一種在自動化核酸提取工作站上進行基因組提取的試劑盒及方法

2023-04-25 16:02:51 2

專利名稱：一種在自動化核酸提取工作站上進行基因組提取的試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是一種可以在自動化核酸提取工作站有 效進行基因組DNA提取的試劑盒及方法。
技術背景從生物組織或細胞中進行核酸提取現在是一項非常成熟的技術，其技術 含量較低，多是重複性工作，而利用工作站進行核酸提取是一類新型技術， 它是利用經過處理的磁珠可以在一定的溶液環境中有效的進行DNA吸附的原 理，應用工作站進行基因組的DNA提取工作，其特點是工作效率高，可以同 時進行96通道的提取工作，並且大大提高了提取工作的可重複性。目前在 血站、農業和醫院檢驗中心等行業已經廣泛採用利用工作站法提取基因組， 市場容量較大，但是目甜只有二種CTAB和SBS法，可以配合自動化核酸提 取工作站進行核酸提取的試劑，這些試劑都存在著通用性不好，操作步驟繁 雜，價格較高等缺陷。本發明中提到的試劑具有樣品適用性廣，易於操作， 整個過程不需要進行離心處理，有助於後續操作的進行等優點。 發明內容本發明的目的在於提供一種在自動化核酸提取工作站上進行基因組提取的 試劑盒及方法，該試劑具有樣品適用性廣，易於操作，整個過程不需要進行離心 處理，有助於後續操作的進行等優點。為實現上述目的，本實用新型採取以下設計方案這種在自動化核酸提取工作站上進行基因組提取的試劑盒，它包括以下組份(1) 、裂解緩衝液它含有異硫腈酸胍(4-8%);鹽酸胍(4-8%); Tr is Cl (pH6. 4) 10隱ol/L; TritonX-100(0. 1%-0. 5%); Tween 20 (0. 1-0. 3%); 十二脘基肌酸 鈉(l-3%);(2) 、胍鹽緩衝液它含有異硫腈酸胍(4-8%)、鹽酸胍(4-8%);(3) 、磁珠；(4) 、洗脫液含Tris 100mmol/L (pH=8)、 EDTA10,1/L (pH=8)。 本試劑盒中，％均表示重量百分比。一種利用權利要求1所述的試劑盒進行基因組提取的方法，它包括以下步3驟(1) 、利用裂解液對植物、動物或其他生物組織或細胞進行裂解；(2) 、利用試劑提取組織或細胞的基因(組)DNA; (3)、對所提取的基因組DNA進行PCR擴增，檢驗。所述的進行裂解的生物組織或細胞可以為血液樣品，它包括血濾紙、全血、 血清。本發明所述的試劑盒可用於手工方法提取基因組。


圖1 Yb8引物擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳2 D13S317引物擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳1中，1、為陽性對照(K562 genomic DNA) ， 2、為血濾紙樣品，3、為陰 性對照(水)，4、為參照物DL2000(2000， 1000,750,500， 250,100)。圖2中1、為陽性對照(K562 genomic DNA) ， 2、為血濾紙樣品，3、為陰 性對照(水)，4、為參照物DL2000(2000， 1000， 750， 500, 250,100)。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一歩闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發 明，而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法， 通常按照常規條件如Sambrook等人.分子克隆實驗室手冊(New York: cold spring Harbor Laboratory) ， Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠 商所建議的條件。具體實施例1:1) 血濾紙直接水洗法實驗歩驟(建庫) 磁珠法實驗歩驟以血濾紙為樣本，說明實施操作.-將樣品處理為(0.5cmX0.5cm)的大小，分別加入樣品板的孔內，並另備處理 板和DNA搜集板各一塊。1 )樣品板加入90 y L裂解液A(裂解液為含有異硫腈酸胍(6y。)；鹽酸胍(6%); Tris* Cl(pH6. 4) 10,1/L; TritonX-100 (0. 3%); Tween 20 (0. 2%); 十二脘基肌酸鈉(1%);2) 樣品板置68度加熱器上加熱30分鐘3) 樣品板補水40uL， 600rpm振蕩20秒4) 樣品板置100度加熱器上加熱10分鐘5) 樣品板補水40u L, 600rpm振蕩20秒6) 樣品板置100度加熱器上加熱10分鐘7) 樣品板補水40 u L， 600rpm振蕩20秒8) 樣品板置100度加熱器上加熱10分鐘9) 樣品板加入lOOy L胍鹽緩衝液，600rpm振蕩20秒，重複一次；10) 加入2倍體積胍鹽緩衝液(異硫腈酸胍4%、鹽酸胍4%)稀釋混合磁 珠，並在處理板上每孔加21uL磁珠懸液；11) 由樣品板轉移約130 y L的裂解液到DNA處理板；12) 處理板760rpm振蕩30秒，每10秒換向一次。靜置2分鐘，再次振蕩。 靜置2分鐘，第三次振蕩；13) 處理板轉移到磁鐵上，靜置30秒後吸出裂解液廢棄；14) 處理板加入90uL 70%乙醇，800rpm振蕩30秒，每10秒換向一次。15) 處理板轉移到磁鐵上，靜置20秒後吸出裂解液廢棄16) 處理板加入90uL 70%乙醇，800rpm振蕩30秒，每10秒換向一次17) 處理板轉移到磁鐵上，靜置20秒後吸出裂解液廢棄，處理板靜置5分鐘；18) 處理板中加入75u L水，1200rpm振蕩30秒，每10秒換向一次；19) 處理板置68度加熱器上加熱10分鐘；20) 處理板1000rpm振蕩30秒，每10秒換向一次；21) 處理板置磁鐵上，轉移DNA搜集板；22) 由處理板轉移30yL DNA溶液到DNA搜集板；23) 完成DNA提取實驗所述的磁珠購自江蘇百維信公司(用於提取D、'A的磁珠) 所提取的DNA進行常規PCR，螢光定量PCR， Genotyping, STR等多種後續 處理操作或任何兩種以上處理組合。以4u 1 基因組DNA為模板進行PCR/Real-time PCR/STR檢測。處理後PCR歩驟Primers D13S317D13S3i7-5: ACAGAAGTCT(;GGATGTGGAD13S317-3:GCCCAAAAAGACAGACAGAAGenbankNo.:G09017PrimersYb8GenbankNo.:AF015169.Yb8-5:5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG TYb8-3:5，-TCT GTC GCC CAG GCC GGA CT-3，realtimePCRsystem:10X buffer 2y 1Mg」'(3mM) 1. 76u 1必TP(2. 5mM/each) 2yl primers 0. 25u M/eachSYBR (final densityO. 01%), add ddftO to total 20y 1 volume. 94°C, 5min;94°C, 15s， 59。C'15s， 72。C30s, 80。C,6s' 30cycle; 72 °C, 3min;70-95°C,0. 3。C，6s，melt curve. 實驗結果見圖1和圖2 。序列表< 110〉北京東勝創新生物科技有限公司 —種在S動化核酸提取工作站上進行基W組提取的試劑盒及方法 4 Patentln version 3.1 1<211〉 20<212〉 DNA<213〉 人丁.合成<400〉 1acagaagtct gggatgtgga 20<210〉 2<211〉 20 隨<213〉 人T.合成<400〉 2gcccaaaaag acagacagaa 20 3<211〉 22<212〉 DNA<213〉 人丁.合成〈400〉 3cgaggcgggt ggatcatgag gt 22<210〉 4<211〉 20 DNA<213〉 人丁.合成 4tctgtcgccc aggccggact 20
權利要求
1、一種在自動化核酸提取工作站上進行基因組提取的試劑盒，其特徵在於它包括以下組份(1)、裂解緩衝液它含有異硫腈酸胍(4-8％)；鹽酸胍(4-8％)；Tris·Cl(pH6.4)10mmol/L；TritonX-100(0.1％-0.5％)；Tween 20(0.1-0.3％)； 十二脘基肌酸鈉(1-3％)；(2)、胍鹽緩衝液它含有異硫腈酸胍(4-8％)、鹽酸胍(4-8％)；(3)、磁珠；(4)、洗脫液含Tris 100mmol/L(pH＝8)、EDTA10mmol/L(pH＝8)。
2、 一種利用權利要求1所述的試劑盒進行基因組提取的方法，其特徵在於 它包括以下歩驟(1) 、利用裂解液對植物、動物或其他生物組織或細胞進行裂解；(2) 、利用試劑提取組織或細胞的基因(組)DNA;(3)、對所提取的基因組DNA進行PCR擴增，檢驗。
3、根據權利要求2所述的進行基因組提取的方法，其特徵在於將用裂解 液處理生物組織或細胞加入磁珠進行吸附，然後加入洗滌液，最後以洗脫液回收 DNA，完成DNA的提取。
4、根據權利要求2所述的進行基因組提取的方法，該方法包括如下歩驟(1) 利用變性溶液即裂解緩衝液處理生物樣品；(2) 向歩驟(l)處理後的樣品中加入核酸提取緩衝液和裂解液進行裂解，然 後加入磁珠進行DNA吸附；(3) 向上述歩驟(2)的樣品中加入洗液處理，除去雜質；(4) 重複上述歩驟(3)兩次，加入洗脫液進行處理，並得到上層水相溶液， 此溶液中含有DNA，它用來後續PCR操作。
5、 根據權利要求2所述的進行基因組提取的方法，其特徵在於所述的進行裂解的生物組織或細胞為血液樣品，它包括血濾紙、全血、血清。
6、 根據利用權利要求1所述的試劑盒以手工方法提取基因組。
全文摘要
一種在自動化核酸提取工作站上進行基因組提取的試劑盒及方法，試劑盒包括裂解緩衝液；胍鹽緩衝液；磁珠；洗脫液。方法包括以裂解液對生物組織或細胞進行裂解，用試劑盒中的磁珠進行DNA的吸附，並利用洗滌液去除雜質，最後以洗脫液回收DNA，完成DNA的提取。所提取的DNA可以進行常規PCR，螢光定量PCR，Genotyping，STR等多種後續處理操作。本發明的優點為所用的試劑具有樣品適用性廣，易於操作，整個處理過程不需要進行離心處理，有助於後續操作的進行。可以配合自動化核酸提取工作站進行有效的DNA提取，並且可以用於手工操作提取基因。
文檔編號C12Q1/68GK101323852SQ20071011880
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月11日 優先權日2007年6月11日
發明者申躍華, 聶尚海, 濤 葛 申請人:北京東勝創新生物科技有限公司