用於保存組織和器官的水溶液的製作方法

2023-04-25 23:52:31

專利名稱：用於保存組織和器官的水溶液的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於保存組織和器官、特別是邊緣器官的水溶液及其應用，還涉及一 種用於保存組織和器官的方法。
背景技術：
對於慢性病末期的病人來說，器官移植是首選的治療方法。儘管移植技術在改良， 在臨床實踐中，當缺血時和隨後再灌注中發生的移植物損傷仍然是一個未解決的問題。在從供者切除後和移植給受者之前，器官和組織都經過固有的缺血時期。因此，用 於保存器官和組織的液體溶液必須滿足一些條件清除供者的血液，使器官快速降溫，且確 保有效預防和防止由缺血引起的損傷。在短期缺血時，靜態低溫保存是保存器官的一種有效方法。然而，長時間的缺血階 段與肝移植中的原發性移植物無效和腎移植中的移植物功能異常有關。此外，為了缺血時 間延長的需要，有限的供者數目和隨後等待器官移植的名單數目的增加導致了邊緣器官的 使用，其對持續性缺血引起的損傷的耐受力很差。在肝移植的例子中，邊緣器官的使用，如 脂肪肝的使用，同非脂肪肝相比，其與移植後移植物的原發性無效和功能異常的風險的增 加有關。另外，一些脂肪肝被認為不適合移植，加劇了用於移植的器官的短缺。眾所周知， 在移植期間，邊緣器官表現的大部分損傷與低溫保存的時間相關。這些觀察現象表明必須 優化器官保存。因此，器官保存的主要目的是試圖延長器官對缺血的耐受力。有證據表明保存液的組分對於保存在長缺血時間下的器官質量是一個關鍵因素。 威斯康星大學(UW)保存液被認為是肝保存的標準溶液，因為它已證明其自身對於減少冷缺 血引起的損傷是有效的並延長了貯存時限。這種保存液包括用於延長器官保存的不同的組 分，包括防止細胞水腫的膠質羥乙基澱粉，作為再灌注時ATP來源的腺嘌呤核苷，具有抗氧 化作用的別嘌呤醇和穀胱甘肽，及細胞膜不滲透試劑如乳糖酸和棉子糖。然而，這種保存 液，UW，在療效上有局限性，因為當冷缺血時間被延長(16 h-24 h)時，在移植的器官中觀察 到不可逆損傷。他克莫司(TCR)是具有有效抑制免疫活性、抗菌活性和其他藥理活性的大環內 酯類化合物，並且對於預防器官或組織的移植排斥反應、自身免疫疾病和感染病都很重 要。已知當其加入到保存液中時，可以防範再灌注損傷。在文獻(K. G. Rajesh et al., "Mitochondrial Permeability transition-pore inhibition enhances functional recovery after long-time hypothermic heart preservation〃， Transplantation, 2003, vol. 76 (9)，pp. 1314-20)中已經描述了含有他克莫司的UW保存液。對於其保存 心臟的作用進行檢測，然而，得出的結論是他克莫司在保存時沒有任何作用。卡維地洛(CVD)是一種親脂性的非選擇的腎上腺素阻斷劑，其主要通過選 擇的α 受體阻斷劑起到舒張血管的作用並具有強抗氧化劑作用。卡維地洛抑制脂質過 氧化作用的能力高於其他測試的腎上腺素阻斷劑，這可以解釋其在缺血/灌注模型 中的優越的保護作用。儘管在文獻中已經報導了在保存液中添加抗氧化劑，例如卡維地
3洛(#JAL B. Yard et al. , "Prevention of cold-preservation injury of cultured endothelial cells by catecholamines andrelated compounds〃， American Journal of transplantation, 2004, vol. 4，pp. 22-30)，但是沒有公開具體的包含卡維地洛的保存液。一項近期的研究表明向UW保存液中加入曲美他嗪(TMZ)能夠提高該標準保存液 保護非脂肪肝和尤其是脂肪肝承受更長時間的缺血過程的能力(參見I. Ben Mosbah et al. 〃 Trimetazidine Is it a promising drug for use in steatotic grafts ", World J Gastroenterol, 2006，vol. 12(6)，pp. 908—914)。然而一些UW溶液的性質，例如高鉀濃度(要求在向受體移植再灌注之前衝洗器官) 和作為腫脹支持的羥乙基澱粉(HES)的存在(其用於負責紅血細胞的聚集)都不利於器官保 存。近期的研究顯示在改良的UW保存液(稱為IGL-1)中可以更好的保存脂肪肝和非脂肪 肝的肝移植物，所述改良的UW保存液的特徵在於，K+和Na+濃度倒置，並用聚乙二醇(PEG) 代替原始 UW 溶液中的 HES (參見 I. Ben Mosbah et al. , "Preservation of steatotic livers in IGL-I solution〃， Liver Transp1, 2006, vol. 12 (8)， pp. 1215-23)。另 一方面，儘管IGL-I溶液提供了一些改進，但是缺血-再灌注(I/R)的有害影響仍然未得到 解決。仍然需要尋找允許延長器官對於缺血耐受性並將待移植的邊緣器官的固有風險 最小化的保存液。

發明內容
儘管現有技術中包含他克莫司、卡維地洛或曲美他嗪的保存液已知或已經被人提 出，但是還沒有人提出包括這三種活性藥物成分的組合物的用於保存組織和器官的水溶 液。本發明人驚奇地發現含有他克莫司、卡維地洛和曲美他嗪組合物的保存液可協同地提 高經長時間缺血的組織和器官的保存能力。特別地，該協同效用在邊緣器官，例如脂肪肝中 尤為明顯，這使得該溶液特別具有優勢，因為它能改善可用於移植的但缺乏術後結果的邊 緣器官的初始條件，並可以增加目前不用於移植的器官的用途，並因此增加可供移植器官 的數量。因此，本發明的一方面涉及一種用於保存組織和器官的水保存液，其包括有效量 的卡維地洛、有效量的他克莫司、有效量的曲美他嗪。本發明的水保存液允許在一定量的時間保存組織或器官，其保存時間比其他已知 的保存液所能達到的更長。本發明保存液的另一個優點在於其允許延長組織或器官保持功 能正常的時間，並且相對於其他保存液達到的效果，本發明的保存液對於移植來說是有用 的。本發明的第二方面涉及本發明的用於保存組織和器官的水溶液的應用。該溶液可 應用於包括人類的哺乳動物的組織和器官。所述組織的實例為靜脈和動脈。構成本發明的部分還有一種用於保存組織和器官的方法，其包括將所述組織或器 官在2-10°C下保存在本發明的水溶液中。通過將組織或器官侵沒在本發明的水保存液中， 防止與組織或器官移植有關的再灌注損傷和移植排斥。對於此處使用的短語活性成分「的有效濃度」是指用於保存組織和器官的活性成分的量。對本領域技術人員顯而易見的是，此處給出的任何範圍值在不失去其追求的效果 下，可以延伸或改變。因此，給出的範圍，例如濃度等等，除非特別聲明，否則應該被認為是 近似值。在通篇說明書和權利要求中，詞語「包括」和該詞語的變形體並不旨在排除其他技 術特徵、添加劑、成分或步驟。


圖(1-10)示出了向一些已知的保存液中加入他克莫司(TCR)、卡維地洛(CVD)和 曲美他嗪(TMZ)的效果，和當脂肪(S)肝和非脂肪(NS)肝承受長期的缺血過程時，實施例1 (Pl)的保存液的效果。在圖中，％P代表保護百分比。圖1示出了當在缺血階段末期(Omin)評估ALT值時，UW保存液的保護百分比。
圖2示出了當在再灌注末期(120min)評估ALT值時，Uff保存液的保護百分比。圖3示出了當在再灌注末期(120min)評估膽汁產生時，UW保存液的保護百分比。圖4示出了當在再灌注期間評估膽汁中BSP肝清除百分比時，UW保存液的保護百 分比。圖5示出了當在再灌注末期(120min)評估ATP水平時的UW保存液的保護百分 比。圖6示出了當在缺血階段末期(Omin)評估ALT值時的IGL-I保存液的保護百分 比。圖7示出了當在再灌注末期(120 min)評估ALT值時的IGL-I保存液的保護百分 比。圖8示出了當在再灌注末期(120min)評估膽汁產生時，IGL-I保存液的保護百分 比。圖9示出了在再灌注期間評估膽汁中的BSP肝清除百分比時，IGL-I保存液的保 護的百分比。圖10示出了當在再灌注末期(120min)評估ATP水平時，IGL-I保存液的保護百 分比。發明詳述。本發明的水溶液適用於從供者切除的組織或器官，同時也適用於這些器官的儲 存、移植和最後移入受體的階段。它可用於短時間和基本上長時間的缺血階段。在本發明的水溶液的一優選的實施例中，卡維地洛的濃度為5 10 mM，他克莫司的 濃度為5 10 mM,曲美他嗪的濃度為0. ΟΓ Ο mM.
為了避免細胞和組織水腫的形成，本發明的水溶液包括具有分子量大約為15，000之 上的聚乙二醇(PEG)，其保障了腫脹壓力。優選使用的PEG的分子量為35，000，更優選，PEG 為非線性純化PEG，也就是說由低分子量PEG合成的PEG。因此，在另一優選實施例中，本發明的水溶液pH值為6. 5 8，克分子滲透壓濃度為 290^320 mmol/kg,其進一步包括分子量在15000之上，濃度為0. 0Γ5 mM的PEG、濃度為 20 40 mM的棉子糖、濃度為廣10 mM的MgS04、濃度為10 40 mM的H2POf、濃度為30 50 mM的鉀離子、濃度為11(T160 mM的鈉離子和濃度為7(Tl40 mM的乳糖酸。在本發明的水溶液的還一優選的實施例中，其pH值為7. 4並且克分子滲透壓濃度 為320 mmol/kg,並具有分子量在15000之上，濃度為0. 03mM的PEG、濃度為30 mM的棉子 糖、濃度為5mM的MgSO4、濃度為25 mM的&PCV、濃度為40mM的鉀離子、濃度為120 mM的 鈉離子和濃度為100 mM的乳糖酸、濃度為5 mM的他克莫司、濃度為10 mM的卡維地洛和濃 度為1 mM的曲美他嗪。優選，PEG的分子量大約為35000。已知不被用於移植的器官的主要原因脂肪變性。本發明保存液的上述優選實施例 提高脂肪肝對與肝移植有關的缺血-再灌注損傷的耐受性。這一事實允許脂肪肝移植物的 移植後功能得到改善，增加可用於移植的合適的器官的數量。本發明特別優選的水溶液由以下成分組成
-分子量大約為35000的濃度為0. 03mM的聚乙二醇， -濃度為30 mM的棉子糖， -濃度為5 mM的MgSO4, -濃度為25 mM的H2PO4-， -濃度為40 mM的鉀離子， -濃度為120 mM的鈉離子， -濃度為100 mM的乳酸糖， -濃度為5 mM的他克莫司， -濃度為10 mM的卡維地洛，和 -濃度為1 mM的曲美他嗪，
並且PH值為7. 4，克分子滲透壓濃度為320 mmol/kg。更優選，該保存液進一步包括濃度為16 g/L的地塞米松和濃度為200. 000 U/L的
青毒素。本發明保存液的這兩種優選的實施例不包含某些藥物，例如GSH、HES、胰島素、別 嘌呤醇和腺嘌呤核苷，這些藥物包含在其他已知的保存液中(例如UW和/或IGL-I保存液) 並且已經證明其對保護的器官基本無效甚至有毒害作用。對於這些優選的保存液，觀察到 一個特別有關的協同作用，與其他保存液中獲得的結果相比，它們對脂肪肝和非脂肪肝都 提供保護。如上所述，本發明的另一方面涉及此處描述並要求保護的用於保存組織和器官的 水溶液的應用。在一優選實施例中，器官為腹部器官，例如肝臟、腎臟和胰臟。優選，腹部器 官是一邊緣器官，更優選是一脂肪肝。本發明的保存液適用於靜態低溫保存並且在下使用，優選:T5°C，更優選 在4°C下使用。 此外，本發明涵蓋了上述所有特殊和優選組的組合。 通過來自說明書的一部分和來自本發明的實踐的另一部分，本發明其他的目的、 優點及特徵對於本領域技術人員將變得顯而易見。通過解釋說明提供以下的實施例和附 圖，其目的並不是限制本發明。具體實施例實施例1 水保存液的製備
一種組分如表1所示的水溶液，其根據下文公開的過程進行製備。輔目白句，優■細寺fe仔勒頁鞭力口麵服isi寸東ι
權利要求
1.一種用於保存組織和器官的水溶液，包括有效量的卡維地洛、有效量的他克莫司和 有效量的曲美他嗪。
2.一種根據權利要求1所述的溶液，其具有濃度為5 10mM的卡維地洛，濃度為5 10mM 的他克莫司和濃度為0. OflOmM的曲美他嗪。
3.一種根據權利要求廣2中任一項所述的溶液，其pH值為6. 5、並且克分子滲透壓濃 度為^(T320mmOl/kg，其進一步包括-具有超過15000的分子量的聚乙二醇，其濃度為0. 0Γ5 mM, -濃度為2(T40 mM的棉子糖， -濃度為Γ10 mM的MgSO4, -濃度為10 40 mM的H2PO4-， -濃度為3(T50 mM的鉀離子， -濃度為110 160 mM的鈉離子，和 -濃度為70 140 mM的乳糖酸。
4.根據權利要求3所述的溶液，其中pH是7.4，克分子滲透壓濃度是320mmol/kg，聚 乙二醇的濃度為0. 03 mM，棉子糖的濃度為30 mM, MgSO4的濃度為5 mM, H2P04"的濃度為 25 mM，鉀離子的濃度為40 mM，鈉離子的濃度為120福，乳糖酸濃度為100 mM，他克莫司的 濃度為5 mM，卡維地洛的濃度為10mM，以及曲美他嗪的濃度為1 mM。
5.根據權利要求4所述的溶液，包括-分子量大約為35000的濃度為0. 03mM的聚乙二醇， -濃度為30 mM的棉子糖， -濃度為5 mM的MgSO4, -濃度為25 mM的H2PO4-， -濃度為40 mM的鉀離子， -濃度為120 mM的鈉離子， -濃度為100 mM的乳酸糖， -濃度為5 mM的他克莫司， -濃度為10 mM的卡維地洛，和 -濃度為1 mM的曲美他嗪。
6.根據權利要求5所述的溶液，進一步包括濃度為16g/L的地塞米松和濃度為 200, 000 U/L的青黴素。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的溶液用於保存組織或器官的溶液的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其中所述器官為腹部器官。
9.根據權利要求8所述的應用，其中所述腹部器官為邊緣器官。
10.一種用於保存組織和器官的方法，其包括使所述組織或器官在2 1(TC下維持在根 據權利要求1-6中任一項所述的水保存溶液中。
全文摘要
本發明提供了一種改良的用於保存組織和器官的水溶液，其包括卡維地洛、他克莫司和曲美他嗪。在該保存溶液中可以觀察到協同效應，這對於邊緣器官，例如脂肪肝尤其有效。
文檔編號A01N1/02GK102098911SQ200980128094
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月18日 優先權日2008年5月19日
發明者卡門·佩拉爾塔·烏羅斯, 拉蒙·巴特龍斯·巴赫, 愛絲摩爾·本·穆斯巴赫, 霍安·羅塞略-卡塔法烏 申請人:八月皮埃蘇涅爾生物醫學研究院, 巴塞隆納大學, 高等科學研究委員會