源(例如硫酸鹽)、鈷和/或鐵源(作為nhase的輔因子)、用於表達腈水合酶的誘導劑例如尿素、其它營養源如鎂，鈣，鋅，錳，銅以及維生素。

本文所述的生產腈水合酶的微生物的培養，特別是在本文提供的方法的步驟(b)中，可以以本領域技術人員已知的常規方式進行。也就是說，本文提供的和在本文上下文中使用的組合物，除了本文所述的糖(i)和有機酸(ii)外，還應包含允許培養的微生物生長和維持所必需的其它組分。此外，應設定其它參數，例如溫度、ph、溶解氧濃度、壓力、通氣和攪動，以允許在本發明中培養的微生物生長和維持。在本文上下文中，用於培養本文所述和例示的微生物的典型溫度可以在30℃和40℃之間、優選在35℃和38℃之間、最優選在36.5℃和37.5℃之間、特別是37℃。然而，也可以根據在本發明中培養的微生物，設定其它溫度。應通過在發酵培養基中提供緩衝液或通過反饋控制強酸和/或鹼的加入，將ph保持在6和8之間、優選在6.5和7.5之間。典型的溶解氧濃度值可以在飽和濃度的5％至75％之間、優選20％至40％。

在本發明的上下文中，在根據本文描述和提供的培養方法培養生產腈水合酶的微生物之後，可以從培養組合物收集微生物並乾燥或以其它方式積累。任選地，可以在乾燥之前濃縮細胞懸浮液，例如，通過離心或交叉流過濾(以微量過濾或超濾模式)。在乾燥之前，還可以用水或緩衝溶液洗滌細胞，以從發酵肉湯中除去殘留物質。例如，在培養後，然後可以通過噴霧乾燥、流化床乾燥、噴霧造粒或冷凍乾燥來乾燥微生物，優選通過噴霧或冷凍乾燥。例如，可以在溫和條件下(例如使用入口溫度為80至150℃、優選90至120℃，和出口溫度為，例如35至65℃、優選40至50℃)，噴霧乾燥細胞，至殘留水含量為1至10％、優選4至8％重量。

在本發明的上下文中，用包含糖(i)和有機酸(ii)的組合物培養的生產腈水合酶的微生物可以是能夠生產本文所述的酶腈水合酶的任何微生物。酶腈水合酶是鐵或鈷依賴性的(即其具有在其活性中心配位的鐵或鈷原子)，尤其是其特徵在於其催化丙烯腈轉化以通過水合丙烯腈獲得丙烯醯胺的能力(kobayashi，naturebiotechnology(1998)，16：733-736)。在本發明的上下文中使用的這種微生物可以是能夠天然生產腈水合酶的微生物，即天然含有編碼腈水合酶的基因。這樣的微生物也可以是能夠天然生產腈水合酶並且進一步被遺傳改造，例如以增加腈水合酶的生產或增加腈水合酶的穩定性和/或輸出的微生物。這樣的微生物也可以是天然不能生產腈水合酶並且進一步被遺傳改造以穩定表達和生產腈水合酶的微生物。在該上下文中，能夠天然生產腈水合酶的微生物在本領域中是公知的，並且包括，例如，作為代表的玫瑰色紅球菌(rhodococcusrhodochrous)、食吡啶紅球菌(rhodococcuspyridinovorans)、紅城紅球菌(rhodococcuserythropolis)、馬紅球菌(rhodococcusequi)、赤紅球菌(rhodococcusruber)、渾濁紅球菌(rhodococcusopacus)、黑麴黴(aspergillusniger)、燕麥食酸菌(acidovoraxavenae)、速生食酸菌(acidovoraxfacilis)、根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)、放射形土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、蒼白芽孢桿菌(bacilluspallidus)、史密斯芽孢桿菌(bacillussmithii)、芽孢桿菌br449(bacillusspbr449)、bradyrhizobiumoligotrophicum、bradyrhizobiumdiazoefficiens、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、新洋蔥伯克霍爾德氏菌(burkholderiacenocepacia)、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(burkholderiagladioli)、產酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumonia)、棲異地克雷伯菌(klebsiellavariicola)、鷹嘴豆中間根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、機會中間根瘤菌(mesorhizobiumopportunistum)、中間根瘤菌f28(mesorhizobiumspf28)、莫拉菌屬(moraxella)、pantoeaendophytica、成團泛菌(pantoeaagglomerans)、綠針假單胞菌(pseudomonaschlororaphis)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、根瘤菌屬(rhizobium)、沼澤紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)、液化沙雷氏菌(serratialiquefaciens)、粘質沙雷氏菌(serratiamarcescens)、擬無枝酸菌屬(amycolatopsis)、節桿菌屬(arthrobacter)、短桿菌屬物種ch1(brevibacteriumspch1)、地芽孢桿菌rapc8(geobacillussprapc8)、短桿菌屬物種ch2(brevibacteriumspch2)、短桿菌屬物種r312(brevibacteriumspr312)、蛾短桿菌(brevibacteriumimperial)、corynebacteriumnitrilophilus、假白喉棒桿菌(corynebacteriumpseudodiphteriticum)、穀氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、corynebacteriumhoffmanii、蛾微桿菌(microbacteriumimperiale)、恥垢微桿菌(microbacteriumsmegmatis)、藤黃微球菌(micrococcusluteus)、小球諾卡氏菌(nocardiagloberula)、玫瑰色諾卡氏菌(nocardiarhodochrous)、嗜熱假諾卡氏菌(pseudonocardiathermophila)、木黴屬(trichoderma)、疣孢漆斑菌(myrotheciumverrucaria)、出芽短梗黴(aureobasidiumpullulans)、candidafamata、季也蒙假絲酵母(candidaguilliermondii)、熱帶假絲酵母(candidatropicalis)、黃隱球酵母(cryptococcusflavus)、隱球酵母ufmg-y28(cryptococcusspufmg-y28)、漢遜德巴利酵母(debaryomyceshanseii)、白地黴(geotrichumcandidum)、地黴屬物種jr1(geotrichumspjr1)、有孢漢遜酵母屬(hanseniaspora)、耐熱克魯維酵母(kluyveromycesthermotolerans)、克魯弗畢赤酵母(pichiakluyveri)、紅酵母(rhodotorulaglutinis)、睪丸酮叢毛單胞菌(comomonastestosteroni)、pyrococcusabyssi、激烈熱火球古菌(pyrococcusfuriosus)和美未氏熱火球古菌(pyrococcushorikoshi)。此外，天然不表達腈水合酶的微生物如埃希氏桿菌(如大腸桿菌)，一旦已經被遺傳改造從而穩定表達和生產腈水合物，也可以使用。在本發明的一個實施方案中，生產腈水合酶的微生物的代表是紅球菌屬(rhodococcus)，例如玫瑰色紅球菌或食吡啶紅球菌。在本上下文中，玫瑰色紅球菌種的代表實例可以包括在「ncimb41164、ferm-bp1478(j1)、m33或m8下保藏的菌株。此外，在本發明上下文中，生產腈水合酶的微生物可以是被遺傳改造的微生物，這些微生物天然不含有編碼腈水合酶的基因，但其已被處理，從而含有編碼腈水合酶的多核苷酸(例如，通過轉化、轉導、轉染、綴合或其他本領域已知的適於將多核苷酸轉移或插入細胞的方法，如sambrook和russell2001，molecularcloning：alaboratorymanual，cshpress，coldspringharbor，ny，usa)，從而使得微生物能夠生產腈水合酶。為此目的，可能還需要插入額外的多核苷酸，其可以是分別允許腈水合酶基因或mrna轉錄和翻譯所必需的多核苷酸。此類額外的多核苷酸例如可以包括啟動子序列、polyt-或polyu-尾，或複製起點或其它質粒-控制序列等。在本上下文中，這種天然地不含有編碼腈水合酶的基因但已被操作以例如含有編碼腈水合酶的多核苷酸的遺傳改造的微生物，可以是原核或真核微生物。這種原核微生物的實例包括，例如，代表的大腸桿菌種。真核微生物的實例包括，例如，酵母(例如，釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

在本發明的一個具體實施方案中，本文提供的和在本發明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有機酸(ii)是乳酸，並且生產腈水合酶的微生物是玫瑰色紅球菌，例如，ncimb41164或ferm-bp1478。

在本發明的另一個具體實施方案中，生產腈水合酶的微生物是玫瑰色紅球菌，並且組合物中糖(i)和有機酸(ii)之間的比率為3:7至7:3之間。

在本發明的另一個具體實施方案中，本文提供的和在本發明的上下文中使用的組合物中所含的糖(i)是葡萄糖，有機酸(ii)是乳酸，生產腈水合酶的微生物是玫瑰色紅球菌，並且該組合物中糖(i)和有機酸(ii)的比率為3:7和7:3之間。

在本發明的上下文中，術語「腈水合酶」是指能夠催化丙烯腈水合成丙烯醯胺的酶腈水合酶(在本文中也稱為「nhase」)，即其具有腈水合酶活性。在本發明的上下文中，本發明意義上的腈水合酶的活性可如下測定：首先將100μl細胞懸浮液、細胞裂解物、溶解的酶粉末或含有推定的腈水合酶的任何其它製劑，與875μl的50mm磷酸鉀緩衝液和25μl的丙烯腈在25℃下在eppendorf管搖床上以1,000rpm反應10分鐘。在10分鐘的反應時間後，抽取樣品並通過加入相同體積的1.4％鹽酸立即淬滅。混合樣品後，通過在10,000rpm下離心1分鐘除去細胞，通過hplc分析澄清上清液，測定形成的丙烯醯胺的量。丙烯醯胺的濃度應在0.25和1.25mmol/l之間——如果必要，樣品必須相應稀釋，並且必須重複轉化。用hplc分析獲得的丙烯醯胺濃度，除以反應時間(其為10分鐘)、並將該值與hplc樣品和原始樣品之間的稀釋因子相乘，從丙烯醯胺的濃度推導出酶活性。活性>10u/ml，優選>100u/ml，更優選>1,000u/ml，表示存在功能性表達的腈水合酶，並被認為是腈水合酶活性，因此，是在本發明上下文中的腈水合酶。例如，本文所用的腈水合酶還包括根據iubmb命名法(截至2014年9月30日)分類為ec4.2.1.84或cas-no.2391-37-5的酶，以及例如能夠更快地將腈化合物(例如丙烯腈)轉化為醯胺化合物(例如丙烯醯胺)的修飾或增強的酶，或可以以更高的產率/時間比生產的酶，或者更穩定的酶，只要它們能夠催化腈化合物(例如丙烯腈)轉化(即水合)成醯胺化合物(例如丙烯醯胺)。在本發明的上下文中，腈水合酶可以是由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與seqidno：1的核苷酸序列(玫瑰色紅球菌腈水合酶的α-亞基)和/或seqidno：3的核苷酸序列(玫瑰色紅球菌腈水合酶的β-亞基)至少70％、優選至少75％、更優選至少80％、更優選至少85％、更優選至少90％、更優選至少95％、更優選至少96％、更優選至少97％、更優選至少98％、更優選至少99％、更優選至少99.5％、最優選100％相同的核苷酸序列，或由所述核苷酸序列組成，其中，

seqidno：1的核苷酸序列為：

gtgagcgagcacgtcaataagtacacggagtacgaggcacgtaccaaggcgatcgaaaccttgctgtacgagcgagggctcatcacgcccgccgcggtcgaccgagtcgtttcgtactacgagaacgagatcggcccgatgggcggtgccaaggtcgtggccaagtcctgggtggaccctgagtaccgcaagtggctcgaagaggacgcgacggccgcgatggcgtcattgggctatgccggtgagcaggcacaccaaatttcggcggtcttcaacgactcccaaacgcatcacgtggtggtgtgcactctgtgttcgtgctatccgtggccggtgcttggtctcccgcccgcctggtacaagagcatggagtaccggtcccgagtggtagcggaccctcgtggagtgctcaagcgcgatttcggtttcgacatccccgatgaggtggaggtcagggtttgggacagcagctccgaaatccgctacatcgtcatcccggaacggccggccggcaccgacggttggtccgaggaggagctgacgaagctggtgagccgggactcgatgatcggtgtcagtaatgcgctcacaccgcaggaagtgatcgtatga

其中seqidno：3的核苷酸序列為：

atggatggtatccacgacacaggcggcatgaccggatacggaccggtcccctatcagaaggacgagcccttcttccactacgagtgggagggtcggaccctgtcaattctgacttggatgcatctcaagggcatatcgtggtgggacaagtcgcggttcttccgggagtcgatggggaacgaaaactacgtcaacgagattcgcaactcgtactacacccactggctgagtgcggcagaacgtatcctcgtcgccgacaagatcatcaccgaagaagagcgaaagcaccgtgtgcaagagatccttgagggtcggtacacggacaggaagccgtcgcggaagttcgatccggcccagatcgagaaggcgatcgaacggcttcacgagccccactccctagcgcttccaggagcggagccgagtttctctctcggtgacaagatcaaagtgaagagtatgaacccgctgggacacacacggtgcccgaaatatgtgcggaacaagatcggggaaatcgtcgcctaccacggctgccagatctatcccgagagcagctccgccggcctcggcgacgatcctcgcccgctctacacggtcgcgttttccgcccaggaactgtggggcgacgacggaaacgggaaagacgtagtgtgcgtcgatctctgggaaccgtacctgatctctgcgtga

條件是，由所述多核苷酸編碼的多肽能夠催化丙烯腈水合成丙烯醯胺(即具有腈水合酶活性)，如本文所述和例舉的。同樣在本發明的上下文中，腈水合酶可以是包含與seqidno：2的胺基酸序列(玫瑰色紅球菌腈水合酶的α-亞基)和/或seqidno：4的胺基酸序列(玫瑰色紅球菌腈水合酶的β-亞基)至少70％、優選至少75％、更優選至少80％、更優選至少85％、更優選至少90％、更優選至少95％、更優選至少96％、更優選至少97％、更優選至少98％、更優選至少99％、更優選至少99.5％、最優選100％相同的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成的多肽，

其中seqidno：2的胺基酸序列為：

vsehvnkyteyeartkaietllyerglitpaavdrvvsyyeneigpmggakvvakswvdpeyrkwleedataamaslgyageqahqisavfndsqthhvvvctlcscypwpvlglppawyksmeyrsrvvadprgvlkrdfgfdipdevevrvwdssseiryiviperpagtdgwseeeltklvsrdsmigvsnaltpqeviv

其中seqidno：4的胺基酸序列為：

mdgihdtggmtgygpvpyqkdepffhyewegrtlsiltwmhlkgiswwdksrffresmgnenyvneirnsyythwlsaaerilvadkiiteeerkhrvqeilegrytdrkpsrkfdpaqiekaierlhephslalpgaepsfslgdkikvksmnplghtrcpkyvrnkigeivayhgcqiypesssaglgddprplytvafsaqelwgddgngkdvvcvdlwepylisa

條件是所述多肽能夠催化丙烯腈水合成丙烯醯胺，如本文所述和例舉的。

兩個或更多個序列(例如，核酸序列或胺基酸序列)之間的同一性水平可以通過本領域已知的方法例如通過blast分析容易地確定。通常，在本發明的上下文中，如果待(例如通過序列比較)進行比較的兩個序列(例如，多核苷酸序列或胺基酸序列)在同一性上不同，則術語「同一性」可以指較短的序列和與所述較短序列匹配的較長序列的那部分。因此，當比較的序列不具有相同的長度時，同一性程度優選地可以指較短序列中與較長序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比，或者指在較長序列中與較短序列中的核苷酸序列相同的核苷酸的百分比。在本上下文中，技術人員容易確定與較短序列匹配的較長序列的部分。此外，如本文所使用的，核酸序列或胺基酸序列的同一性水平可以指相應序列的整個長度，並且優選成對評估，其中每個空位計為一個錯配。序列比較的這些定義(例如，「同一性」值的建立)適用於本文描述和公開的所有序列。

此外，如本文所使用的術語「同一性」是指，在相應序列之間存在功能和/或結構等同。與本文所述的特定核酸/胺基酸序列具有給定同一性水平的核酸/胺基酸序列可以表示這些序列的衍生物/變體，其優選具有相同的生物學功能。它們可以是天然存在的變異，例如來自其他變種，物種等的序列，或可以是突變，並且所述突變可以是天然形成的或可以通過有意誘變產生。此外，變異可以是合成產生的序列。變體可以是天然存在的變體或合成產生的變體或通過重組dna技術產生的變體。與上述核酸序列的偏差可以通過例如缺失、取代、添加、插入和/或重組產生。術語「添加」是指在給定序列的末端添加至少一個核酸殘基/胺基酸，而「插入」是指在給定序列中插入至少一個核酸殘基/胺基酸。術語「缺失」是指刪除或去除給定序列中的至少一個核酸殘基或胺基酸殘基。術語「取代」是指替換給定序列中的至少一個核酸殘基/胺基酸殘基。同樣，這裡使用的這些定義經必要修改後適用於本文提供和描述的所有序列。

通常，如本文所用，術語「多核苷酸」和「核酸」或「核酸分子」應同義地解釋。通常，核酸分子尤其可以包含dna分子、rna分子、寡核苷酸硫代磷酸酯、取代的核糖寡核苷酸或pna分子。此外，術語「核酸分子」可以指本領域已知的dna或rna或其雜交物或其任何修飾(對於修飾的實例，參見例如us5525711、us4711955、us5792608或ep302175)。多核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈、線性或環狀、天然或合成的、並且沒有任何大小限制。例如，多核苷酸序列可以是基因組dna、cdna、線粒體dna、mrna、反義rna、核酶rna或編碼此類rna的dna或嵌合體(chimeroplast)(gamper,nucleicacidsresearch,2000,28,4332-4339)。所述多核苷酸序列可以是載體、質粒或病毒dna或rna的形式。本文還描述了與上述核酸分子互補的核酸分子和能夠與本文所述的核酸分子雜交的核酸分子。本文所述的核酸分子還可以是本發明上下文中的核酸分子的片段。特別地，這樣的片段是功能片段。這樣的功能片段的實例是可以用作引物的核酸分子。

一般來說，本發明涉及本文所述的所有實施例以及其所有排列和組合。本文描述的任何特定方面或實施方式不應被解釋為將本發明的範圍限制在這些方面或實施方案。

以下實施例舉例說明本發明。然而，本發明不應被解釋為受以下實施例的限制。

實施例

實施例1

紅球菌的培養

在微發酵系統中，針對不同紅球菌菌株(玫瑰色紅球菌「ciba」(ncimb41164)和玫瑰色紅球菌「j1」(fermbp-1478))，評估了不同糖/有機酸比率。

基礎培養基含有酵母提取物(biospringer)(1.25g/l)、kh2po4(10g/l)、k2hpo4(10g/l)、(nh4)2so4(1g/l)、mgso4*7h2o(0.375g/l)、cacl2*2h2o(25mg/l)、微量元素溶液(2.5g/l)(參見下文)、co(no3)2(31.2mg/l)、消泡劑p2000(basf)(62.5mg/l)、尿素(7g/l)和穀氨酸銨(2.5g/l)，在h2o中。

微量元素溶液：檸檬酸一水合物(40g/l)、znso4*7h2o(11g/l)、(nh4)2fe(so4)2*6h2o(8.5g/l)、mnso4*h2o(3g/l)和cuso4*5h2o(0.8g/l)，在h2o中。

然後向培養基中補充10g/l碳源(糖、有機酸或兩者的混合物，如下表所示)。使用h3po4或naoh將ph調節至6.6。將培養基直接從冷儲備物接種至od0.05(在600nm測量)。在biolector微發酵系統(m2plabs，baesweiler，germany)中使用具有1.5ml工作體積的48孔花板，在37℃下以1,100rpm進行培養64小時。培養後，抽取樣品，用鹽酸淬滅，如實施例2所述測定腈水合酶活性。

在下表中，提供了不同菌株和糖/酸比率的相對腈水合酶活性。將糖作為唯一碳源獲得的腈水合酶活性設定為100％。

表1：玫瑰色紅球菌「ciba」

表2：玫瑰色紅球菌「j1「

實施例2

腈水合酶活性的測定

從實施例1的培養基中取樣，並用50mmol/lkh2po4緩衝液(ph7.0)1:10(v/v)稀釋。獲得的溶液用50mmol/lkh2po4緩衝液(ph7.0)進一步稀釋1:20(v/v)，以達到培養基的最終稀釋因子1:200。

反應：

將875μlkh2po4緩衝液(ph7.0)吸移到2mleppendorf管中。加入100μl稀釋的培養基，並將混合物在恆溫混合器中在25℃下以500rpm預孵育5分鐘。預孵育後，通過加入25μl丙烯腈開始反應。反應在25℃和1,000rpm下進行10分鐘。

樣品製備：

在10分鐘的反應時間後，通過將300μl反應溶液轉移到含有300μl的1.4％(m/v)鹽酸的1.5mleppendorf管中來淬滅反應。將混合物短暫渦旋並在臺式離心機中以10,000rpm離心1分鐘以分離細胞。將100μl澄清的上清液與900μl水混合。然後通過hplc分析混合物。

hplc分析：

柱：aqua5μc18125a，250×4.60mm(phenomenex)

烘箱溫度：45℃

注射體積：1μl

檢測：uv210nm

流速：1.0ml/min

溶劑a：25mmol/lkh2po4ph2.5

溶劑b：乙腈

分離：10％b(等度)

保留時間：丙烯醯胺：分鐘，

hplc值應在0.25和1.25mmol/l之間

通過hplc測定的丙烯醯胺的濃度應該在0.25和1.25mmol/l之間。如果這沒有直接達到，則需要相應地調節反應中使用的細胞濃度。

腈水合酶活性的測定：

c：產物物質的量[mm](hplc-值)

t：孵育時間[min]，在該測試中10分鐘

k：稀釋因子-從初始樣品到hplc樣品的總稀釋度

計算活性，以ku/l計

一個活性單位[u]定義為在1分鐘反應時間內生產1μmol丙烯醯胺。