一種用rbsdv粗提液進行病毒覆蓋蛋白結合實驗的方法
2023-04-25 21:55:11 1
一種用rbsdv粗提液進行病毒覆蓋蛋白結合實驗的方法
【專利摘要】本發明公開了一種用RBSDV粗提液進行病毒覆蓋蛋白結合實驗的方法。本發明的實質是通過研磨RBSDV病樣釋放出病毒粒子，離心獲得病毒的粗提液，以RBSDV的粗提液而不是提純的病毒粒子進行病毒覆蓋蛋白結合實驗。本發明這個方法不需要提取RBSDV病毒粒子，操作簡便，大大減少了成本，節省了時間，較原有方法具有更方便、快捷和經濟的特點，可應用於分析或篩選RBSDV病毒的互作蛋白。
【專利說明】—種用RBSDV粗提液進行病毒覆蓋蛋白結合實驗的方法
【技術領域】
[0001]本文發明一種用水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus,RBSDV)粗提液進行病毒覆蓋蛋白結合實驗(virus overlay-protein binding assay, V0PBA)的方法，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]病毒覆蓋蛋白結合實驗(VOPBA)是一種基於western blotting的分子生物學方法，可用於檢測蛋白-蛋白之間的相互作用、篩選病毒的互作蛋白等。其實驗過程可以簡單描述為將待檢測的蛋白質經SDS-PAGE或雙向電泳等方法分離後，轉移並固定在膜(如硝酸纖維素膜、PVDF膜等)上，將提純的病毒粒子與膜共同孵育，使病毒和互作蛋白結合，然後用病毒特異性識別物質(如抗體)去識別，最後經顯色反應將互作蛋白在膜上顯示出來。
[0003]病毒覆蓋蛋白結合實驗是獲取病毒互作蛋白的有效手段。Zhang等利用提純的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)粒子進行病毒覆蓋蛋白結合實驗，獲取了豬肝臟細胞中的互作蛋白[I]。Thongtan等利用提純的日本乙腦病毒進行病毒覆蓋蛋白結合實驗，獲得了微神經膠質細胞中的可能受體[2]。Li等利用提純的水稻條紋病毒粒子進行病毒覆蓋蛋白結合實驗，獲取了介體昆蟲灰飛蝨中與病毒互作的蛋白[3]。
[0004]水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)為呼腸孤病毒科，斐濟病毒屬(Fijivirus)病毒。可危害水稻、玉米、小麥、大麥、高粱及燕麥等20多種禾本科寄主，對農業生產造成了嚴重影響。RBSDV不僅引起水稻黑條矮縮病，同時也是引起玉米粗縮病的病原。近年來，由RBSDV引起的水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病在我國華北、華東等地大規模流行，造成嚴重損失。該病毒主要通過介體昆蟲灰飛蝨(Laodelphaxstriatellus)以增殖型持久性方式傳播。獲取介體灰飛蝨中與RBSDV互作的蛋白對研究RBSDV的蟲傳機制具有重要作用。
[0005]利用傳統的病毒覆蓋蛋白結合實驗技術來獲取RBSDV互作蛋白存在一定的缺陷。主要原因是該病毒主要存在於寄主植物葉脈的韌皮部中，很難獲得大量高純度的病毒粒子，而且該病毒粒子的外殼蛋白和表面突起極不穩定，在病毒的純化過程中容易丟失，所以一般提純的病毒都是各種亞病毒粒子的混合物，不適宜用病毒覆蓋蛋白結合實驗技術來獲取RBSDV互作蛋白。為克服這一局限性，本文發明了一種用RBSDV粗提液代替提純的病毒粒子進行病毒覆蓋蛋白結合實驗來分析病毒互作蛋白的方法。該方法操作簡便，無需提純病毒，縮短了實驗周期，節省了提純病毒所需的人力物力。
[0006]參考文獻:
[0007]1.Zhang w, Hua X, Shen Q, Yang S, Yin H, et al.1dentification ofgenotype4Hepatitis E virus binding proteins on swine liver cells.Virol J8:482.[0008]2.Thongtan T, Wikan N, Wintachai P, Rattanarungsan C, Srisomsap C, etal.Characterization of putative Japanese encephalitis virus receptor moleculeson microglial cells.J Med Virol84:615-623.[0009]3.Li S，Xiong R，Wang X，Zhou Y Five proteins of Laodelphax striatellusare potentially involved in the interactions between rice stripe virus andvector.PLoS 0ne6:e26585.
【發明內容】
[0010]本發明提供了一種用RBSDV病汁液進行病毒覆蓋蛋白結合實驗的方法。
[0011]具體操作方法如下:
[0012](I)將RBSDV水稻或玉米病樣去根洗淨，切碎後用液氮碾磨，按每Ig病樣加入5ml0.0lM PBST的比例加入PBST溶液，混勻，放置15min，8000g離心lOmin，取上清。此上清即為RBSDV粗提液，放4°C冰箱備用；
[0013](2)將用於分析的蛋白或蛋白混合物進行SDS-PAGE或雙向電泳(2D)分離，分離後採用半乾轉移等方法將蛋白轉移到膜(如硝酸纖維素膜、PVDF膜)上；
[0014](3)電轉後的膜用0.0lM PBST漂洗兩次，每次5min ；
[0015](4)將膜用3%封閉液(3g脫脂牛奶/IOOml0.0lM PBST緩衝液)37°C振蕩2h，以封閉非特異性蛋白結合位點；
[0016](5)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ；
[0017](6)將膜浸入RBSDV粗提液中，20°C輕搖振蕩過夜；
[0018](5)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ；
[0019](7)將膜浸入3%封閉液稀釋的RBSDV的抗體中，37°C振蕩2h ；
[0020](8)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ；
[0021](9)將膜浸入3%封閉液稀釋的針對RBSDV抗體的二抗中，37°C振蕩1.5h ；
[0022](10)膜用 0.0lM PBST 漂洗三次，每次 5min ；
[0023](11)將膜浸入與二抗對應標記的底物顯色液中，37°C反應至互作點顯色清晰，迅速用去離子水衝洗，以終止反應，室溫晾乾膜，拍照記錄。
[0024]本發明提供了一種用RBSDV粗提液進行病毒覆蓋蛋白結合實驗的方法。該方法的特徵是通過研磨病樣釋放出RBSDV病毒粒子，離心獲得RBSDV的粗提液，以RBSDV的粗提液而不是提純的病毒粒子進行病毒覆蓋蛋白結合實驗。本發明可用於分析蛋白與病毒的互作關係，篩選RBSDV的互作蛋白。此方法不需要提取RBSDV病毒粒子，大大減少了成本，節省了時間，具有操作簡便、快捷的優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1採用本發明篩選灰飛蝨中與RBSDV病毒粒子互作的蛋白。圖A為灰飛蝨總蛋白經雙向電泳分離後考馬斯亮藍染色圖。圖B為採用本發明找到的灰飛蝨中的蛋白。圖中標記的為與RBSDV互作的灰飛蝨蛋白。
[0026]圖2米用本發明分析灰飛風蛋白與RBSDV病毒粒子的互作關係。圖A為誘導蛋白經SDS-PAGE分離後考馬斯亮藍染色圖。圖B為採用本發明分析灰飛蝨蛋白與RBSDV病毒粒子的互作結果。M:蛋白Marker，泳道1，空載體pET-32a，泳道2，3，4分別為用pET-32a誘導表達的蛋白 actin、RACK、VPl、GAPDH3。
[0027]具體實施方法[0028]實例一用RBSDV病汁液進行VOPBA篩選介體灰飛蝨中的互作蛋白
[0029]RBSDV主要通過介體灰飛蝨傳播，為獲取灰飛蝨體內參與RBSDV傳播的介體因子，採用本發明尋找介體灰飛蝨中的互作蛋白。具體操作方法為dflOg RBSDV水稻病樣用液氮碾磨，加入50mi的0.01M PBST緩衝液，混勻，放置15min後，8000g離心lOmin，取上清，4°C保存備用；提取灰飛蝨總蛋白進行雙向電泳分離，做2個重複；將其中一塊凝膠用於考馬斯亮藍染色，另一塊凝膠通過半乾轉移(20V，45min)將蛋白轉移到PVDF膜上^fPVDF膜用0.01M PBST漂洗兩次，每次5min ;將膜浸於3%封閉液中，37°C振蕩2h，以封閉非特異性蛋白結合位點；再將膜漂洗三次；將膜浸入RBSDV粗提液中，20°C輕搖振蕩過夜；再將膜漂洗三次；將膜浸入3%封閉液稀釋的RBSDV多克隆抗體(I: 2000倍稀釋)中，37°C振蕩2h ;膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min ;將膜浸入3%封閉液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(I: 2000倍稀釋)中，37°C振蕩1.5h;再將膜漂洗三次；將膜浸入HRP標記的底物顯色液中，37°C反應至互作點顯色清晰，迅速用去離子水衝洗，以終止反應，室溫晾乾膜，拍照記錄。結果如圖1所示。圖1A和圖1B中顯示的蛋白點即為採用本發明找到的互作蛋白。
[0030]實例二用RBSDV粗提液進行VOPBA分析灰飛蝨蛋白與RBSDV病毒粒子的互作關係
[0031]通過酵母雙雜交方法篩選到灰飛蝨中與RBSDV PlO互作的蛋白actin、RACK、VPl和GAPDH3。為分析這些互作蛋白與RBSDV病毒粒子的互作關係，採用本發明方法分析它們與病毒的互作關係。具體操作方法為:將4g RBSDV水稻病樣用液氮碾磨，加入20ml的
0.01MPBST緩衝液，混勻，放置15min後，8000g離心lOmin，取上清，4°C保存備用；將這些互作蛋白進行原核表達和誘導，誘導表達的蛋白進行SDS-PAGE分離，然後利用半乾轉移(15V，40min)將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上；將硝酸纖維素膜用0.01M PBST漂洗兩次，每次5min ;將膜浸於3%封閉液中，37°C振蕩2h，以封閉非特異性蛋白結合位點；再將膜漂洗三次；用RBSDV粗提液覆蓋硝酸纖維素膜，20°C輕搖振蕩過夜；再將膜漂洗三次；將膜浸入3%封閉液稀釋的RBSDV多克隆抗體(I:2000倍稀釋)中，37°C振蕩2h ;再將膜漂洗三次；將膜浸入3%封閉液稀釋的HRP標記的羊抗兔二抗中(以1:2`000倍稀釋)，37°C振蕩1.5h ；再將膜漂洗三次；將膜浸入HRP標記的底物顯色液中，37°C反應至互作點顯色清晰，迅速用去離子水衝洗，以終止反應，室溫晾乾膜，拍照記錄。結果如圖2所示。圖2B中可見與圖2A中表達蛋白對應位置有一特異條帶，表明這些灰飛蝨中的互作蛋白與RBSDV病毒粒子有互作關係。
【權利要求】
1.本發明公開一種用RBSDV粗提液進行病毒覆蓋蛋白結合實驗的方法，其方法如下: (1)將RBSDV水稻或玉米病樣去根洗淨，切碎後用液氮碾磨，按每Ig病樣加入5ml0.0lMPBST的比例加入PBST溶液，混勻，放置15min，8000g離心lOmin，取上清。此上清即為RBSDV粗提液，放4°C冰箱備用； (2)將用於分析的蛋白或蛋白混合物進行SDS-PAGE或雙向電泳(2D)分離，分離後採用半乾轉移等方法將蛋白轉移到膜(如硝酸纖維素膜、PVDF膜)上； (3)電轉後的膜用0.0lM PBST漂洗兩次，每次5min ； (4)將膜用3%封閉液(3g脫脂牛奶/IOOml0.0lM PBST緩衝液)37°C振蕩2h，以封閉非特異性蛋白結合位點； (5)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ； (6)將膜浸入RBSDV粗提液中，20°C輕搖振蕩過夜； (5)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ； (7)將膜浸入3%封閉液稀釋的RBSDV的抗體中，37°C振蕩2h； (8)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ； (9)將膜浸入3%封閉液稀釋的針對RBSDV抗體的二抗中，37°C振蕩1.5h ； (10)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ； (11)將膜浸入與二抗對應標記的底物顯色液中，37°C，反應至互作點顯色清晰，迅速用去離子水衝洗，以終止反應，室溫晾乾膜，拍照記錄。
2.根據權利要求1所述的用RBSDV粗提液標記進行病毒覆蓋蛋白結合實驗的方法，其特徵在於步驟第6步「將膜浸入RBSDV粗提液中，20°C輕搖振蕩過夜」。
3.根據權利要求1所述的用RBSDV粗提液標記進行病毒覆蓋蛋白結合實驗的方法，其特徵在於RBSDV病毒粗提液按照步驟I方法製備。
【文檔編號】G01N33/68GK103592443SQ201310610988
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】徐秋芳, 陳晴晴, 周益軍, 倪海平 申請人:江蘇省農業科學院