酶聯免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的製備的製作方法
2023-04-25 22:42:46
專利名稱：：酶聯免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的製備的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物體外診斷試劑
技術領域：
。具體涉及一種酶聯免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的製備。
背景技術：
：1971年Engvall和Perlmann首次報導建立了酶聯免疫吸附檢測法(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)，由於ELISA具有快速、敏感、簡便、易於標準化等優點，已被廣泛應用於抗原、抗體、細胞因子以及生化物質等的檢測。該方法的基本原理是把抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫學活性。將抗體或抗原與酶通過化學方法交聯成酶結合物，酶結合物既有抗體或抗原的免疫學活性又有酶的催化活性。檢測時，先把受檢標本與固相載體上的抗原或抗體反應，洗滌，去掉未反應的物質，然後加入酶結合物進行反應，洗滌，再加入底物溶液及顯色劑反應，生成有色產物，最後加終止液終止反應。有色產物的吸光度(OD值)與受檢標本中的抗原或抗體量直接相關，從而可以根據OD值進行定性或定量分析。ELISA試劑的具體檢測方法很多，各種方法都不可缺少酶結合物。酶結合物在ELISA試劑中非常關鍵，其靈敏度、顯色背景和穩定性對試劑質量至關重要。高靈敏度、低顯色背景和良好的穩定性是高品質ELISA試劑所要達到的基本要求。酶結合物的靈敏度在很大程度上是由其自身的性質決定的，但酶結合物所用稀釋液(酶稀釋液)對其靈敏度有一定的影響，酶稀釋液的良好與否還對酶結合物的穩定性和顯色背景有非常明顯影響。因此，製備性能良好的酶稀釋液是ELISA試劑生產中的重要環節。常見的酶稀釋液一般使用緩衝系統(如PBS)、小牛血清(或牛血清白蛋白等)、防腐劑及表面活性劑等製備而成。但用該稀釋液製備的工作濃度酶結合物穩定性較差，有效期很短。為了保持酶結合物的穩定，傳統的酶聯免疫體外診斷試劑中的酶結合物是以濃縮液的形式儲存的，當使用時用酶稀釋液作一定倍數稀釋，現配現用，一般在28'C保存不超過一周。這樣，用戶使用比較麻煩，而且往往由於稀釋誤差造成實驗結果不準確。如何提高酶聯免疫體外診斷試劑中的酶結合物的穩定性，又能方便檢驗人員的使用，是眾多診斷試劑製造商長期以來努力解決的問題。
發明內容本發明所要解決的技術問題在於克服上述不足之處，通過改進酶聯免疫體外診斷試劑中的酶稀釋液來提高酶結合物的穩定性，同時降低顯色背景，提高檢測靈敏度。本發明通過改變酶聯免疫體外診斷試劑中的酶稀釋液的成分來提高酶結合物的穩定性，使酶結合物能夠以工作濃度提供給用戶，方便用戶使用，同時降低顯色背景，提高檢測靈敏度。本發明提供了一種酶聯免疫體外診斷試劑中酶結合物的製備方法。本發明改變了傳統酶稀釋液的組成成分，選擇了一種合適的酶保護劑一苦杏仁酸，加入到酶稀釋液中，顯著提高了酶結合物的穩定性。將原來常用的防腐劑硫柳汞鈉換成了Proclin300(或者Proclin950)，後者的防腐性能明顯優於前者，降低了酶稀釋液被微生物汙染的風險，可以防止酶結合物因微生物汙染而導致顯色異常降低或背景異常升高。將原來的表面活性劑吐溫20(Tween20)換成了曲拉通X-100(TritonX-100)，明顯降低了顯色背景。在酶稀釋液中加入了小牛血清，小牛血清是良好的蛋白保護劑，同時也減少了非特異性吸附。加入酚紅溶液，用以指示酶稀釋液的PH值在正常範圍。製備酶結合物時，將濃縮酶結合物以所需的比例(如1:1001:5000)加入到上述酶稀釋液中即可。新配方的酶稀釋液顯著提高了酶結合物的穩定性，酶結合物能夠以工作濃度提供給用戶，在試劑盒保存條件下(28°C)—年內保持穩定。用戶可以直接使用不必臨時稀釋，同時降低了顯色背景，提高了檢測靈敏度。本發明的酶聯免疫體外診斷試劑中酶結合物的製備方法包括下列步(1)配製0.05-0.2MPBS或0.01-0.2MTris-HCl緩衝液，pH值為6.57.4;(2)在該緩衝系統中加入苦杏仁酸，終濃度為0.2g/L~1.2g/L，攪拌，使充分溶解；(3)加入Proclin300或Proclin950，終濃度為0.2g/L~1.2g/L，攪拌，使充分溶解；(4)加入TritonX-100，終濃度為0.1ml/L~1.0ml/L，攪拌，使充分(5)加入酚紅1%無水乙醇溶液，終濃度為2ml/L10ml/L,攪拌，使充分溶解；(6)加入小牛血清，終濃度為200ml/L~400mlg/L，攪拌，使充分溶解；(7)最後用4MNaOH或4MHC1調pH值為6.57.4得到酶稀釋液；(8)將濃縮酶結合物以所需的比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻即可。上述酶結合物為辣根過氧化物酶(HRP)或鹼性磷酸酶(AP)與抗原或抗體通過化學交聯而成的複合物。本發明的有益效果(1)提高了酶結合物的穩定性，在28TM呆存12個月保持穩定。(2)酶結合物能夠以工作濃度提供給用戶，用戶可以直接使用不必臨時稀釋，方便操作、減少差錯。(3)降低了顯色背景，提高了檢測靈敏度。本發明酶結合物與傳統酶結合物比較數據以雙抗體夾心ELISA法檢測HBsAg為例，在已包被抗體的微孔板中加入經系列稀釋的抗原，按照常規反應過程進行試驗，分別對比傳統酶結合物和本發明酶結合物，加顯色劑顯色，用2M硫酸溶液終止反應後，在酶標儀上比色，結果如下tableseeoriginaldocumentpage6實施例1:配製1L抗HBs-HRP酶結合物溶液(1)先加入約500ml蒸餾水，再依次加入下列試劑，待前一種溶解後再加入後一種；NaC18g;Na2HP0412H202.9g;KH2PO40.2g;KC10.2g;苦杏仁酸，0.3g;Proclin300，0.5ml;TritonX-100，0.3ml;酚紅(1%無水乙醇溶液)，5ml;小牛血清，200ml;待充分溶解後補足蒸餾水至1L，用4MNaOH或4MHCl調PH值為7.2。(2)將濃縮酶結合物以1:1000比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻。實施例2:用抗HBs-HRP酶結合物溶液(1:1000)檢測血清或血漿標本中的HBsAg。(1)在已包被抗HBs的微孔板中依次加入標本50ul，同時做兩孔陰性對照、一孔陽性對照、一孔空白對照，然後每孔(除空白對照孔外)加入本發明實施例1製備的抗HBs-HRP酶結合物溶液50ul，置37'C保溫30分鐘。(2)棄去孔內液體，用洗滌液洗板5次。(3)各孔加底物溶液50ul，顯色劑50ul，置37'C保溫15分鐘。(4)各孔加終止液50ul，終止反應。(5)將反應板置酶標比色計450nm波長處用空白孔校零，讀取各孔OD值。(6)計算，CutOff值-陰性對照平均OD值X2.1，陰性對照平均OD值小於0.05按0.05計算，大於等於0.05按實際OD值計算。(7)結果判斷標本OD值大於或等於CutOff值為陽性，小於CutOff值為陰性。權利要求1、一種酶聯免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的製備方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)配製0.05-0.2MPBS或0.01-0.2MTris-HCl緩衝液，pH值為6.5～7.4；(2)在該緩衝系統中加入苦杏仁酸，終濃度為0.2g/L1.2g/L，攪拌，使充分溶解；(3)加入Proclin300或Proclin950，終濃度為0.2g/L～1.2g/L，攪拌，使充分溶解；(4)加入TritonX-100，終濃度為0.1ml/L～1.0ml/L，攪拌，使充分溶解；(5)加入酚紅1％無水乙醇溶液，終濃度為2ml/L～10ml/L，攪拌，使充分溶解；(6)加入小牛血清，終濃度為200ml/L～400mlg/L，攪拌，使充分溶解；(7)最後用4MNaOH或4MHCl調pH值為6.5～7.4得到酶稀釋液；(8)將濃縮酶結合物以所需的比例加入到上述酶稀釋液中充分混勻即可。2、如權利要求1一種酶聯免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的製備方法，其特徵在於其中所述的酶結合物可以是辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶與抗原或抗體通過化學交聯而成的複合物。全文摘要本發明提供了一種酶聯免疫體外診斷試劑中酶結合物溶液的製備方法。本發明改進了酶稀釋液的配製成分，在酶稀釋液中加入了苦杏仁酸作為酶保護劑，改變了防腐劑及表面活性劑，將濃縮酶結合物按所需濃度加入到上述酶稀釋液中製備成酶結合物溶液。有效地增加了酶結合物的穩定性，同時也降低了反應背景，提高了檢測的靈敏度。使酶結合物可以稀釋成工作液濃度提供給用戶，既方便了檢測人員的使用，又提高了檢測結果的準確性。文檔編號G01N33/535GK101101295SQ20061002862公開日2008年1月9日申請日期2006年7月5日優先權日2006年7月5日發明者周興華申請人:上海華泰生物工程實業有限公司