一種檢測克百威酶聯免疫分析方法
2023-04-25 22:46:26
專利名稱：一種檢測克百威酶聯免疫分析方法
技術領域：
本發明涉及酶聯免疫分析方法，具體地說，涉及一種檢測克百威的酶聯免疫分析方法。
背景技術：
克百威(carbofuran，化學名2，3二氫-2，2二甲基-7-苯並呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯)，商品名呋喃丹，自1969年由FMC公司和Mobay化學公司開發生產後即作為一種高效、廣譜的殺蟲劑，廣泛應用於糧食、蔬菜、水果及經濟作物的害蟲防治。克百威是一種膽鹼酯酶抑制劑，對人和野生動物具有很高的毒性(小鼠經口LD50為8mg/kg)，是蔬菜農藥殘留規定中不得檢出的一種，但由於殺蟲效果較好，目前在糧食和蔬菜上存在不合理使用的現象比較嚴重，對公眾健康具有較大的危害。另外，克百威在酸性土壤中不易降解，極易汙染土壤和地下水源，容易造成環境汙染。因此，除加強克百威的使用管理，從源頭控制的同時，還應加強對其的檢測與監管，防止其進入食物鏈中。
目前，檢測克百威殘留的常規方法有氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)，這些方法雖然靈敏精確，但需要昂貴的專業儀器，分析費時，成本較高。而酶聯免疫分析(ELISA)快速檢測技術因成本低、操作簡單、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化程度低，現已成為常用的篩選方法，因此，開發克百威特異、靈敏，且適於現場大批量樣品快速篩選的酶聯免疫分析方法具有重要的現實意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種特異性強、靈敏度高、穩定性好、操作簡單快速，適合環境和農產品中大批量檢測克百威的酶聯免疫分析方法。
一種檢測克百威的酶聯免疫分析方法，包括如下步驟(1)合成半抗原和人工抗原；(2)將人工抗原免疫動物製備對克百威具特異性的多克隆抗體、單克隆抗體或基因工程抗體；(3)用辣根過氧化物酶標記半抗原製備酶標抗原；(4)用第二抗體包被酶標板並封閉，加入抗克百威抗體與第二抗體反應並固定於酶標板上；(5)洗滌去除游離物，加入待測樣品及酶標抗原或克百威標樣及酶標抗原；(6)洗滌去除游離物，加入酶的底物和顯色劑，酶促顯色反應的強度與結合在抗體上的酶標抗原量成正比，與樣品或標樣中克百威的含量成反比，因而根據已知量的克百威標準曲線和待檢樣品的抑制率，再根據抑制率與克百威濃度之間的半對數關係作圖得到標準曲線，從而推算出待測克百威的濃度。
在上述檢測克百威的酶聯免疫分析方法中，所述半抗原是6-[〔(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯並呋喃基氧)羰基〕氨基]己酸或4-[〔(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯並呋喃基氧)羰基〕氨基]丁酸。該半抗原是以呋喃酚與光氣反應生成氯甲酸呋喃酚酯，再與胺基酸縮合合成的兩種半抗原。
在上述檢測克百威的酶聯免疫分析方法中，所述人工抗原是半抗原與載體蛋白共價偶聯合成的人工抗原。
在上述檢測克百威的酶聯免疫分析方法中，步驟(2)所述多克隆抗體是以人工抗原與弗氏佐劑混合乳化後免疫動物製備的；所述單克隆抗體是採用雜交瘤技術製備的；所述基因工程抗體是採用基因工程技術製備的。
在上述檢測克百威的酶聯免疫分析方法中，所述酶標抗原是採用混合酸酐法或活性酯法將半抗原與辣根過氧化物酶共價偶聯而成。
在上述檢測克百威的酶聯免疫分析方法中，所述酶標板是聚苯乙烯微孔板。
在上述檢測克百威的酶聯免疫分析方法中，所述封閉是採用1.0～5.0％脫脂奶粉進行封閉。
本發明的檢測克百威的酶聯免疫分析方法的測定原理是，首先將抗抗體(第二抗體)吸附於固體載體上，然後加入人工製備的抗克百威抗體，再加入酶標抗原與待測農藥，酶標抗原與待測農藥競爭抗克百威抗體，待測農藥含量高時，則與克百威抗體結合的酶標抗原就少，反之結合在克百威抗體的酶標抗原就多，反應後加入底物進行顯色加以測定，當克百威抗體量一定時，加入的待測農藥量越多，與克百威抗體結合酶標抗原就越少，發色反應減弱，抑制率增高，反之，則發色反應增強，抑制率減低，因而根據已知量的農藥的標準曲線和待檢樣品的抑制率，再根據抑制率與農藥濃度之間的半對數關係作圖即得標準曲線，並推算出待測農藥的濃度。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1、本發明採用第二抗體預包被酶標板，節約了克百威抗體的用量，而且克服了直接包被第一抗體不利於試劑盒長期保存的問題。2、本發明採用高特異性、高親合力的抗克百威抗體，提高了檢測的靈敏度、準確度和精密度。3、本發明的檢測方法能用於水、土壤、農產品等樣品中克百威殘留的檢測，操作簡單、快速，能同時檢測大批量的樣品，成本遠低於傳統克百威檢測方法，適用於農藥克百威殘留現場監控的痕量分析，具有重要的現實意義。
具體實施例方式
實施例11、緩衝液的配製 緩衝液(pH7.4PBST)KH2PO40.4g，Na2HPO4·12H2O5.8g，NaCl 16g，KCl 0.4g，Tween-200.05％1mL，加蒸餾水至2000mL。
2、封閉液的配製脫脂奶粉3.0g溶於100mL蒸餾水。
3、底物液的配製30％過氧化氫30μL溶於19mL的顯色液(pH5.0磷酸-檸檬酸緩衝液0.2M Na2HPO425.7mL，0.1M檸檬酸24.3mL，加蒸餾水50mL)中，4℃保存。
4、底物緩衝液的配製鄰苯二胺OPD80mg溶於10ml底物液中，4℃保存。
5、微孔板的包被第二抗體用pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩衝溶液(含2g碳酸鈉和4g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)稀釋成4ug/ml，在酶標板的每孔加100ul，4℃下包被過夜，傾去包被液，用PBST洗滌3次，拍幹，然後在每孔中加入200ul3.0％脫脂奶粉，放入37℃溫箱中1h後用PBST洗滌3次，拍幹後乾燥保存。
6、克百威標樣溶液的配製 準確稱取克百威標樣10mg，溶於0.1L緩衝液中，然後用緩衝液10倍梯度稀釋分別配製10mg/L、1mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L克百威溶液，另外緩衝液配製0mg/L對照樣，4℃保存。
7、克百威抗體溶液的製備用緩衝液適當稀釋抗體，4℃保存備用。
8、酶標抗原的製備利用混合酸酐法，使HRP標記半抗原6-[〔(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯並呋喃基氧)羰基〕氨基]己酸(BFNH)，具體方法為①稱取10mg的HRP(250nmol)於玻璃容器中，用0.5mL的去離子水溶解，加入2μL雙蒸的三正丁胺，485μL的DMF，輕輕混勻，冰浴保存。
②取半抗原，加入275μL DMF溶解，加入1.2摩爾比的三正丁胺，加入1.2摩爾比的氯甲酸異丁酯，活化5min。
③將活化產物加入到HRP溶液中，控制半抗原與HRP的摩爾比為2∶1，冰浴反應1h，不時搖蕩一下。
④將反應物過Sephadex G25柱(1cm×45cm)，用0.1M、pH7.0、含0.15M NaCl的PBS緩衝液洗脫，收集蛋白峰，分裝凍存備用。
取出一塊包被有第二抗體的酶標板，恢復到室溫後備用；加入100ul克百威抗體到各自孔中，37℃孵育0.5h，洗板，加入酶標抗原和一系列稀釋度的克百威標樣溶液進行競爭反應，37℃孵育1h，洗板，OPD37℃避光顯色15min，硫酸終止，酶標儀490nm測定結果。
以所獲樣品吸光值的平均值計算抑制率，抑制率的計算公式為 其中，Amax為不加農藥時的吸光值，Ax為農藥濃度為x時的吸光值，Amin為空白對照孔的吸光值。
以抑制率為縱坐標，克百威濃度(mg/L)的半對數為橫坐標繪製標準曲線，求出曲線方程，對應樣品的濃度可以根據方程求出。
權利要求
1.一種檢測克百威的酶聯免疫分析方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)合成半抗原和人工抗原；(2)將人工抗原免疫動物製備對克百威具特異性的多克隆抗體、單克隆抗體或基因工程抗體；(3)用辣根過氧化物酶標記半抗原製備酶標抗原；(4)用第二抗體包被酶標板並封閉，加入抗克百威抗體與第二抗體反應並固定於酶標板上；(5)洗滌去除游離物，加入待測樣品及酶標抗原或克百威標樣及酶標抗原；(6)洗滌去除游離物，加入酶的底物和顯色劑，酶促顯色反應的強度與結合在抗體上的酶標抗原量成正比，與樣品或標樣中克百威的含量成反比，因而根據已知量的克百威標準曲線和待檢樣品的抑制率，再根據抑制率與克百威濃度之間的半對數關係作圖得到標準曲線，從而推算出待測克百威的濃度。
2.根據權利要求1所述的檢測克百威的酶聯免疫分析方法，其特徵在於，所述半抗原是6-[〔(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯並呋喃基氧)羰基〕氨基]己酸或4-[〔(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯並呋喃基氧)羰基〕氨基]丁酸。
3.根據權利要求2所述的檢測克百威的酶聯免疫分析方法，具特徵在於，所述半抗原是以呋喃酚與光氣反應生成氯甲酸呋喃酚酯，再與胺基酸縮合合成的兩種半抗原。
4.根據權利要求1所述的檢測克百威的酶聯免疫分析方法，其特徵在於，所述人工抗原是半抗原與載體蛋白共價偶聯合成的人工抗原。
5.根據權利要求1所述的檢測克百威的酶聯免疫分析方法，其特徵在於，步驟(2)所述多克隆抗體是以人工抗原與弗氏佐劑混合乳化後免疫動物製備；所述單克隆抗體是採用雜交瘤技術製備；所述基因工程抗體是採用基因工程技術製備的。
6.根據權利要求1所述的檢測克百威的酶聯免疫分析方法，其特徵在於，所述酶標抗原是採用混合酸酐法或活性酯法將半抗原與辣根過氧化物酶共價偶聯而成。
7.根據權利要求1所述的檢測克百威的酶聯免疫分析方法，其特徵在於，所述酶標板是聚苯乙烯微孔板。
8.根據權利要求1所述的檢測克百威的酶聯免疫分析方法，其特徵在於，步驟(4)所述封閉是採用1.0～5.0％脫脂奶粉進行封閉。
全文摘要
本發明公開了一種檢測克百威的酶聯免疫分析方法，包括(1)合成半抗原和人工抗原；(2)製備對克百威具特異性的多克隆抗體、單克隆抗體或基因工程抗體；(3)製備酶標抗原；(4)用第二抗體包被酶標板並封閉，加入抗克百威抗體與第二抗體反應並固定於酶標板上；(5)洗滌去除游離物，加入待測樣品及酶標抗原或克百威標樣及酶標抗原；(6)洗滌去除游離物，加入酶的底物和顯色劑，酶促顯色反應的強度與結合在抗體上的酶標抗原量成正比，與樣品或標樣中克百威的含量成反比。本發明採用第二抗體預包被酶標板，節約了克百威抗體用量，可長期保存，提高了靈敏度、準確度和精密度；檢測操作簡單、快速、能同時檢測大批量的樣品。
文檔編號G01N33/547GK1987469SQ20061012259
公開日2007年6月27日 申請日期2006年9月30日 優先權日2006年9月30日
發明者孫遠明, 楊金易, 潘科, 王弘, 吳青, 雷紅濤, 肖治理, 諶國蓮, 沈玉棟 申請人:華南農業大學